3. Méthodes
3.8. Expression hétérologue dans la levure Saccharomyces cerevisiae
3.8.1. Transformation de S. cerevisiae
La transformation des cellules de levures par des plasmides d’expression est réalisée après
traitement des cellules à l’acétate de lithium (AcLi) (Gietz et al., 1992).
Afin de rendre les levures compétentes, elles sont cultivées dans 50 ml de milieu YPD (Tableau XVII)
et mises en culture à 30 °C sous agitation à 150 rpm. Lorsque la DO
600nmatteint la valeur de 0,6 la culture est
centrifugée pendant 10 minutes à 4000 rpm. Les cellules sont ensuite reprises et lavées deux fois dans 1 ml
d’eau stérile. Le culot de cellules est ensuite repris dans 1 ml de Tris EDTA/Acétate de lithium pH 7,5
(TE/AcLi) et lavé deux fois. Les cellules sont enfin reprises dans 50 μl de tampon TE/AcLi par transformation
envisagée.
Pour la transformation, 50 μl de cellules rendues compétentes sont utilisées et mises en contact
150
Figure 43 : Principe général de la complémentation fonctionnelle de levures déficientes.
Une levure sauvage exprimant un transporteur donné est délétée du gène correspondant (exemple : gène impliqué dans l’absorption du zinc). La levure déficiente présente alors un phénotype précis (exemple : incapacité à se développer en situation de carence en zinc). Cette levure déficiente est alors transformée avec un plasmide permettant l’expression d’un ADNc hétérologue ou avec le plasmide vide. Si l’ADNc hétérologue exprime une fonction équivalente au gène délété chez la levure sauvage (exemple : transporteur impliqué dans l’absorption du zinc), la levure déficiente transformée avec cet ADNc présentera un phénotype sauvage (exemple : croissance en situation de carence en zinc). Dans le cas contraire, la levure déficiente transformée avec l’ADNc présentera un phénotype équivalent à celui de la levure déficiente transformée avec le plasmide vide (exemple : incapacité à se développer en situation de carence en zinc).Transformation de la levure déficiente
par un plasmide permettant
l’expression d’un ADNc hétérologue
Levure sauvage
exprimant un
transporteur donné
Délétion du gène codant
le transporteur
Levure déficiente pour
un transporteur et
présentant un
phénotype précis
Transformation de la levure
déficiente par un plasmide
vide (témoin négatif)
Pas de complémentation
(phénotype de la levure
déficiente)
Complémentation
fonctionnelle de la levure
déficiente si restauration
du phénotype sauvage
d’une solution de TE/AcLi/PEG (Tableau XXX). Le mélange est incubé pendant 30 minutes sous agitation
(150 rpm) à 30 °C. Les cellules subissent ensuite un choc thermique de 15 minutes à 42 °C, avant d’être
centrifugées 5 minutes à 4000 rpm pour éliminer le PEG et remises en suspension dans 400 μl d’eau stérile.
Elles sont ensuite étalées sur milieu SD-ura (Tableau XXXI) solide et mises en cultures à 30 °C pendant 3 à
5 jours. Les levures utilisées sont toutes mutées pour le gène ura3 impliqué dans la voie de biosynthèse de
l’uracile. Ainsi, seules les levures ayant intégré un plasmide pourront se développer sur ce milieu SD-ura.
3.8.2. Complémentation fonctionnelle
Le principe général de la complémentation fonctionnelle en système hétérologue, la levure, est
donné dans la figure 43.
3.8.2.1. Test en gouttes
Les levures transformées par les différents gènes d’intérêts sont cultivées sur milieu SD-ura
(Tableau XXXI). Lorsqu’elles sont en phase exponentielle de croissance (DO
600nm= 0,6), elles sont concentrées
à DO
600nm= 1,1 ± 2,5 % soit 2,75.10
7UFC.ml
-1. Des dilutions au 10
e, 100
eet 1000
ede cette solution mère sont
ensuite réalisées. Des gouttes de 5 µl de chaque dilution et de la solution mère sont ensuite déposées sur
des milieux, SD-ura (Tableau XXXI) ou milieu minimum (Tableau XXXII), permettant de mettre en évidence
une complémentation fonctionnelle par le gène porté par le plasmide pendant 3 à 5 jours. Sur chaque boîte,
la souche sauvage BY4741 et la souche délétée, toute deux transformées par le vecteur vide, sont utilisées
comme témoins respectivement positif et négatif de croissance.
La liste des souches de levures mutantes utilisées et leur phénotype est décrit dans le tableau XVI.
3.8.2.2. Suivi de la croissance en milieu liquide
Il est également possible de réaliser la complémentation fonctionnelle en milieu liquide. Pour cela,
des plaques 96 puits de culture cellulaire sont ensemencées avec les différentes souches de levures
transformées, la souche sauvage et la souche mutante transformée par le vecteur vide à une DO
600nminitiale
de 0,2. Chaque puits contient du milieu SD-ura (Tableau XXXI), du milieu minimum (Tableau XXXII) ou du
milieu YPD (Tableau XVII), préparé avec différentes concentrations d’ETM déterminées en fonction du
phénotype recherché. Les plaques sont ensuite incubées à 30 °C dans un lecteur de plaques (Biotek) en
agitation pendant 36 à 72 heures. Une lecture de la DO
600nmde chaque puits est réalisée toutes les
20 minutes.
3.8.2.3. Quantification du pool de métaux intracellulaires par ICP-AES
Une culture de 50 ml des souches de levures à étudier est ensemencée à une DO
600nminitiale
de 0,005 et cultivée en agitation à 30 °C jusqu’à une DO
600nmcomprise entre 1,8 et 2. Le milieu de culture
utilisé est du milieu SD-ura supplémenté de différents métaux en fonction du phénotype recherché.
Les levures sont ensuite récoltées par centrifugation 10 minutes à 4000 rpm. Puis trois lavages avec
25 ml d’une solution de Tris/EDTA/HCl (Tris : 50 mM ; EDTA : 10 mM ; HCl pour ajuster le pH à 6,5) sont
réalisés afin d’éliminer les ETM adsorbés aux parois cellulaires. Un dernier lavage des levures est effectué à
l’eau ultra-pure. Enfin, les levures récoltées sont séchées une journée à l’étuve à 60 °C et envoyées à Pierre
Richaud pour le dosage des métaux intracellulaires par ICP-AES (environ 20 à 60 mg de masse sèche).
3.8.3. Localisation cellulaire de protéines par fusion GFP (Green Fluorescent Protein)
Le clonage dans le plasmide pYES2-GFP d’un ADNc nécessite de générer des amorces particulières.
En effet, il est nécessaire de rajouter des sites de restriction pour permettre l'insertion de l’ADNc dans le
vecteur. Il est aussi important de supprimer le codon stop du gène et de veiller à ce que les cadres de lecture
de l’ADNc du gène d’intérêt et de celui de la GFP soient en phase, avec l’ajout si besoin d’une ou deux bases
au niveau de l’amorce pour rétablir ce cadre de lecture.
Pour s’assurer d’une bonne interprétation de la localisation subcellulaire observée, deux
fluorophores ont également été utilisés. Le composé CMAC-Arg (7-Amino-4-ChloroMethylCoumarine)
(Molecular Probes) va pénétrer dans la vacuole et émettre une fluorescence au niveau du lumen. Il est
ajouté pendant 5 minutes à la solution de levures à la concentration de 50 μM, les levures sont ensuite
lavées deux fois dans du milieu SD-ura galactose (centrifugation 4000 rpm pendant 4 minutes) avant
visualisation au microscope à fluorescence. Le DAPI (4',6'-DiAmidino-2-PhénylIndole) est utilisé en tant que
contre-marqueur pour identifier le noyau. Le DAPI est ajouté à la solution de cellules à la concentration de
300 nM (solution stock diluée dans du PBS (Phosphate Buffered Saline)) pendant 20 secondes, les cellules
sont ensuite lavées deux fois dans du milieu SD-ura galactose (centrifugation 4000 rpm pendant 4 minutes)
avant visualisation au microscope à fluorescence.
Après transformation des levures par les constructions plasmidiques, les colonies obtenues sont
cultivées dans du milieu SD-ura contenant uniquement du galactose (Tableau XXXI) comme source de
carbone afin d’induire le promoteur pGAL1, activant ainsi l'expression du gène d'intérêt cloné. Pour une
contre-localisation de certains organites intracellulaires, les marqueurs CMAC et DAPI sont respectivement
ajoutés comme expliqué ci-dessus. Afin de s’assurer que la fusion protéique avec la GFP ne gêne pas
l’expression de la protéine d’intérêt, des tests de complémentation ont été réalisés dans les mêmes
conditions de caractérisation des protéines d’intérêt non fusionnées à la GFP. Les cellules transformées sont
observées avec un microscope à fluorescence Nikon Eclipse 200 (Nikon, Japon) avec un objectif Nikon Plan
100x à immersion. Deux filtres sont utilisés : un filtre FITC (excitation : 465-495 nm ; émission : 515-555 nm)
pour visualiser la fluorescence associée à la GFP et un filtre UV (excitation : 340-380 nm ; émission :
435-485 nm) pour visualiser la fluorescence générée par le CMAC et le DAPI. Les images sont acquises et
numérisées avec un appareil photo numérique (Nikon D80) relié au microscope.
Dans le document
Filtration biologique pour la réduction des éléments traces métalliques dans la biomasse du peuplier
(Page 175-181)