Dosage spectrophotom´etrique du CDDP en solution aqueuse

De nombreuses m´ethodes permettent de d´eterminer la concentration et/ou l’environnement local du platine, que ce soit en milieu biologique (organes, urines ou tissus) ou dans des matrices 1. Dans ce chapitre, la d´enomination CDDP est utilis´ee pour d´esigner le cisplatine ✭✭ natif ✮✮ ou modifi´e (hydrolys´e, complex´e. . . ).

4.1. D´etermination spectrophotom´etrique de la concentration du CDDP en solution aqueuse

organiques/min´erales [312, 486]. Coupl´ees `a des m´ethodes de d´etection spectrom´etriques (ICP-AES, ICP-MS, ESI-MS) ou ´electrochimiques, ces techniques sont principalement spectroscopiques (Raman, UV-visible, XPS, AAS) ou impliquent la Chromatographie en Phase Liquide `a Haute Performance (HPLC) [486]. Elles sont g´en´eralement divis´ees en deux cat´egories : les techniques non-s´electives, qui d´etectent seulement la quantit´e totale de platine, et les techniques s´electives, qui d´etectent les quantit´es du compos´e sous sa forme native ou modifi´ee. Par exemple, Hann et al. ont d´etermin´e les concentrations des formes natives, mono- et diaqua du cisplatine dans les urines des patients en utilisant la chromatographie en phase liquide `a haute performance (HPLC) coupl´ee `a la spectrom´etrie `a torche plasma (ICP-MS). Ils obtiennent des limites de d´etection respectivement ´egales `a 0,74, 0,69 et 0,65 µg/L pour les formes natives, mono- et diaqua du cisplatine [487]. Toutes ces m´ethodes restent n´eanmoins tr`es sp´ecifiques et complexes `a mettre en œuvre.

Afin de d´eterminer la quantit´e de CDDP adsorb´ee au sein des diff´erentes MSNs, nous avons choisi de suivre l’´evolution de la concentration en CDDP en solution en pr´esence des diff´erentes MSNs par spectroscopie d’absorption UV-visible. En effet, si les affinit´es chimiques entre le CDDP et les MSNs sont modul´ees, les quantit´es adsorb´ees doivent ˆetre diff´erentes. Ainsi, par diff´erence entre les concentrations des solutions de CDDP avant et apr`es adsorption, il est possible de quantifier les taux d’adsorption pour chaque type de particule. Sur la Figure 4.1, le spectre UV-visible du CDDP `a diff´erentes concentrations dans l’eau est pr´esent´e.

200 250 300 350 400 450 0,05 mg/mL 1 mg/mL A b sor b anc e Longueur d'onde (nm)

FIGURE 4.1 : Spectre d’absorption UV-visible du CDDP `a diff´erentes concentrations dans l’eau : (a) 1 mg/mL ; (b) 0,05 mg/mL. Toutes les solutions ont ´et´e conserv´ees `a l’abri de la lumi`ere.

Dans un premier temps, le cisplatine en solution est caract´eris´e `a une concentration corres-pondant `a sa limite de solubilit´e dans du NaCl `a 0,15 M (s´erum physiologique), c’est-`a-dire `a 1 mg/mL. Le spectre pr´esente deux pics d’absorbance `a 285 nm et 301 nm dont les coefficients d’extinctions molaires ǫMvalent 19 et 13 m2/mol, respectivement. La bande `a 301 nm est due `a la transition ´electronique d-d de l’ion Pt²⁺ dans une g´eom´etrie plan carr´e (le cisplatine appartient au groupe ponctuel de sym´etrie C_2v) [488]. Un ´epaulement `a 362 nm (ǫ<sub>M</sub> = 2,42 m2/mol) est ´egalement observable ainsi qu’un minimum d’absorbance `a la longueur d’onde de 246 nm. A

cette concentration, la bande d’absorption observ´ee `a une longueur d’onde de 203 nm (bande de transfert de charge [488]), dont le coefficient d’extinction molaire ǫ_M vaut 520 m2/mol, est satur´ee et il faut diluer la solution par 20 pour l’observer (soit une concentration finale de 0,05 mg/mL).

Comme nous l’avons d´ej`a indiqu´e dans le chapitre 1 (voir paragraphe 1.5.3.2), le cisplatine subit en milieu aqueux des transformations par des r´eactions d’hydrolyse successives et des r´eactions acido-basiques [312, 313] (Figure 4.2) :

Pt H₃N Cl H₃N Cl Pt H₃N Cl H₃N OH₂ Pt H₃N Cl H₃N OH Pt H₃N OH₂ H₃N OH₂ Pt H₃N OH H₃N OH₂ Pt H₃N OH H3N OH K₁ (k₁) (k_-1) -Cl +H₂O K₂ (k₂) (k_-2) -Cl +H₂O 2+ + + K_a1 K_a2 -H+ -H+ -H+ K_a3 (1) (2) (3) (4) (6) (5)

FIGURE 4.2 : R´eactions successives d’hydrolyse et de d´eprotonation du CDDP en milieu aqueux (pK_a1 = 6,41 ; pK_a2 = 5,37 ; pK_a3 = 7,21) [313]. Les esp`eces charg´ees positivement (tr`es r´eactives) sont indiqu´ees en rouge.

En solution aqueuse, il se produit une hydrolyse menant successivement aux complexes mono-([Pt(NH₃)₂Cl(H₂O)]⁺) et diaqua ([Pt(NH₃)₂(H₂O)₂]⁺), beaucoup plus r´eactifs et sensibles vis-`a-vis des nucl´eophiles. Ces compos´es sont aussi des acides faibles qui vont pouvoir se dissocier en solution aqueuse via des ´equilibres acido-basiques. Les valeurs des pKa des esp`eces mono et diaqua ont ´et´e d´etermin´ees en suivant l’´evolution des d´eplacements chimiques par RMN 1H et RMN 15N en fonction du pH `a 27◦C [313]. Ces valeurs sont ´egales `a pKa1 = 6,41, pKa2 = 5,37 et pKa3 = 7,21 [313]. La constante de vitesse pour la premi`ere hydrolyse est de l’ordre de 0,089

h-1 dans l’eau `a 27◦C [312]. Apr`es 30 heures, 23% du cisplatine demeure intacte et 65% du

cisplatine initial est sous la forme du produit de premi`ere hydrolyse (monoaqua). Les produits de seconde hydrolyse (diaqua) n’apparaissent qu’apr`es 3,5 heures mais leur taux ne d´epasse jamais 7% [313]. Le produit de premi`ere hydrolyse est donc le compos´e le plus pr´esent en solution. Au pH physiologique (pH = 7,4), c’est la forme [Pt(NH₃)₂Cl(OH)] qui devrait pr´edominer.

Compte tenu de ces ´equilibres, nous avons suivi l’´evolution des bandes d’absorption `a 203 et 301 nm en fonction du temps. Ces deux bandes sont susceptibles d’ˆetre int´eressantes pour la quantification, donc pour un ´etalonnage potentiel. L’´evolution des spectres d’absorption UV-visible des solutions de CDDP `a 1 mg/mL et 0,05 mg/mL dans l’eau est pr´esent´ee sur la Figure 4.3.

4.1. D´etermination spectrophotom´etrique de la concentration du CDDP en solution aqueuse 250 300 350 400 450 500 30 min 45 min 60 min 90 min 2h 3h 4h 5h 24h A b sor b anc e Longueur d'onde (nm) 190 200 210 220 230 240 250 1h 3h 3h30 4h 24h 6 jours A b sor b anc e Longueur d'onde (nm) (a) (b)

FIGURE 4.3 : Evolution du spectre d’absorption UV-visible du CDDP dans l’eau pour des concen-trations de 1 mg/mL (a) et 0,05 mg/mL (b). Toutes les solutions ont ´et´e conserv´ees `a l’abri de la lumi`ere.

Au cours du temps, l’absorbance maximale `a 301 nm diminue significativement au profit de l’apparition d’un pic `a environ 270 nm (Figure 4.3(a)). Dans ces conditions, il ne s’agit pas d’un point isobestique car les produits des r´eactions sont multiples. Comme le montre la Figure 4.3(b), l’intensit´e du pic `a 203 nm diminue aussi tr`es fortement avec le temps au profit de l’apparition d’un pic `a environ 197 nm. Cette ´evolution se poursuit mˆeme au-del`a de 6 jours, ce qui rend impossible l’´etalonnage.

Pour ´eviter l’hydrolyse lors de son utilisation, le cisplatine est g´en´eralement dissous dans une solution de NaCl `a 0,15 M (s´erum physiologique). Afin de v´erifier s’il est possible de renverser l’hydrolyse et de reformer le cisplatine sous sa forme native, une solution de cisplatine hydrolys´ee pendant 48 heures est re-dilu´ee dans une solution de NaCl `a 0,15 M. La Figure 4.4 montre qu’apr`es 20 heures, le cisplatine est de nouveau pr´esent sous sa forme native.

250 300 350 400 450

CDDP (eau) - 48 h

+ NaCl 0,15 M après 23 min

+ NaCl 0,15 M après 1 h 40 + NaCl 0,15 M après 20 h objectif Longueur d'onde (nm) A b sor b anc e

FIGURE 4.4 : Evolution du spectre d’absorption UV-visible d’une solution de CDDP `a 1 mg/mL, hydrolys´ee 48 heures dans l’eau, puis redilu´ee dans une solution de NaCl `a 0,15 M. Toutes les solutions ont ´et´e conserv´ees `a l’abri de la lumi`ere.

Puisque l’hydrolyse du CDDP est une r´eaction r´eversible, un ´etalonnage devient tout `a fait envisageable. Cependant, `a une telle concentration en ions chlorures, nous observons que les solutions absorbent en dessous de 210 nm, ce qui ne permet pas de mesurer l’absorbance de la bande `a 203 nm. De plus, de par son coefficient d’extinction faible, la bande d’absorbance `a 301 nm ne permet pas une d´etection sensible de la concentration en solution de CDDP. Ainsi, une autre m´ethode de d´etermination spectrophotom´etrique impliquant la complexation du CDDP par un agent adapt´e a ´et´e envisag´ee.