Etude de l’internalisation des particules MSNs-Rh par microscopie confocale159

FIGURE 3.37 : Cytotoxicit´e des MSNs-Rh ´evalu´ee sur des cellules canc´ereuses de cˆolon humain SW480. La r´ev´elation est effectu´ee directement apr`es 72 heures de traitement ou apr`es 3 jours de post-incubation suppl´ementaires.

Les particules MSNs-Rh n’induisent aucun effet cytotoxique, et ce, quels que soient le temps de traitement et les concentrations utilis´ees. Les viabilit´es cellulaires sont toutes proches de 100%. Ces nanoparticules peuvent donc ˆetre utilis´ees afin d’´etudier l’internalisation des MSNs dans les cellules.

3.4.3 Etude de l’internalisation des particules MSNs-Rh par

micro-scopie confocale

Un suivi de l’internalisation des nanoparticules en fonction du temps de traitement a ´et´e r´ealis´e par microscopie confocale. Ces exp´eriences ont ´et´e men´ees en collaboration avec M. Michel Moussus du Laboratoire des Technologies de la Micro´electronique (LTM) du CEA de Grenoble.

3.4. Etude de l’internalisation des MSNs dans des cellules en culture

3.4.3.1 Protocole exp´erimental et pr´esentation des r´esultats

Les tests d’internalisation sont r´ealis´es sur la mˆeme lign´ee de cellules canc´ereuses de cˆolon humain SW480 et dans les mˆemes conditions de culture que celles utilis´ees pour les tests de cytotoxicit´e.

Les cellules sont implant´ees dans des plaques 4 puits au fond desquels des lames de verre y sont d´epos´ees. Le taux d’implantation est de 80 000 cellules/puits, ce qui correspond `a un ´etat de semi-confluence. Deux jours apr`es l’implantation, les cellules sont trait´ees par les particules MSNs-Rh `a une concentration de 50 µg/mL (dispers´ees dans du NaCl `a 10-3M) et pour diff´erents temps de traitement : 30 min, 2h, 4h, 8h, 20h et 32h. A la fin de chaque temps d’incubation, les cellules sont lav´ees plusieurs fois avec du PBS contenant les ions Ca²⁺ et Mg²⁺ (PBS+Ca/Mg) puis fix´ees avec une solution de paraformald´ehyde `a 4% (m/v). Ensuite, les cellules sont abondamment lav´ees avec du (PBS+Ca/Mg) et conserv´ees `a 4◦C jusqu’`a l’analyse finale.

Au moment de l’analyse, certains organites de la cellule sont marqu´es par des fluorophores. Les cellules sont tout d’abord permabilis´ees avec du Triton X-100 (0,25% dans PBS) pendant 15 minutes, puis elles sont incub´ees avec une solution de Phallo¨ıdine `a 10 µg/mL (PBS, 5% BSA, 0,1% Triton X-100) pendant 20 minutes, qui permet de visualiser les filaments d’actine. Les cellules sont par la suite lav´ees trois fois avec une solution de Triton X-100 (0,1% dans PBS). Ensuite, les cellules sont incub´ees pendant 5 minutes en pr´esence d’une solution de Hoechst `a 0,5 µg/mL (pr´epar´ees dans du PBS), qui permet de visualiser les noyaux cellulaires. Les lames de verre sont ´egout´ees et plac´ees sans rin¸cage pr´ealable sur une autre lame de verre et sont observ´ees avec un microscope confocal TCS-SP2 (Leica) ´equip´e d’un objectif ×63/1.4 [481, 482].

Les r´esultats sont pr´esent´es pour trois plans focaux diff´erents (Figure 3.38) : z1, plan focal entre le noyau et la lame de verre sur laquelle les cellules sont implant´ees, z2, plan focal au niveau du noyau, z3, plan focal entre le noyau et la lame de verre du microscope. Le marquage des filaments d’actine n’´etant pas concluant, ils ne seront pas pr´esent´es.

z

1

z

2

z

3

noyau cellulaire lame de «croissance» des cellules lame de verre du microscope

FIGURE 3.38 : Repr´esentation sch´ematique du montage utilis´e pour les observations en microscopie confocale et des consid´erations faites pour l’interpr´etation des r´esultats.

3.4.3.2 R´esultats et discussion

Les r´esultats de la microscopie confocale pour les diff´erents temps de traitement ´etudi´es et pour les plans focaux z1, z2 et z3 sont indiqu´es sur la Figure 3.39.

4 h 2 h 30’ z₁ z₂ z₃ 32 h 20 h 8 h 6 µm 6 µm 6 µm 6 µm 6 µm 6 µm

FIGURE 3.39 : Visualisation en microscopie confocale de la localisation des MSNs-Rh au sein des cellules canc´ereuses coliques SW480 apr`es diff´erentes temps de traitement : 30’, 2h, 4h, 8h, 20h et 32h `

3.5. Conclusion

De fa¸con g´en´erale, les MSNs se pr´esentent soit sous la forme d’agr´egats (marqu´es par des fl`eches jaunes), soit sous la forme de particules individualis´ees (marqu´ees par des fl`eches blanches). Pour interpr´eter les r´esultats, seule l’observation des MSNs individualis´ees permet d’envisager l’internalisation des MSNs. La pr´esence des agr´egats ne renseigne pas sur l’internalisation car leur intensit´e de fluorescence est trop importante, et de ce fait, les agr´egats semblent apparaˆıtre sur tous les plans focaux.

Au plan focal z₁, c’est-`a-dire `a proximit´e de la lame de verre de croissance des cellules, le nombre de MSNs augmente avec le temps de traitement. A 30 minutes, les MSNs ne sont pas pr´esentes en z1 tandis qu’elles apparaissent pour les temps de 2 heures et atteignent un taux maximum `a partir de 4 heures.

Au plan focal z2, aucune nanoparticule n’est pr´esente apr`es 30 minutes de traitement. A partir de 2 heures de traitement, les MSNs individualis´ees sont visibles au niveau du noyau des cellules. Leur nombre augmente `a 4 heures puis semble rester stable pour de plus longues dur´ees de traitement.

Au plan focal z3, c’est-`a-dire `a proximit´e de la surface de la cellule, le nombre de MSNs est important, et ce, d`es 30 minutes. A partir de 32 heures, leur nombre diminue. Etant donn´e qu’aucune nanoparticule n’est pr´esente `a proximit´e des noyaux et qu’elles sont pr´esentes `a la surface des cellules pour 30 minutes de temps de traitement, les nanoparticules doivent probablement se fixer sur la membrane cellulaire avant d’ˆetre invagin´ees [483–485].

Il en ressort de ces r´esultats qu’un temps de traitement ´egale `a 30 minutes est trop court pour sugg´erer une ´eventuelle internalisation des MSNs individualis´ees. Cette internalisation se produirait `a partir de 2 heures de traitement (pr´esence de MSNs individualis´ees dans le mˆeme plan focal que les noyaux) et serait optimale pour un temps de traitement de 4 heures. Ce r´esultat est en ad´equation avec les travaux de Fisichella et al. [485] qui montrent que la quantit´e de MSNs internalis´ees atteint un niveau de saturation apr`es 180 minutes d’incubation.

3.5 Conclusion

Plusieurs organosilanes ont ´et´e utilis´es pour modifier la chimie de surface des MSNs. La fonctionnalisation par co-condensation et greffage post-synth`ese ont ´et´e les deux voies ´etudi´ees dans ce chapitre. Dans le cadre de la fonctionnalisation par co-condensation, notre ´etude montre que la morphologie des nanoparticules fonctionnalis´ees d´epend de l’organosilane utilis´e et peut ˆetre de type sph´erique ou asym´etrique.

Les caract´erisations structurales et texturales ont montr´e que ces nanomat´eriaux fonction-nalis´ees ´etaient de type MCM-41 et poss´edaient une surface sp´ecifique ´elev´ee (> 800 m2/g) et un volume poreux important (> 0,7 cm3/g). Les caract´erisations par zˆetam´etrie, spectroscopie

Raman, infrarouge et RMN 29Si ont permis de mettre en ´evidence la pr´esence des groupements

fonctionnels introduits au sein du mat´eriau. Les spectroscopies RMN 29Si et infrarouge ont

fonc-tionnalis´ees. L’efficacit´e et le taux de greffage obtenus par analyse ´el´ementaire corroborent ceux obtenus par analyse thermogravim´etrique. En fonction de l’organosilane utilis´e, l’efficacit´e de greffage varie entre 40 et 90%, et le taux de fonctionnalisation entre 0,3 et 1,4 mmol/g.

Afin d’am´eliorer la stabilit´e collo¨ıdale des MSNs en milieu physiologique, le greffage de polym`eres en surface des MSNs a ´et´e ´etudi´e. Dans un premier temps, un organosilane com-portant deux acides carboxyliques a ´et´e greff´e `a la surface externe des MSNs lav´ees mais non extraites. Les caract´erisations par zˆetam´etrie, spectroscopie RMN 29Si et infrarouge ont montr´e que le greffage ´etait bien effectif et qu’il avait lieu sur les deux types de silanols de surface (Q3 et Q4). Apr`es extraction du tensioactif, la surface sp´ecifique et le volume poreux de ces nanomat´eriaux restent tr`es ´elev´es et valent respectivement 904 m2/g et 0,75 cm3/g. Les analyses ´el´ementaires et thermogravim´etriques ont donn´e des r´esultats concordants, `a savoir un taux de greffage d’environ 0,6 mmol/g. Ce taux de greffage ´etant relativement ´elev´e, une partie de la fonctionnalisation a probablement eu lieu `a l’int´erieur des canaux des MSNs. Dans un second temps, le mPEG10000-NH2 et la PEI1800 ont ´et´e greff´es aux acides carboxyliques par couplage peptidique. Les caract´erisations par zˆetam´etrie et spectroscopie infrarouge ont permis de mettre en ´evidence le couplage peptidique, et par cons´equent le greffage des polym`eres en surface des MSNs. Les analyses ´el´ementaires et thermogravim´etriques ont montr´e des taux de greffage ´egaux `a 0,10 PEG/nm2 et 0,50 PEI/nm2. La pr´esence des polym`eres en surface des particules a ´et´e aussi confirm´ee par une diminution de la surface sp´ecifique et du volume poreux. Malgr´e l’efficacit´e du greffage, les nanoparticules ne sont pas stables dans une solution aqueuse dont la force ionique est comparable `a celle du milieu physiologique.

Une ´etude in vitro de la cytotoxicit´e des nanoparticules fonctionnalis´ees a ´et´e men´ee en pr´esence de cellules canc´ereuses de type SW480. Les MSNs n’induisent pas de cytotoxicit´e, et ce, quel que soient le temps de traitement et la concentration utilis´ee (jusqu’`a 200 µg/mL).

Afin de v´erifier l’internalisation des nanoparticules dans les cellules canc´ereuses, une ´etude par microscopie confocale a ´et´e r´ealis´ee. Les MSNs ont ´et´e fonctionnalis´ees au pr´ealable par de la rhodamine silanis´ee. Cette ´etude r´ev`ele qu’un temps de traitement de 30 minutes est trop court pour permettre l’internalisation des nanoparticules. Celle-ci semble se produire `a partir de 2 heures de traitement et est maximale pour un temps de traitement de 4 heures.

Encapsulation du cisplatine et

comportement en pr´esence de cellules

en culture

Dans le but de montrer que les interactions physico-chimiques entre le nanovecteur et l’anticanc´ereux ont un impact sur la cin´etique de lib´eration du cisplatine mais ´egalement sur son taux d’encapsulation, l’adsorption et l’encapsulation du CDDP1 dans les MSNs fonctionnalis´ees sont ´etudi´ees dans ce chapitre. Les quantit´es adsorb´ees sont caract´eris´ees sur le solide par Spectrom´etrie d’Emission Atomique `a Source Plasma (ICP-AES), ou directement dans la solution par spectroscopie d’absorption UV-Visible. Apr`es optimisation de l’encapsulation par impr´egnation, les quantit´es totales de platine encapsul´e sont d´etermin´ees par ICP-AES et la localisation du CDDP est ´evalu´ee par Microscopie Electronique `a Balayage (MEB) et en Transmission (MET). L’effet de la pr´esence des groupements fonctionnels pr´esents en surface des nanoparticules sur l’environnement local du platine est ´egalement caract´eris´e par spectroscopie Raman. Apr`es encapsulation du cisplatine dans les nanoparticules de silice, la lib´eration de l’anticanc´ereux est ´etudi´ee en milieu de culture `a 37◦C. Pour finir, la cytotoxicit´e des MSNs encapsul´ees est ´evalu´ee sur la lign´ee de cellules coliques SW480.

4.1 D´etermination spectrophotom´etrique de la

concen-tration du CDDP en solution aqueuse

Dans le document Synthèse de nanoparticules mésoporeuses de silice et encapsulation du cisplatine en vue du ciblage des traitements de chimiothérapie anticancéreuse (Page 174-180)