Différentes enzymes Taq ADN polymérases utilisées et leurs applications

L’enzyme couramment utilisée pour les PCR « standards » est la Taq polymérase Paq 5000

^TM

(Stratagene).

3.6.5.3.1. Mesure du taux de transcrits par RT-PCR

Pour la RT-PCR, 0,5 μl d’ADNc matrice (soit 25 ng) est utilisé pour la réaction de PCR. Le nombre de

cycles de PCR a été optimisé pour l’étude de l’expression de chaque gène (Figure 40) afin d’être dans les

conditions permettant de quantifier les ADNc obtenus et de renseigner s’il y a une différence quantitative au

niveau du taux d’expression des gènes. En effet, en pratique, la production des amplifiats par PCR suit une

courbe de type sigmoïde avec trois phases clés : i) le bruit de fond où la quantité d’ADN amplifiée est trop

faible pour être détectée ; ii) la phase exponentielle où la quantité d’ADN produit est doublée à chaque cycle

de PCR ; iii) la phase stationnaire ou de plateau lorsque les produits nécessaires à l’amplification contenus

dans le milieu réactionnel commencent à s’épuiser. Il est alors nécessaire de se situer en début de phase

exponentielle, dans les meilleures conditions d’amplification, afin d’être certain de correctement visualiser

les différences de niveaux d’expression entre les conditions étudiées. De plus, un contrôle interne est

nécessaire, à savoir un couple d’amorces s’hybridant sur l’ADNc d'un gène codant l’ubiquitine (Ubq) dont

l’expression ne varie pas quelles que soit les différentes conditions testées. Les résultats sont quantifiés et

rapportés au taux d’expression du gène de l’ubiquitine. La Taq polymérase utilisée est la Taq Paq 5000

^TM

(Stratagene) dont les conditions d’utilisation et d’amplification sont données dans le tableau XXV. Afin

d’éviter l’évaporation des produits PCR au cours de la réaction, de l’huile minérale est ajoutée en surface de

l’échantillon.

138

Figure 41 : Principe de la mutagénèse dirigée par la technique dite de « Splicing by Overlap Extension PCR »

(SOE PCR).

Afin d’insérer une mutation dans un gène d’intérêt, deux étapes d’amplifications par PCR sont nécessaires. Lors de la première étape, deux produits PCR portant la mutation, complémentaires par une extrémité, sont générés en utilisant le gène d’intérêt comme matrice. Lors de la deuxième étape, le gène d’intérêt portant la mutation est reconstitué en pleine longueur en utilisant les deux produits PCR précédemment obtenus comme matrice.

amplification par PCR avec

les amorces ATG (en bleu) et

mutée R (en noir et orange)

amplification par PCR avec les

amorces STOP (en rouge) et

mutée F (en noir et orange)

génération de deux produits de PCR portant

chacun la mutation (en orange)

amplification par PCR avec les amorces ATG

(en bleu) et STOP (en rouge)

génération d’un produit PCR du gène d’intérêt

portant la mutation (en orange)

3.6.5.3.2. PCR haute-fidélité

Clonage de gènes d’intérêt

La PCR haute-fidélité est réalisée dans les expériences de clonage de gènes d’intérêt. Elle permet

d’amplifier l’ADN avec moins d’erreurs de séquences que lorsqu’une polymérase classique est utilisée. La

fidélité des enzymes est permise grâce à une activité correctrice (3’  5’ exonucléase). Le brin d’ADN

néosynthétisé est ainsi corrigé grâce à l’activité exonucléasique. Ainsi, les polymérases haute-fidélité

incorporent 50 fois moins d’erreurs qu’une polymérase standard. Dans le cadre de ce travail, la Taq

polymérase Phusion (Finnzymes) a été utilisée dont le taux d’erreur est de 4,4.10

^-7

. Cette enzyme est plus

stable à haute température ce qui permet de restreindre l’étape de dénaturation, elle sera de 10 secondes à

98 °C au lieu de 30 secondes habituellement à 95 °C. La Taq polymérase Phusion est une enzyme qui a été

modifiée par ajout d’un domaine de liaison à l’ADN, ce qui permet d’augmenter la processivité de l’enzyme.

La vitesse d’élongation en est augmentée et est de 15 à 30 s/kb, ce qui rend cette enzyme particulièrement

intéressante pour l’amplification d’ADNc pleine longueur.

Mutagénèse dirigée

La mutagenèse dirigée permet de muter une séquence d’ADN à un endroit précis et nécessite donc

d’utiliser une polymérase haute-fidélité. Cette méthode consiste à modifier une base précise de la séquence

d’intérêt afin de modifier un acide aminé dans la séquence protéique lors de la traduction. Elle permet de

mettre en évidence l'importance d'un ou de plusieurs acides aminés essentiels pour la fonction ou la

régulation d’une protéine donnée. La technique utilisée est basée sur la technique dite de « Splicing by

Overlap Extension PCR » (SOE PCR) qui permet de fusionner des fragments d’ADN, ces derniers s’hybridant

entre eux grâce à des séquences complémentaires (Figure 41).

Pour générer une mutation ponctuelle, deux amorces complémentaires en forward et en reverse

sont créées en prenant soin d’insérer la base mutée au milieu de la séquence de l’amorce. Ensuite, deux

amplifications par PCR sont réalisées avec comme matrice le gène d’intérêt à modifier en utilisant d’une

part, le couple « amorce forward portant le codon ATG du gène et amorce reverse mutée » ; et d’autre part,

le couple « amorce forward mutée et amorce reverse portant le codon STOP du gène ». Les deux produits

d’amplification obtenus portent alors chacun la mutation désirée et sont complémentaires, leurs séquences

étant chevauchantes au niveau de la mutation. Ces deux produits sont ensuite liés entre eux par une étape

d’amplification PCR réalisée à l’aide du couple « amorce forward portant le codon ATG du gène et amorce

reverse portant le codon STOP du gène ». Le produit d’amplification généré porte alors la mutation et la

140

Tableau XXVI: Conditions d’amplification avec l’ADN polymérase PhireII®

Composition du milieu réactionnel Conditions d’amplification

Composés Volume en µl Etapes Durée Température

Eau stérile 17 Dénaturation initiale 30 sec 98 °C

Tampon 10X 5

dNTP 10 mM 0,5 Dénaturation 5 sec 98 °C

Amorces F+R 10 µM 1 Hybridation 5 sec 55 °C 40 cycles

ADNg dilué au 1/25

^ème

1 Elongation 20 sec 72 °C

Taq ADN polymérase PhireII

®

0,5

Volume total 25 Elongation finale 1 min 72 °C

Tableau XXVII : Enzymes de restriction utilisées pou la RFLP en fonction des amorces choisies

Couple d’amorces Enzyme de restriction Température

AML1-AML2 Hsp92II et HinfI 37 °C

ITS1-ITS4 MboI et TaqαI 37 °C et 65 °C

ITS1F-ITS4B MboI et TaqαI 37 °C et 65 °C

Tableau XXVIII : Conditions de digestion des séquences ITS en RFLP

Composés Volume (volume final = 15 μL)

Produit PCR à digérer 5 μL

Tampon de l’enzyme 10X 1,5 μL

BSA (sauf pour MboI) 100X 0,15 μL

Enzyme (1 U/µl) 0,1 μL

H

2

O qsp 15 μL

Incubation pendant 1 h à 37 °C (sauf TaqαI à 65 °C), puis 10 min à 65 °C pour arrêter l’activité

enzymatique (ajout de 3 μL de tampon de charge 6X pour l’électrophorèse)

3.6.5.3.3. PCR sur colonies

La PCR sur colonies, réalisée avec une polymérase standard, est une technique qui permet

d'amplifier de façon simple de l'ADN (génomique ou plasmidique) directement à partir de microorganismes

sans réaliser d’extraction d’ADN au préalable. L’étape de dénaturation initiale est allongée à 5 minutes, afin

de lyser les micro-organismes par l’effet de la chaleur et rendre ainsi l’ADN accessible. En général, cette

technique est utilisée afin de s’assurer que des transformants contiennent bien la construction plasmidique

d’intérêt.

3.6.5.3.4. Identification moléculaire de micro-organismes par amplification des régions

ITS

Amplification des séquences ITS

Afin d’identifier un micro-organisme, la région ITS du génome de cet organisme est amplifié. Les

régions ITS (Internal Transcribed Spacer) sont les séquences situées entre les gènes codant les sous-unités

des ARN ribosomaux (ARNr). Ces gènes sont en général très conservés d’un genre à l’autre et au sein d’une

même espèce. Ceci permet de générer des amorces dites « universelles ». En revanche, les régions ITS sont

peu conservées et varient d’une espèce à l’autre au sein d’un même genre, voire parfois d’une souche à

l’autre. Leur amplification et séquençage fournissent des données qui permettent alors de discriminer le

genre, l’espèce et parfois la souche du micro-organisme étudié par comparaison avec des bases de données.

Cette méthode a été utilisée pour l’identification de champignons en interaction avec les racines de

peupliers ainsi que pour l’identification de champignons en culture pure isolés à partir de racines ou de

carpophores. Les ADNg de racines de peupliers ou de mycélium contiennent de nombreux inhibiteurs de

PCR, ils ont donc été dilués au 25

^ème

afin de limiter la quantité d’inhibiteurs tout en conservant une quantité

d’ADN suffisante pour l’amplification. De même, l’ADN polymérase Phire II® (Finnzymes) a été utilisée pour

les amplifications car elle est peu sensible aux inhibiteurs de PCR. Les couples d’amorces utilisés et les

conditions de PCR pour amplifier les régions ITS sont résumés dans les tableaux XXIV et XXVI.

Discrimination des clones par « Polymorphisme de longueur des

fragments de restriction » (RFLP)

Lorsque l’amplification des séquences ITS est réalisée à partir de racines, le produit d’amplification

est un mélange de séquences provenant de divers micro-organismes. Afin de les séparer, une étape de

sous-clonage dans un vecteur (pGEM®-T (Promega)) est nécessaire, une seule séquence étant insérée par

plasmide. Ensuite, des bactéries sont transformées avec ces plasmides, chaque bactérie intégrant un seul

plasmide, puis les séquences ITS sont ré-amplifiées par PCR sur colonies. 48 clones par échantillon ont été

analysés permettant d’obtenir un maximum de profils RFLP différents.

Enfin, les produits de PCR sur colonies sont digérés par des enzymes de restriction (Tableaux XXVII,

XXVIII) capables de reconnaître et de couper des séquences spécifiques d’ADN. Les fragments de restriction

sont séparés selon leur taille par électrophorèse (gel d’agarose à 2,6 %). Une photographie des gels est

obtenue avec le logiciel Geldoc® afin de comparer les différents profils obtenus. L’ADN plasmidique d’un

exemplaire de chaque profil différent obtenu est extrait puis envoyé en séquençage.

Dans le document Filtration biologique pour la réduction des éléments traces métalliques dans la biomasse du peuplier (Page 163-169)