Chapitre 2 : Matériels et méthodes
4 Analyse par chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse de masse
Ajout 30 mL acétonitrile / eau Vittel pH = 2 (70/30 v/v)
↓
Extraction par micro-ondes focalisées 10 min – 15 W
↓
Filtration sur coton de verre
↓
Reconcentration
Rapidvap (45 min, 80ºC, 650 mbar)
↓
Ajout de 30 mL d’eau Vittel à pH 2
↓
Purification par SPE
Figure 38. Synoptique du protocole d’extraction des médicaments de matrices solides.
3.4 Extraction de la phase réceptrice des échantillonneurs passifs (POCIS)
Le protocole d’extraction des POCIS est identique pour les médicaments et les filtres UV. Après ouverture du POCIS, la phase est collectée dans une cartouche en verre de 6 mL à l’aide d’un petit volume d’eau Vittel. Après transfert, la phase est séchée puis éluée par successivement 10 mL de méthanol, 10 mL d’un mélange méthanol/dichlorométhane (50/50, v/v) et 10 mL de dichlorométhane. Les étalons internes ont été préalablement introduits par contrôle gravimétrique dans les flacons de récupération de l’éluât. Les analytes contenus dans ces 30 mL sont ensuite reconcentrés à sec par un système d’évaporation sous vide Rapidvap (45 min, 80 °C, 650 mbar) puis repris dans l’acétonitrile et transférés en flacons d’injection comme dans le cas des extraits d’eau.
4 Analyse par chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie
de masse
4.1 Chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse en
tandem (MS/MS) triple quadrupôle
4.1.1 Instrument analytique
Compte tenu de la polarité des analytes, qui, pour être analysés en chromatographie en phase gazeuse, nécessiteraient une dérivation, la chromatographie en phase liquide est la technique
chromatographie en phase gazeuse pouvait être envisageable. La séparation est basée sur les différences d’affinité entre analyte, phase stationnaire et phase mobile.
Après séparation chromatographique, la détection est assurée par un couplage à la spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) de type triple quadrupôle. A la fois sélective et sensible, cette technique de détection est largement utilisée dans l’analyse environnementale ciblée (Gros et al., 2006 ; Hummel et al., 2006 ; López-Serna et al., 2011).
Elle souffre cependant de limitations quant à l’ionisation des analytes. La source d’ionisation utilisée, par électronébulisation, est très sensible à la présence de sels ou d’additifs. Ainsi, dans le cas de matrices complexes telles que les effluents d’entrée de station d‘épuration, une suppression de signal peut survenir, affectant alors la sensibilité théorique observée dans du solvant.
Les molécules sont ionisées en deux modes : mode d’ionisation positif (ESI+) ou mode d’ionisation négatif (ESI-). En mode d’ionisation positif, l’analyte va capter un proton H+ alors qu’en mode d’ionisation négatif, l’analyte va céder un proton pour former un anion. Le mode d’ionisation positif est facilité par l’ajout d’un acide volatil dans la phase mobile (acide formique ou acide acétique). Le mode d’ionisation dépend des fonctions chimiques portées par l’analyte et en particulier de ses propriétés acido-basiques : un acide carboxylique sera préférentiellement ionisé en mode négatif tandis qu’une amine sera plus apte à se protoner et à être ionisée en mode positif.
Après ionisation, la détection est assurée en mode « Multiple Reaction Monitoring » dynamique (MRM dynamique). Ce mode de détection est à l’origine de la sélectivité des triples quadrupôles : un ion formé dans la source est sélectionné par un premier quadrupôle, fragmenté dans la cellule de collision puis l’un de ses fragments est sélectionné par le second quadrupôle. Le couple ion parent – ion fils, spécifique à un analyte, est appelé transition. Le mode dynamique MRM est dérivé de cette méthode de détection. Une transition donnée n’est acquise que sur une plage de temps donnée (par exemple dans un intervalle de 2 minutes autour du temps de rétention), permettant, à un instant donné, de réduire le nombre de transitions enregistrées. Cela a pour effet de diminuer le temps de cycle donc de permettre un temps de balayage (en anglais « dwell time ») plus élevé, améliorant de ce fait la sensibilité.
4.1.2 Médicaments en mode d’ionisation positif
L’instrument est une chaine HPLC 1200 Agilent Technologies couplée à un spectromètre de masse à triple quadrupôle Agilent Technologies 6410 avec ionisation par électronébulisation. Le détail de la méthode analytique est donné en Annexe 7. Brièvement, les analytes sont séparés sur une colonne de 5 cm en phase inverse greffée C18 en 17 min, avec un gradient de phase mobile composée d’eau ultrapure et d’acétonitrile acidifiés à 0,1 % d’acide formique. Les 108 transitions associées aux 41 composés natifs (transition de quantification et transition de confirmation) et aux 26 composés deutérés et aux PRC (une seule transition) sont acquises en mode MRM dynamique à raison de 2 à 53 transitions concurrentes selon le temps de rétention, imposant un dwell time variable de 12 à 397 ms.
4.1.3 Médicaments en mode d’ionisation négatif
L’instrument est identique à celui du protocole d’analyse des médicaments en mode d’ionisation positif. Le détail de la méthode analytique est donné en Annexe 7. Les conditions chromatographiques sont proches de celles appliquées aux médicaments en mode d’ionisation positif, à la différence près que les phases mobiles ne sont pas acidifiées et que le gradient dure 38 min. Ce temps d’analyse se justifie pour permettre une bonne séparation du kétoprofène et d’un interférent répondant à la même transition.
Les 12 composés natifs et les 11 étalons internes associés correspondent à l’acquisition de 32 transitions, en mode MRM simple, avec un dwell time de 20 ms. Le choix ne s’est pas porté vers de la MRM dynamique en raison de la variabilité des temps de rétention des analytes dans ce mode d’ionisation, le risque étant une élution du composé antérieure à la plage d’acquisition prévue.
4.1.4 Filtres UV
L’instrument est une chaine Waters Acquity Ultra Performance LC couplée à un spectromètre de masse à triple quadrupôle Waters Quattro Premier XE avec ionisation par électronébulisation. Le détail de la méthode analytique est donné en Annexe 7. Les conditions chromatographiques sont identiques à celles appliquées aux médicaments en mode d’ionisation positif, avec un gradient de 6 min. Le taux de solvant de début de gradient est relativement organique (30 % d’acétonitrile) et la pente est élevée, atteignant 100 % d’acétonitrile en 3 min, conditions nécessaires à l’élution de ces analytes relativement hydrophobes. Le dwell time est fixé à 20 ms pour les 15 transitions acquises.
4.2 Chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse
hybride quadrupôle/temps de vol
Face au challenge de la détection de nouvelles molécules, les études bibliographiques prédictives associées à l’analyse ciblée trouvent leurs limites. Par exemple, la cétirizine, 280ème substance active de médicament consommée par sa quantité en France en 2010 (données MEDIC’AM, cf. chapitre 1, section 2.4), n’a qu’une consommation faible qui aurait pu écarter sa sélection d’une liste de priorisation basée sur ce critère. Les résultats d’analyse d’effluents (cf. chapitre 4.1, section 1.3.2) montrent pourtant qu’il s’agit d’une molécule réfractaire et sa bonne limite de détection (cf. chapitre 3.1, section 1.1.2) en fait un traceur de choix après rejet dans l’environnement.
Par ailleurs, l’un des enjeux actuels de l’analyse de micropolluants organiques est la détection de produits de transformation (Celiz et al., 2009). La complexité des mécanismes de dégradation, en traitement des eaux comme dans l’environnement, rend également difficile la prédiction des structures moléculaires. La technologie de choix est alors l’analyse non ciblée par spectrométrie de masse haute résolution, celle-ci ne nécessitant pas la connaissance préalable des structures des produits de transformation et permettant en outre l’analyse rétrospective d’échantillons déjà acquis (Diaz et al., 2013).
La chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse hybride quadrupôle/temps de vol combine la sélectivité d’un quadrupôle à la résolution d’un analyseur à temps de vol (TOF). Après séparation chromatographique, un quadrupôle sélectionne les ions précurseurs de rapport masse sur charge donné. Ces ions sont ensuite fragmentés dans une cellule de collision (gaz de collision : azote de qualité 5.0), les fragments générés sont analysés dans le tube de vol, leur masse étant mesurée à 10-4 Da près (Agilent Technologies, 2012). Cette masse exacte permet de reconstituer par le calcul (et dans certains cas d’après le massif isotopique) la composition atomique (formule brute) de chaque ion compte tenu des abondances isotopiques des atomes. Enfin, par croisement avec des bases de données existantes et par analyse des fragments en MS², il est envisageable d’identifier la structure développée et le nom de la molécule.
Ici, cet outil va être appliqué à la caractérisation globale des eaux de station d’épuration. L’objectif est de rechercher des comportements structurels généraux entre entrée et sortie de station d’épuration, d’évaluer la représentativité des 53 molécules sélectionnées et de dépasser cette liste pour proposer de nouvelles molécules qui pourraient nécessiter des études environnementales. En outre, appliqué aux expériences d’incubation, il s’agira d’évaluer des comportements globaux après dégradation.
4.2.1 Méthode d’analyse non ciblée
L’instrument est une chaine HPLC 1290 Infinity Agilent Technologies couplée à un spectromètre de masse hybride quadrupôle/temps de vol Agilent Technologies 6540 avec ionisation par électronébulisation à Jet Stream. Le détail de la méthode analytique est donné en Annexe 7. Il s’agit à nouveau d’une séparation chromatographique en phase inverse greffée C18, sur une colonne de 10 cm, l’objectif étant de séparer les analytes du protocole ciblé sur un temps plus long, en 20 min, afin de limiter les co-élutions. Le temps de rétention est en effet un critère déterminant d’identification des molécules en analyse non ciblée.
Concernant la détection, le spectromètre est paramétré en mode MS simple haute résolution : le quadrupôle ne sélectionne aucun ion et la cellule de collision est inactive. Le spectromètre est calibré avant injection par infusion d’une solution de référence où 10 ions de 118 à 2722 m/z sont formés en mode d’ionisation positif et 12 ions de 113 à 2834 m/z en mode d’ionisation négatif. Durant l’acquisition, l’exactitude en masse est contrôlée en continu par infusion de cette même solution de référence, les ions suivis en mode positif étant 118,0863 et 922,0098 m/z et 966,0007 m/z en mode d’ionisation négatif. L’acquisition balaie la gamme de masses protonées de 40 à 1700 m/z à une vitesse de balayage de 2 GHz.
4.2.2 Retraitement des données
Les données brutes sont retraitées à l’aide du logiciel Agilent MassHunter Qualitative Analysis. La première étape de caractérisation moléculaire consiste à associer un ou plusieurs ions à une molécule. Pour cela, l’algorithme de calcul du logiciel prend en considération la distribution
molécule (état de charge de 1 ou 2), la possibilité d’adduits de cette même molécule (+Na, +K, +NH4 en mode ESI+ et -Cl, -Br, -COOH, -CF3COO, -CH3COOH en mode ESI-) ainsi que l’éventualité de dimères ou trimères. La tolérance en masse pour l’attribution d’une même molécule à 2 ions de masse proche est de 5 ppm soit, à 1 000 Da, une masse pouvant varier de 999,005 à 1 000,005 Da. On impose un minimum d’intensité des signaux de 10 000 coups pour l’étude des STEP (cf. chapitre 4.1, section 1.7) et de 5 000 coups pour l’étude des incubations (cf. chapitre 4.4, section 4.4).
Par la suite, il est possible d’attribuer à chaque molécule identifiée une formule brute, d’après les masses atomiques exactes et les critères dépendant sur le nombre d’atomes maximal : C 60, H 120, O 30, N 30, S 10, Cl 10, P 10, F 10, Br 10. Enfin, les composés peuvent être identifiés à partir de leur masse exacte par comparaison à la base de données MetLin (Metabolite and Tandem MS Database), donnant ainsi les structures développées correspondantes les plus probables.
Les informations structurelles sont basées par exemple sur les masses moléculaires ou les rapports atomiques. Ces approches globales ont déjà été appliquées pour qualifier la matière organique naturelle (Koch et Dittmar, 2006), comparer des pétroles (Fernández-Varela et al., 2009) ou étudier la fumée de cigarette (Schramm et al., 2011). De façon plus originale, Mesfioui et al. (2012) applique cette approche à la qualification de la labilité de l’azote organique porté par les effluents urbains. L’étude des diagrammes de Van Krevelen (H/C en fonction de O/C) d’effluents de station d’épuration incubés révèle trois comportements : les molécules dégradées, les molécules récalcitrantes et les molécules générées lors des incubations.