Les enregistrements de patch-clamp sur des cellules entières ont été effectués sur des neurones pyramidaux corticaux identifiés par anatomie. La lamelle couvre-objet a été transférée dans une chambre d'enregistrement montée sur la platine d'un microscope inversé Eclipse-Ti (Nikon).
Les pipettes à patchs ont été produites à partir de capillaires en verre borosilicate à paroi mince (Harvard Apparatus) sur un extracteur Zeitz DMZ et présentaient une résistance de 2 à 3 MΩ lorsqu'elles étaient remplies de la solution intracellulaire, contenant 10 mM de KCl, 130 mM de K-gluconate et 2 mM de MgCl2. CaCl2 0,1 mM, ATP-Mg 4 mM, GTP 0,3 mM, phosphocréatine Na 10 mM, EGTA 1 mM et HEPES 10 mM, ajusté à pH 7,2 avec du KOH. La solution extracellulaire contenait du NaCl 140 mM, du KCl 3 mM, du MgCl2 1 mM, du CaCl2 2 mM, du
glucose 10 mM et du HEPES 10 mM ajusté à pH 7,3 avec NaOH. Les enregistrements de cellules entières ont été effectués en utilisant un Axopatch 200B (Molecular Devices). Les données ont été filtrées à l'aide d'un filtre Bessel à huit pôles à 2 kHz, puis numérisées à un taux d'échantillonnage de 50 kHz, avec une interface analogique-numérique Digidata 1440A. Les données ont été acquises avec le logiciel pClamp 10 (Molecular Devices). Les transitoires de capacité ont été annulés. La résistance en série était typiquement comprise entre 5 et 7 MΩ et était compensée par au moins 70% pour les expériences en « voltage clamp ». Seules les cellules avec un Rs ≤ 10 MΩ et un potentiel de membrane au repos (RPM) plus hyperporlarisé que -20mV ont été incluses dans l'analyse des données. La résistance à l'accès a été contrôlée à la fin de l'expérience et les cellules ont été rejetées si la résistance en série change de plus de 20%. En mode « current clamp », les potentiels de maintien ont été corrigés pour un potentiel de jonction liquide calculé de 15 mV. Le potentiel de membrane au repos a été déterminé en effectuant une moyenne pendant 30 s d'enregistrement, puis un courant de maintien a été utilisé pour fixer le potentiel de membrane au repos le plus près possible de -70 mV. Les protocoles de fixation de tension et de courant sont fournis dans la section des résultats. Des enregistrements de cellules entières ont été effectués sur des neurones du groupe témoin et du groupe expérimental en parallèle le même jour. Seuls les neurones présentant une expression identifiée visuellement de reporters fluorescents ont été ciblés pour le patch. Les enregistrements électrophysiologiques ont été effectués à la température ambiante (22-24 ° C).
VII. Multiple Electrode Array.
Les tranches ex vivo d’hippocampes sont obtenues à partir de souris âgées de 8 mois ou 20 jours, mâles et femelles, Wild-type, et homozygotes Knock-Out pour le gène SPG11 (respectivement Spg11 WT, Spg11-/-). Conformément à la procédure approuvée par le comité d’éthique, les souris sont anesthésiées par injection intrapéritonéale de Pentobarbital (140 mg/kg) et perfusées en ACSF (Artificial CerebroSpinal Fluid) dit « de coupe » à froid (0-2°C) légèrement modifiée dont la composition sera maintenue secrète car en ours de publication. Toujours à froid, les tranches de 350μm d’épaisseur sont coupées en transversales à l’aide d’un VibraTome Leica
Les coupes sont ensuite transférées dans une solution à 35°C d’ACSF « de coupe » pendant 10 minutes avant d’être mises pour repos dans une solution à température ambiante d’ACSF dite « de stockage » -dont la composition est elle aussi en cours de publication.
Pour l’enregistrement en MEA, les coupes d’hippocampe ont été transférées dans une chambre d’enregistrement MED64 (Alpha MED Scientific Inc., Japan). La distance inter-électrode des chambres utilisées est de 150μm et la chambre est perfusée à raison de 3mL/min continuellement par une solution d’ACSF à 119 mM NaCl, 5mM KCl, 2.5 mM CaCl2, 1.3 mM MgCl2, 9.3 mM KH2PO4, 25 mM NHCO3, and 5 mM glucose, maintenue à 32°C.
NB : Toutes les solutions utilisées sont saturées à 95% O2/5% CO2
Les Potentiels post-synaptiques locaux (fPSP) sont enregistrés dans le stratum Pyramidale et Stratum radiatum de la région CA1 en utilisant un système de MEA system (MED64, Alpha MED Sciences). Plus précisément, les fPSPs (Field Post-Synaptic Potentials) ont été obtenus par stimulation des Collatérales de Schaffer avec des impulsions de courant biphasique (de 200μs). La courbe Input/Output (I/O) est obtenue par une séquence de stimulation croissante en amplitude de 10 à 100μA (Avec un pas de 10 μA).
L’amplitude de stimulation utilisée pour obtenir les fPSP durant les protocoles de PPR et la ligne de base de la LTP et est celle correspondant alors à 50% de la réponse maximum obtenue par l’I/O. La Paired Pulse Facilitation est appliquée par l’utilisation de séquences avec un intervalle d’inter-pulse variant de 20 à 200ms. Le pourcentage de facilitation a été calculé en divisant la pente ou l’amplitude du fEPSP provoquée par la deuxième impulsion par la pente FPE provoquée par la première impulsion. Le protocole de LTP consiste en 2 stimulations à 50ms d’intervalle à la fréquence de 0,1 Hz. Après l’obtention d’une ligne de base stable d’au moins 15 minutes, la LTP est induite par une stimulation à haute fréquence (HFS) consistant en 2 salves de 100Hz pendant une seconde chacune avec 5 secondes d’intervalle et d’intensité 70-80% de la réponse maximale obtenue par la courbe I/O. Pour s’assurer de la spécificité du signal et de la viabilité des tranches, une seconde électrode est sélectionnée entre le subiculum et le CA1 pour obtenir une réponse à la stimulation qui soit indépendante de la réponse CA3CA1 (appelée stimulation F2).
La LTP est mesurée par le pourcentage de changement de la pente initiale (mesurée entre 10-40% du fEPSP) et l’Amplitude pic à pic du signal qui sont évalués pendant 60 minutes après la
HFS. Les données sont filtrées à 1kHz, digitalisées à 20kHZ et analysées par le Mobius software (Alpha Med Scientific). Les analyses quantitatives ont été faites sur Microsoft Excel et SigmaPlot. Les données sont exprimées comme la Moyenne ± Standard Error of Mean (Erreur standard ou S.E.M). L’expérimentateur a manipulé en aveugle concernant le génotype des souris utilisées pour l’acquisition et l’analyse.
VIII. Immunohistochimie.
Pour l'immunohistochimie, des souris âgées de 4 et 8 mois ont été sacrifiées par une injection intrapéritonéale d'Euthasol VET®, un contrôle de qualité de l'anesthésie a été réalisé par pincement de la queue. Les souris ont été perfusées avec 10 ml de PBS 1X puis 50 ml de paraformaldéhyde (PFA) à 4% (m/v) et le cerveau a été prélevé pour fixation après une heure dans du PFA à 4% (m/v), puis rincé dans du PBS. Des tranches de 20 µm ont été coupées dans une solution de saccharose à 30% sur un microtome à congélation (Microm HM450 ThermoFischer scientific) et conservées dans du PBS + NaN3 à 0,02% (m/v) jusqu'à utilisation. Pour assurer la couverture de l’ensemble du cortex moteur primaire, nous avons regroupé 5 niveaux équidistants de tranches allant de +1,42 mm du bregma à -1,70 mm du bregma. Les tranches ont été maintenues 1 heure dans une solution de blocage composée de BSA à 2% (m / v), de sérum d'âne à 10% (m / v), de NaN3 à 0,02% (m / v), de Triton X100 à 0,2% (v / v) PBS. Les tranches ont été incubées avec des anticorps primaires dans une solution de blocage pendant une nuit à 4 ° C sous agitation. Après lavage, les tranches ont été incubées une heure avec des anticorps secondaires dans du PBS à température ambiante et montées avec de l'Aqua-Poly/mount (Polysciences: 18606). Les anticorps utilisés en immunohistochimie étaient les suivants: αSST D20 de chèvre (santacruz: sc7819, 1: 500), αPV d'IgG1 de souris (Sigma-Aldrich: P3088, 1: 1000). Pour la coloration NissL, nous avons utilisé le colorant fluorescent vert Nissl NeuroTrace ™ 500/525 (Invitrogen: N21480). Les anticorps secondaires utilisés pour l'immunohistochimie ont tous été achetés chez Life technologies et utilisés au 1/1000. Les images fluorescentes corticales ont été obtenues avec un AxioCan MRm monté sur un Zeiss Imager.M2 avec le module ApoTome.2 avec un objectif X20 utilisant le logiciel Zen2 Pro. La surface des couches corticales a été déterminée avec Icy V1.9.10.0
IX. Extraction ARN et RT-qPCR.
Les ARN récoltés pour l’évaluation quantitative de l’expression des gènes impliqués dans l’Epilepsie d’Absence ont été extraits à partir de cortex rostraux de souris mâles et femelles Spg11 WT et -/- à 4 et 8 mois (n=4 pour chaque condition). Nous les avons extraits en utilisant un kit: RNeasy® Lipid Tissue Mini Kit (Qiagen : #74804) avec une étape de digestion à la DNase. La quantité d’ARN dans chaque échantillon a été mesurée au Nanodrop et leur qualité a été évaluée par mesure du RIN (RNA integrity) via l’Agilent 2200 TapeStation system. En moyenne, les échantillons ont présenté un RIN moyen de 8,0. La réaction de reverse transcription a été réalisée avec le kit Maxima First Strand cDNA Synthesis (Thermofischer : #K1641). Pour chaque gène étudié, deux paires d’amorces différentes ont été utilisées. Leur séquence a été définie par l’intermédiaire de deux banques différentes : PrimerBank et GetPrime. Pour qu’il soit compris dans l’analyse, un couple de primer doit présenter des séquences chevauchants deux exons. Seul le couple de primer respectant cette règle et présentant la plus faible Standard Deviation (SD) sera conservé. La préparation des échantillons, leur distribution en plaques 1596 puits et la réaction qPCR ont été réalisées par la plateforme de séquençage-génotypage de l’Institut du Cerveau et de la Moelle Epinière. La réaction de qPCR a été réalisée en triplicat en utilisant le kit LightCycler 1536 DNA Green Master (Roche : #05573092001). Le suivi de la réaction en temps réel a été réalisé grâce au LightCycler® 1536 Instrument (Roche : # 05334276001) et les données brutes ont été générées par le programme correspondant : LightCycler1536 SW. Les résultats sont exprimés en Quantification Relative.
X. Statistiques.
Tous les tests statistiques ont été effectués via Graphpad Prism 5. Toutes les valeurs sont affichées en tant que moyennes ± SEM dans chaque groupe. WT et Spg11 -/- Les groupes de données WT et Spg11-/- ont été comparés à l'aide du test de Mann-Whitney. La comparaison des effets liés aux médicaments en fonction de la dose a été réalisée à l'aide d'un test Two-way ANOVA et d'un post-test de Bonferroni. ns: p> 0,05. *: p <0,05. **: p <0,01. ***: p <0,001