Enregistrement et stimulation endocavitaire chez la souris

Chez la souris, l’étude électrophysiologique (EEP) in vivo a été fréquemment utilisée pour évaluer la vulnérabilité aux arythmies ainsi que le phénotype électrophysiologique des différentes lignées de souris transgéniques en recherche rythmologique (Berul et al., 1996-1997-2001). Les cathéters multipolaires permettent un recueil de l’activité électrique intracardiaque et l’analyse de sa propagation. Les protocoles de stimulation cardiaque ont été appliqués au niveau auriculaire et ventriculaire, permettant la détermination des périodes réfractaires aux différents étages et le déclenchement des tachycardies. Lors de l’EEP, plusieurs modèles transgéniques murins ont montré un taux élevé de tachycardies par rapport aux souris sauvages (Berul et al., 1997 ; Korte et al., 2002).

La stimulation auriculaire permet d’étudier :

¾ La conduction auriculo-ventriculaire (intervalle AH et point de Wenckebach) ¾ La conduction du système His - Purkinje (intervalle HV)

¾ Le temps de récupération sinusale corrigé (TRS), le temps de conduction sino- auriculaire (TECASA) et les effets des interventions physiologiques et pharmacologiques.

L’utilisation du même mode de stimulation au niveau ventriculaire permet d’étudier la conduction nodale rétrograde et de déterminer les périodes réfractaires ventriculaires.

Protocole expérimental

Les souris sont anesthésiées par injection intrapéritonéale (IP) d'étomidate à une dose de 25 mg/kg ou par Isoflurane 2.5%. Un ECG de surface D1 est enregistré pendant 3 minutes à l’aide de deux électrodes sous-cutanées de calibre 25 Gauge.

Une analgésie est ensuite réalisée par injection sous cutanée de Nubain 3 μg/kg. Si nécessaire, une dose d’étomidate est ajoutée (10 mg/kg, voie IP).

Une anesthésie locale par injection de xylocaine 1% (dose 40mg/kg) sous-cutanée est réalisée à la droite du cou, et la veine jugulaire droite isolée comme le montre la figure ci-dessous.

Une sonde octapolaire 2F avec un espacement inter-électrodes de 0.5 mm (Cordis Webster®, USA – pour l'ablation du faisceau de His, modèle de BAVc chez la souris) ou une sonde octapolaire 1.2 F (étude d’EEP conventionnelle) est introduite dans le cœur via la veine jugulaire droite.

A B

Figure 28 : A : La sonde octapolaire 2F avec 8 électrodes (4 électrodes de petite surface 1,2,5,6 – utilisées pour la stimulation et 4 électrodes de grande surface 3,4,7,8 - utilisées pour l’ablation

par radiofréquence). B : L’entrée de la sonde dans la veine jugulaire qui a été fixée par les fils stériles 5.0 non résorbables.

L’électrocardiogramme de surface (dérivation D1) est enregistré avec deux électrodes sous-cutanées. Ensuite, la sonde d’exploration est positionnée afin d'obtenir l’enregistrement du faisceau de His ainsi que l’électrogramme atrial et ventriculaire. L'ECG de surface D1 et l'électrogramme intracardiaque sont enregistrés sur un ordinateur à l'aide d'un convertisseur analogique-numérique (IOX 1.585, Emka Technologies) pour monitorage et analyse ultérieure avec le logiciel ECG-Auto (Emka Technologies).

La stimulation ventriculaire programmée est réalisée avec un stimulateur UHS 20 Biotronik (Nantes) ou Matlab C++, 509 Stimulator, Grass Telefactor (ICM). Le seuil de stimulation, correspondant à l’énergie minimale entraînant une dépolarisation ventriculaire, est déterminé et les stimulations sont ensuite effectuées à une intensité une fois et demi supérieure à ce seuil. La durée d’impulsion est réglée à 1 ms puis la période réfractaire ventriculaire effective est déterminée. Les protocoles de stimulation utilisés sont calqués sur les protocoles validés en pratique clinique humaine, adaptés aux fréquences cardiaques des souris. On applique d’abord un train de 9 stimuli à 100 ms de couplage suivis de un extra-stimulus avec un intervalle de couplage décroissant progressivement par pas de 2 ms à partir de 100 ms jusqu’à obtention de la période réfractaire. Chaque stade est répété deux fois pour s’assurer de sa reproductibilité.

2.4 Injection intracardiaque 2.4.1 Formulation des plasmides

Tous les plasmides utilisés ont la séquence promotrice du cytomégalovirus (CMV) : le plasmide pcIK-CAT, contenant le gène codant la chloramphénicol acétyle transférase (CAT), et les plasmides pcDNA3-mHnc2 et pcDNA3-Adrb2, contenant respectivement les séquences codantes des gènes murins du canal pacemaker Hcn2 et du récepteur 2-adrénergique (Adrb2). Le plasmide pcDNA3 ne contenant aucune cassette d’expression est utilisé pour les souris sham.

La formulation de l’ADN plasmidique avec le tétronic 304, une poloxamine fournie par BASF (Mount Olive, NJ), est préparée sous forme d’un mélange

équivolumique de tétronic 304 (10% dans de l’eau) et d’ADN plasmidique (25% de plasmide pcDNA3-Adrb2 et 75% de plasmide pcDNA3-mHcn2) dans du Tyrode.

2.4.2 Manipulation des souris

2.4.2.1 Injection des transgènes

Les souris mâles adultes sont anesthésiées par une injection intrapéritonéale de kétamine (100 mg/kg ; Imalgène 500®, Mérial, France) et de xylazine (20 mg/kg; Rompun 2%, Bayer Pharma, France). Une analgésie est obtenue par injection sous- cutanée de 1 mg/kg de nalbuphine (Nubain ®, CERB, France). Les souris sont ventilées à 140 cycles/min à l’aide d’un ventilateur (Minivent Type 845, Hugo Sachs Electronik). La température corporelle est maintenue à 37oC avec un tapis chauffant. Après la thoracotomie gauche dans le cinquième espace intercostal, chaque souris reçoit une injection de 10 μL de solution d’ADN-tétronic 304 avec une seringue Hamilton (aiguille de 30 gauges) dans la paroi du ventricule gauche.

2.4.2.2 Suivi à long terme

Le principal avantage du transfert de gène de l’origine du pacemaker biologique dans notre modèle est qu’il est aisé de suivre son fonctionnement par un simple ECG de surface à des dates définies.

2.4.2.3 Evaluation du gène rapporteur

Deux, 3, 5 et 8 jours après injection du plasmide pCIK-CAT (31 μg/10 μl), les cœurs des souris sont disséqués, congelés dans l’azote liquide et homogénéisés dans 1 ml de tampon de lyse (Proméga, Charbonnière, France), supplémenté avec un mélange d’inhibiteurs de protéases (Proméga). Après centrifugation à 10000 tours/min pendant 5 minutes, l’activité de la CAT est mesurée à partir d’un aliquot de surnageant grâce au lecteur de plaques à marqueurs multiples VICTORS2 (PerkinElmer, Les Ulis, France), en utilisant un kit ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay, Promega, Madison, WI, USA). Chaque échantillon de cœur est analysé en duplicat. L’activité de la CAT, c'est-à- dire son niveau d’expression, est déterminée dans 200 μl de surnageant, en accord avec les instructions du fournisseur.

2.4.2.4 Immunohistochimie

Juste après l’euthanasie des souris, les cœurs sont prélevés, rincés dans du PBS, et séchés. Le cœur est ensuite fixé dans du Tissue-Tek® (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA), plongé dans de l’isopentane refroidi au contact de l’azote liquide. L’organe est ensuite coupé au cryostat en fines sections de 8 μm récupérées sur des lames de verre. Les coupes sont finalement fixées par un bain d’acétone pendant 10 min, puis stockées à -80oC pendant 12h.

Pour les expériences d’immunomarquage, l’anticorps primaire utilisé est l’anticorps anti-GFP polyclonal (rabbit) (Chemicon, CA, USA). Cet anticorps est ensuite couplé à l’anticorps anti-rabbit IgG-Biotinylé (Sigma, St Louis, MO, USA), puis à la Streptavidine-HRP (Dako Cytomacion, Denmark).

2.5 Ablation du faisceau de His par radiofréquence