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Expression hétérologue dans la levure Saccharomyces cerevisiae

3. Méthodes

3.8. Expression hétérologue dans la levure Saccharomyces cerevisiae

3.8.1. Transformation de S. cerevisiae

La transformation des cellules de levures par des plasmides d’expression est réalisée après

traitement des cellules à l’acétate de lithium (AcLi) (Gietz et al., 1992).

Afin de rendre les levures compétentes, elles sont cultivées dans 50 ml de milieu YPD (Tableau XVII)

et mises en culture à 30 °C sous agitation à 150 rpm. Lorsque la DO

600nm

atteint la valeur de 0,6 la culture est

centrifugée pendant 10 minutes à 4000 rpm. Les cellules sont ensuite reprises et lavées deux fois dans 1 ml

d’eau stérile. Le culot de cellules est ensuite repris dans 1 ml de Tris EDTA/Acétate de lithium pH 7,5

(TE/AcLi) et lavé deux fois. Les cellules sont enfin reprises dans 50 μl de tampon TE/AcLi par transformation

envisagée.

Pour la transformation, 50 μl de cellules rendues compétentes sont utilisées et mises en contact

150

Figure 43 : Principe général de la complémentation fonctionnelle de levures déficientes.

Une levure sauvage exprimant un transporteur donné est délétée du gène correspondant (exemple : gène impliqué dans l’absorption du zinc). La levure déficiente présente alors un phénotype précis (exemple : incapacité à se développer en situation de carence en zinc). Cette levure déficiente est alors transformée avec un plasmide permettant l’expression d’un ADNc hétérologue ou avec le plasmide vide. Si l’ADNc hétérologue exprime une fonction équivalente au gène délété chez la levure sauvage (exemple : transporteur impliqué dans l’absorption du zinc), la levure déficiente transformée avec cet ADNc présentera un phénotype sauvage (exemple : croissance en situation de carence en zinc). Dans le cas contraire, la levure déficiente transformée avec l’ADNc présentera un phénotype équivalent à celui de la levure déficiente transformée avec le plasmide vide (exemple : incapacité à se développer en situation de carence en zinc).

Transformation de la levure déficiente

par un plasmide permettant

l’expression d’un ADNc hétérologue

Levure sauvage

exprimant un

transporteur donné

Délétion du gène codant

le transporteur

Levure déficiente pour

un transporteur et

présentant un

phénotype précis

Transformation de la levure

déficiente par un plasmide

vide (témoin négatif)

Pas de complémentation

(phénotype de la levure

déficiente)

Complémentation

fonctionnelle de la levure

déficiente si restauration

du phénotype sauvage

d’une solution de TE/AcLi/PEG (Tableau XXX). Le mélange est incubé pendant 30 minutes sous agitation

(150 rpm) à 30 °C. Les cellules subissent ensuite un choc thermique de 15 minutes à 42 °C, avant d’être

centrifugées 5 minutes à 4000 rpm pour éliminer le PEG et remises en suspension dans 400 μl d’eau stérile.

Elles sont ensuite étalées sur milieu SD-ura (Tableau XXXI) solide et mises en cultures à 30 °C pendant 3 à

5 jours. Les levures utilisées sont toutes mutées pour le gène ura3 impliqué dans la voie de biosynthèse de

l’uracile. Ainsi, seules les levures ayant intégré un plasmide pourront se développer sur ce milieu SD-ura.

3.8.2. Complémentation fonctionnelle

Le principe général de la complémentation fonctionnelle en système hétérologue, la levure, est

donné dans la figure 43.

3.8.2.1. Test en gouttes

Les levures transformées par les différents gènes d’intérêts sont cultivées sur milieu SD-ura

(Tableau XXXI). Lorsqu’elles sont en phase exponentielle de croissance (DO

600nm

= 0,6), elles sont concentrées

à DO

600nm

= 1,1 ± 2,5 % soit 2,75.10

7

UFC.ml

-1

. Des dilutions au 10

e

, 100

e

et 1000

e

de cette solution mère sont

ensuite réalisées. Des gouttes de 5 µl de chaque dilution et de la solution mère sont ensuite déposées sur

des milieux, SD-ura (Tableau XXXI) ou milieu minimum (Tableau XXXII), permettant de mettre en évidence

une complémentation fonctionnelle par le gène porté par le plasmide pendant 3 à 5 jours. Sur chaque boîte,

la souche sauvage BY4741 et la souche délétée, toute deux transformées par le vecteur vide, sont utilisées

comme témoins respectivement positif et négatif de croissance.

La liste des souches de levures mutantes utilisées et leur phénotype est décrit dans le tableau XVI.

3.8.2.2. Suivi de la croissance en milieu liquide

Il est également possible de réaliser la complémentation fonctionnelle en milieu liquide. Pour cela,

des plaques 96 puits de culture cellulaire sont ensemencées avec les différentes souches de levures

transformées, la souche sauvage et la souche mutante transformée par le vecteur vide à une DO

600nm

initiale

de 0,2. Chaque puits contient du milieu SD-ura (Tableau XXXI), du milieu minimum (Tableau XXXII) ou du

milieu YPD (Tableau XVII), préparé avec différentes concentrations d’ETM déterminées en fonction du

phénotype recherché. Les plaques sont ensuite incubées à 30 °C dans un lecteur de plaques (Biotek) en

agitation pendant 36 à 72 heures. Une lecture de la DO

600nm

de chaque puits est réalisée toutes les

20 minutes.

3.8.2.3. Quantification du pool de métaux intracellulaires par ICP-AES

Une culture de 50 ml des souches de levures à étudier est ensemencée à une DO

600nm

initiale

de 0,005 et cultivée en agitation à 30 °C jusqu’à une DO

600nm

comprise entre 1,8 et 2. Le milieu de culture

utilisé est du milieu SD-ura supplémenté de différents métaux en fonction du phénotype recherché.

Les levures sont ensuite récoltées par centrifugation 10 minutes à 4000 rpm. Puis trois lavages avec

25 ml d’une solution de Tris/EDTA/HCl (Tris : 50 mM ; EDTA : 10 mM ; HCl pour ajuster le pH à 6,5) sont

réalisés afin d’éliminer les ETM adsorbés aux parois cellulaires. Un dernier lavage des levures est effectué à

l’eau ultra-pure. Enfin, les levures récoltées sont séchées une journée à l’étuve à 60 °C et envoyées à Pierre

Richaud pour le dosage des métaux intracellulaires par ICP-AES (environ 20 à 60 mg de masse sèche).

3.8.3. Localisation cellulaire de protéines par fusion GFP (Green Fluorescent Protein)

Le clonage dans le plasmide pYES2-GFP d’un ADNc nécessite de générer des amorces particulières.

En effet, il est nécessaire de rajouter des sites de restriction pour permettre l'insertion de l’ADNc dans le

vecteur. Il est aussi important de supprimer le codon stop du gène et de veiller à ce que les cadres de lecture

de l’ADNc du gène d’intérêt et de celui de la GFP soient en phase, avec l’ajout si besoin d’une ou deux bases

au niveau de l’amorce pour rétablir ce cadre de lecture.

Pour s’assurer d’une bonne interprétation de la localisation subcellulaire observée, deux

fluorophores ont également été utilisés. Le composé CMAC-Arg (7-Amino-4-ChloroMethylCoumarine)

(Molecular Probes) va pénétrer dans la vacuole et émettre une fluorescence au niveau du lumen. Il est

ajouté pendant 5 minutes à la solution de levures à la concentration de 50 μM, les levures sont ensuite

lavées deux fois dans du milieu SD-ura galactose (centrifugation 4000 rpm pendant 4 minutes) avant

visualisation au microscope à fluorescence. Le DAPI (4',6'-DiAmidino-2-PhénylIndole) est utilisé en tant que

contre-marqueur pour identifier le noyau. Le DAPI est ajouté à la solution de cellules à la concentration de

300 nM (solution stock diluée dans du PBS (Phosphate Buffered Saline)) pendant 20 secondes, les cellules

sont ensuite lavées deux fois dans du milieu SD-ura galactose (centrifugation 4000 rpm pendant 4 minutes)

avant visualisation au microscope à fluorescence.

Après transformation des levures par les constructions plasmidiques, les colonies obtenues sont

cultivées dans du milieu SD-ura contenant uniquement du galactose (Tableau XXXI) comme source de

carbone afin d’induire le promoteur pGAL1, activant ainsi l'expression du gène d'intérêt cloné. Pour une

contre-localisation de certains organites intracellulaires, les marqueurs CMAC et DAPI sont respectivement

ajoutés comme expliqué ci-dessus. Afin de s’assurer que la fusion protéique avec la GFP ne gêne pas

l’expression de la protéine d’intérêt, des tests de complémentation ont été réalisés dans les mêmes

conditions de caractérisation des protéines d’intérêt non fusionnées à la GFP. Les cellules transformées sont

observées avec un microscope à fluorescence Nikon Eclipse 200 (Nikon, Japon) avec un objectif Nikon Plan

100x à immersion. Deux filtres sont utilisés : un filtre FITC (excitation : 465-495 nm ; émission : 515-555 nm)

pour visualiser la fluorescence associée à la GFP et un filtre UV (excitation : 340-380 nm ; émission :

435-485 nm) pour visualiser la fluorescence générée par le CMAC et le DAPI. Les images sont acquises et

numérisées avec un appareil photo numérique (Nikon D80) relié au microscope.