Extraction des eaux

Compte tenu des concentrations attendues dans le milieu, une étape de préconcentration est nécessaire pour détecter les composés d’intérêt.

Le matériel utilisé a systématiquement subi un lavage en machine au détergent (TFD 7, Franklab) et à l’acide (Neutrax, Franklab). En outre, le matériel en verre, a été porté à 450 °C pendant une durée de 8 h.

3.2.1 Filtration

Après prélèvement, les échantillons sont filtrés au laboratoire. Pour l’analyse des médicaments, les eaux sont filtrées sur des unités de filtration en polysulfone (Nalgene) adaptées sur des bouteilles en

eaux d’entrée de station d’épuration, eaux de sortie de station d’épuration et eaux de rivière. Pour l’analyse des filtres UV, l’utilisation indispensable d’unités de filtration en verre permet de les calciner à 450 °C.

Les membranes filtrantes utilisées sont en fibre de verre et ont un seuil de coupure de 0,7 µm, de marque Whatman GF/F et achetées chez VWR International (Fontenay-sous-Bois, France). Pour les échantillons d’entrée de station d’épuration, très chargés, une filtration préalable sur filtre en fibre de verre GF/A (Whatman) au seuil de coupure de 1,6 µm pouvait être nécessaire.

Après filtration les échantillons sont conservés dans un flacon en PEHD (Nalgene) pour l’analyse des médicaments ou une bouteille en verre borosilicaté (Duran) pour l’analyse des filtres UV puis stockés dans un congélateur réglé à -18 °C.

3.2.2 Extraction sur phase solide - Principe

Le principe de l’étape de reconcentration repose sur une extraction sur phase solide (SPE) par percolation de l’échantillon aqueux sur une cartouche contenant une phase adsorbante, où les analytes vont se fixer. Dans un second temps, l’élution de la cartouche par un solvant ou un mélange de solvant ayant une plus forte affinité avec les analytes que la phase stationnaire permet d’éluer les molécules d’intérêt dans un plus faible volume de solvant organique. Le choix de la phase stationnaire est donc primordial pour l’extraction. Le protocole multi-résidus pour les médicaments d’intérêt est adapté à 53 molécules aux propriétés physico-chimiques contrastées. Leur coefficient de partage octanol - eau varie de -1,1 (lamivudine) à 5,4 (atorvastatine) avec une moyenne de 2,3. La phase stationnaire doit donc permettre d’extraire sur une large gamme de log Kow. Le choix s’oriente donc vers une phase inverse mixte hydrophile – lipophile de type Oasis HLB (Hydrophilic – Lipophilic – Balanced). Cette phase, copolymère de divinyl-benzène et de N-vinyl-pyrrolidone, est adaptée aux molécules neutres au pH d’extraction. En revanche, pour des molécules ionisées au pH d’extraction, l’effet dissociant de l’eau va diminuer l’affinité des analytes pour la phase et engendrer de faibles rendements d’extraction. L’alternative est l’utilisation d’un adsorbant échangeur d’ion ayant une rétention améliorée envers les anions (Oasis MAX) ou les cations (Oasis MCX). Ainsi, les phases MAX et MCX sont constituées d’une phase HLB à laquelle des groupements d’amines quaternaires (MAX) ou sulfonates (MCX) ont été greffés. La structure de ces trois types de phase est donnée Figure 33.

Dans cette étude, pour l’analyse des médicaments, le choix s’est porté sur l’utilisation de cartouches MCX puisque le protocole a déjà fait l’objet d’une validation pour une partie des analytes (Togola et Budzinski, 2008). Le pH d’extraction est ajusté à 2, de telle sorte que les fonctions acides des molécules soient sous leur forme neutre protonée et les fonctions basiques sous forme cationique (exemple en Figure 34), conditions optimales pour l’adsorption par la phase MCX.

Diclofénac pKa = 4,0

Amitriptyline pKa = 9,8

Figure 34. Formes majoritaires du diclofénac et de l’amitriptyline à pH 2.

Dans le cas des filtres UV, des cartouches HLB 200 mg ont été utilisées.

- Protocole d’extraction des médicaments (Figure 35)

Le volume d’échantillon à reconcentrer, appelé prise d’essai et obtenu par gravimétrie, est de 100 mL pour les eaux usées et de 200 mL pour les eaux de rivières. La prise d’essai est acidifiée à pH 2 par une solution d’acide chlorhydrique à 10 %.

Après ajout des étalons internes (cf. section 5.1 de ce chapitre), les échantillons sont déposés sur les cartouches Oasis MCX préalablement conditionnées. Le conditionnement, est effectué en deux temps par 3 mL d’acétate d’éthyle puis 3 mL d’eau Vittel à pH 2. Cette étape permet d’éliminer l’air emprisonné ainsi que les impuretés sur l’adsorbant mais aussi de solvater les sites d’adsorption. En outre, les 3 mL d’eau permettent l’équilibration de l’adsorbant avant percolation de la prise d’essai. La percolation de l’échantillon a lieu par application d’un vide dans une cuve placée sous la cartouche. Le débit est réglé afin d’observer un goutte à goutte rapide mais discontinu (débit approximatif de 5 mL.min^-1). Le protocole ne prévoit pas d’étape de lavage dans la mesure où, dans le cadre d’un tel protocole multi-résidus, les molécules présentant une faible affinité avec la phase risqueraient d’être éluées.

L’élution est faite en trois étapes après séchage sous vide des cartouches :  3 mL d’acétate d’éthyle

 3 mL d’un mélange acétate d’éthyle / acétone (50/50, v/v)

Le troisième mélange de solvant, basique, permet une meilleure désorption des cations adsorbés aux groupes échangeurs d’ions.

Les 9 mL d’éluât sont ensuite reconcentrés à sec sous flux d’azote. La température de la plaque chauffante est fixée à 40 °C afin de limiter la perte des composés par évaporation ou dégradation (Baker et Kasprzyk-Hordern, 2011b). Baker et Kasprzyk-Hordern (2011b) ont constaté un plus fort impact de la température d’évaporation lorsque le solvant d’élution est basique et l’expliquent par le pH du solvant, supérieur au pKa des bases, rendant les analytes basiques plus « non-polaires » sous leur forme neutre et par conséquent plus volatils.

A cause du caractère hydrophobe de certains analytes susceptibles de s’adsorber sur les parois du flacon, la reprise de l’extrait sec est réalisée avec insistance par 3 fractions de 100 µL d’acétonitrile. Celles-ci sont regroupées dans un flacon d’injection de chromatographie de 1,5 mL muni d’inserts et stockées au congélateur jusqu’à leur injection.

Prise d’essai 100 – 200 mL ↓ Acidification à pH = 2 (HCl 10 %) ↓

Ajout de la solution d’étalonnage interne Contrôle gravimétrique

↓

Conditionnement des cartouches MCX 3 cc 60 mg 3 mL acétate d’éthyle, 3 mL eau Vittel pH 2

↓

Dépôt des échantillons

↓

Séchage sous vide

↓

Elution

3 mL acétate d’éthyle, 3 mL acétate d’éthyle/acétone (50/50, v/v), 3 mL méthanol/dichlorométhane (50/50, v/v) + 5 % hydroxyde d’ammonium à 28-30 %

↓

Evaporation à sec sous flux d’azote

↓

Reprise dans l’acétonitrile et transfert en flacon d’injection

Figure 35. Synoptique du protocole d’extraction des médicaments de l’eau.

Les filtres UV étant des molécules d’usage dans les produits cosmétiques, les échantillons sont susceptibles d’être contaminés par les manipulateurs aux différentes étapes de l’analyse. Afin de se prémunir de cette contamination, plusieurs précautions ont été prises.

- Le matériel est strictement dédié aux filtres UV et est régulièrement pyrolysé, - la vaisselle pyrolysée est manipulée avec des gants,

- le pH est contrôlé au papier pH et non au pH-mètre, - les blancs protocole sont réalisés en triplicats.

- Protocole filtres UV (Figure 36)

La prise d’essai est de 100 mL pour les eaux de station d’épuration et de 200 mL pour les eaux de rivière. Le pH est ajusté à 2.

Après ajout des étalons internes (cf. section 5.1 de ce chapitre), les échantillons sont déposés sur les cartouches préalablement conditionnées. Le conditionnement est effectué en deux temps par 3 mL de méthanol puis 3 mL d’eau Vittel à pH 2.

Après percolation de l’échantillon, les cartouches sont séchées sous vide. Les cartouches sont éluées par 2 fois 5 mL d’un mélange méthanol / dichlorométhane (50/50, v/v). L’éluât est enfin évaporé à sec sous flux d’azote avant reprise dans l’acétonitrile et transfert en flacon d’injection avec les mêmes précautions opératoires que pour les médicaments.

Prise d’essai 100 – 200 mL ↓ Acidification à pH = 2 (HCl 10 %) au papier pH ↓

Ajout de la solution d’étalonnage interne Contrôle gravimétrique

↓

Conditionnement des cartouches HLB 6 cc 200 mg 5 mL méthanol, 5 mL eau Vittel pH 2

↓

Dépôt des échantillons

↓

Séchage sous vide

↓

Elution

2 fois 5 mL méthanol/dichlorométhane (50/50, v/v)

↓

Evaporation à sec sous flux d’azote

3.2.3 Protocole de déconjugaison

Ce protocole a été appliqué à la méthode multi-résidus médicaments. Afin d’évaluer la part de médicaments sous forme conjuguée arrivant en station d’épuration, un protocole de déconjugaison a été mis au point. Il consiste en l’hydrolyse enzymatique des molécules glucuro-conjuguées et sulfo-conjuguées de l’échantillon afin de doser la somme des formes libres et sulfo-conjuguées. Par différence avec l’analyse des formes libres seules (sans protocole de déconjugaison), on obtient la part conjuguée.

La déconjugaison entre l’acide glucuronique ou l’ion sulfate et la substance active du médicament est une hydrolyse catalysée par la β-glucuronidase selon la réaction suivante :

β-D-glucuronide + H2O → D-glucuronate + alcool

Cette enzyme a trois origines possibles pour son utilisation en chimie analytique : mammifères, bactéries ou mollusques, cette dernière étant la plus couramment utilisée. La β-glucuronidase type HP-2 de Helix Pomatia (type HP-2, aqueous solution, ≥ 100,000 units/mL, achetée chez Sigma Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France) est celle choisie pour cette étude car elle possède la plus forte activité glucuronidase et une activité sulfatase (Gomes et al., 2009).

Le protocole est adapté de Mouatassim-Souali et al. (2003). On ajuste le pH de 50 mL d’échantillon à 5, pH optimal de l’enzyme. Après ajout de 50 µL d’enzyme, l’échantillon est placé dans une étuve réglée à 37 °C pendant 12 h puis traité comme un échantillon d’eau usuel.