1. Effet des peptides sur la distribution du cholestérol-pyrène dans
les membranes désordonnées L
d(PC)
Pour les membranes composées de phosphatidylcholine (PC), l’effet des peptides sur la formation d’excimères en fonction d’une augmentation et d’une diminution de température se traduit par une baisse de la quantité d’excimères après l’ajout des trois peptides (Figure 72.).
Figure 72. Rapport de fluorescence exc/iso en fonction de la température pour les membranes PC. Pour les peptides au ratio P/L 1/10 (A) en montée de température et (B) en descente de température. Et pour les peptides au ratio P/L 1/25 (C) en montée de température et (D) en descente de température. Noir, les membranes PC ; rouge, en présence de pénétratine ; vert, en présence de R9 et violet, en présence de RW9.
Le peptide R9 est celui qui réduit le plus la quantité d’excimères par rapport au témoin. Ensuite vient le peptide RW9 puis la pénétratine qui montre l’effet le plus faible. Les effets sont similaires pour les deux rapports peptide/lipide : 1/10 et 1/25 mol/mol. Lors du chauffage de 10°C à 35°C, il y a une augmentation du nombre d’excimères, puis on observe un plateau à partir de 35°C, alors qu’en refroidissement l’allure est plus linéaire. L’analyse du rapport 𝐂𝐏𝐲𝐋𝐨
𝐂𝐏𝐲𝐋𝐝 montre que lors du chauffage, au ratio 1/10 (P/L mol/mol),
les peptides RW9 et R9 augmentent ce rapport 𝐂𝐏𝐲𝐋𝐨 𝐂𝐏𝐲𝐋𝐝 . Cependant, au rapport P/L de 1/25 (mol/mol), seul R9 montre un effet remarquable lors de la montée en température où le rapport 𝐂𝐏𝐲𝐋𝐨 𝐂𝐏𝐲𝐋𝐝 augmente (Figure 73).
Figure 73. Rapport CPyLo/CPyLd en fonction de la température dans les membranes PC. Pour les peptides au ratio P/L 1/10 (A) en montée de température et (B) en descente de température. Et pour les peptides au ratio P/L 1/25 (C) en montée de température et (D) en descente de température. Noir, les membranes PC ; rouge, en présence de pénétratine ; vert, en présence de R9 et violet, en présence de RW9.
En ce qui concerne l’effet des peptides lors du refroidissement des membranes il apparaît qu’ils ont tous une légère tendance à augmenter le rapport 𝐂𝐏𝐲𝐋𝐨 𝐂𝐏𝐲𝐋𝐝 sur les membranes PC.Au rapport P/L 1/10, R9 présente l’effet le plus fort en augmentant le rapport 𝐂𝐏𝐲𝐋𝐨
𝐂𝐏𝐲𝐋𝐝 tandis qu’à basse concentration en peptide P/L 1/25, la plus forte
augmentation est obtenue avec RW9.
2. Effet des peptides sur la distribution du cholestérol-pyrène dans
les membranes ordonnées L
o(SM/Chol)
Dans les membranes SM/Chol, la formation d’excimères en fonction de la température (chauffage et refroidissement) a également montré que les peptides R9 et RW9 entrainent une diminution de la quantité relative d’excimères. En revanche, la pénétratine semble ne pas avoir d’effet (Figure 74).
Figure 74. Rapport exi/iso en fonction de la température pour les membranes SM/Chol. Pour les peptides au ratio P/L 1/10 (A) en montée de température et (B) en descente de température. Et pour les peptides au ratio P/L 1/25 (C) en montée de température et (D) en descente de température. Noir, les membranes PC ; rouge, en présence de pénétratine ; vert, en présence de R9 et violet, en présence de RW9.
La Figure 75 montre des effets différents sur le rapport 𝐂𝐏𝐲𝐋𝐨 𝐂𝐏𝐲𝐋𝐝 lors de la montée et de la descente en température. Lors du refroidissement, les peptides R9 et surtout RW9 au ratio P/L de 1/10 (mol/mol) ont entraîné une baisse du rapport 𝐂𝐏𝐲𝐋𝐨
𝐂𝐏𝐲𝐋𝐝 . Au ratio 1/25,
l’effet persiste mais est de plus faible ampleur. Avec le protocole de chauffage, les effets des peptides ne sont pas très clairement définis. Au rapport 1/25, R9 et RW9 semblent augmenter le ratio 𝐂𝐏𝐲𝐋𝐨
𝐂𝐏𝐲𝐋𝐝 à des températures inférieures à 35°C. Cependant, il est plus
difficile de conclure sur les effets des peptides du fait d’une faible différence. Les membranes SM/Chol sont donc globalement plus résistantes aux effets des peptides.
Figure 75. Rapport CPyLo/CPyLd en fonction de la température pour les membranes SM/Chol. Pour les peptides au ratio P/L 1/10 (A) en montée de température et (B) en descente de température. Et pour les peptides au ratio P/L 1/25 (C) en montée de température et (D) en descente de température. Noir, les membranes PC ; rouge, en présence de pénétratine ; vert, en présence de R9 et violet, en présence de RW9.
3. Effet des peptides sur la distribution du cholestérol-pyrène dans
les membranes avec des domaines L
oet L
d(PC/SM/Chol)
Afin de nous rapprocher de l’environnement des membranes biologiques, des LUV avec des domaines Lo et Ld ont été utilisés (PC/SM/Chol). Une diminution de la quantité d’excimères pour tous les peptides a été constatée mais à différent niveau. Que ce soit en chauffant ou en refroidissant, aux rapports P/L 1/25 ou 1/10, la diminution d’excimères en fonction des peptides présentent des caractéristiques différentes. En effet, comme le montre la Figure 76, la plus forte diminution a été obtenue avec R9. RW9 a un effet un peu plus faible que celui de R9, et avec la pénétratine, la diminution du nombre d’excimères est encore moins importante (Figure 76).
Figure 76. Rapport exi/iso en fonction de la température pour les membranes PC/SM/Chol. Pour les peptides au ratio P/L 1/10 (A) en montée de température et (B) en descente de température. Et pour les peptides au ratio P/L 1/25 (C) en montée de température et (D) en descente de température. Noir, les membranes PC ; rouge, en présence de pénétratine ; vert, en présence de R9 et violet, en présence de RW9.
Le comportement du rapport 𝐂𝐏𝐲𝐋𝐨 𝐂𝐏𝐲𝐋𝐝 est plus complexe dans les membranes avec la coexistence des phases Lo et Ld (PC/SM/Chol) que dans les membranes PC et SM/Chol. Pour les membranes PC et SM/Chol (type Ld et Lo « pures »), les effets des peptides aux rapports P/L 1/10 et 1/25 sont cohérents, que ce soit en chauffant ou en refroidissant. Cependant, pour les membranes PC/SM/Chol les effets aux rapports P/L 1/10 et 1/25 sont différents. En comparant les courbes lors du refroidissement et lors du chauffage, il apparaît qu’au ratio P/L 1/10, les effets des peptides sur 𝐂𝐏𝐲𝐋𝐨 𝐂𝐏𝐲𝐋𝐝 sont similaires à ceux observés dans les LUV SM/Chol (Lo). En revanche, il apparaît qu’au ratio 1/25, les effets des peptides sont similaires à ceux observés dans les membranes PC (Ld). Cela signifie qu’à basse concentration, les peptides modifient préférentiellement les domaines PC (Ld) tandis que pour modifier les domaines SM/Chol (Lo) il faut une plus grande concentration de peptides (Figure 77).
De plus, pour les peptides à haute concentration (1/10 mol/mol), le peptide R9 a un rapport 𝐂𝐏𝐲𝐋𝐨
𝐂𝐏𝐲𝐋𝐝 plus petit pendant le chauffage. A basse concentration (1/25 mol/mol),
R9 augmente le rapport 𝐂𝐏𝐲𝐋𝐨 𝐂𝐏𝐲𝐋𝐝 . Les peptides pénétratine et RW9 ne présentent pas d’effet lors du chauffage. Lors du refroidissement, le rapport 𝐂𝐏𝐲𝐋𝐨
𝐂𝐏𝐲𝐋𝐝 augmente avec R9
et RW9. Nous pouvons aussi observer que le rapport 𝐂𝐏𝐲𝐋𝐨 𝐂𝐏𝐲𝐋𝐝 est assez linéaire pour les membranes PC et SM/Chol ce qui n’est pas le cas pour les membranes PC/SM/Chol qui présentent une rupture de pente autour de 30°C suggérant une coexistence de phases contenant du cholestérol-pyrène.
Figure 77. Rapport CPyLo/CPyLd en fonction de la température pour les membranes PC/SM/Chol. Pour les peptides au ratio P/L 1/10 (A) en montée de température et (B) en descente de température. Et pour les peptides au ratio P/L 1/25 (C) en montée de température et (D) en descente de température. Noir, les membranes PC ; rouge, en présence de pénétratine ; vert, en présence de R9 et violet, en présence de RW9.
Conclusion
Le Tableau 7 récapitule les effets globaux des peptides sur les différentes membranes :
Membrane Peptide 𝐄𝐱𝐜 𝐈𝐬𝐨 𝐂𝐏𝐲𝐋𝐨 𝐂𝐏𝐲𝐋𝐝 PC R9 ↓↓↓ ↑↑↑ RW9 ↓↓ ↑ 𝑜𝑢 ≈ Pénétratine ↓ ↑↑ SM/Chol (1/1) R9 ↓↓↓ ↓ RW9 ↓↓↓ ↓ Pénétratine ≈ ≈ PC/SM/Chol (1/1/1) R9 ↓↓↓ BC : ↑↑ HC : ↓↓ RW9 ↓↓ BC : ↑ HC : ↓ 𝑜𝑢 ≈ Pénétratine ↓ BC : ↑ HC : ↑ 𝑜𝑢 ≈
Tableau 7. Tableau récapitulatif des résultats des effets des peptides sur la réorganisation du cholestérol-pyrène. BC : Basse concentration des peptides, ratio P/L 1/25 et HC : haute concentration P/L 1/10.
Nos expériences montrent que les peptides agissent différemment selon les propriétés physico-chimiques de la membrane puisque nous constatons des changements des domaines autour du cholestérol-pyrène. Nous voyons un changement dans le spectre de fluorescence du cholestérol-pyrène et de fait nous en déduisons que la membrane se réorganise, puisque le cholestérol-pyrène est mimétique du cholestérol. Nous avons
émis des hypothèses afin d’expliquer la baisse d’excimères ainsi que l’augmentation du ratio 𝐂𝐏𝐲𝐋𝐨 𝐂𝐏𝐲𝐋𝐝 . Une manière de déterminer la meilleure hypothèse pour chaque membrane est d’associer les rapports 𝐄𝐱𝐜
𝐢𝐬𝐨 et 𝐂𝐏𝐲𝐋𝐨 𝐂𝐏𝐲𝐋𝐝 .
Nous avons vu que la pénétratine présente un effet moindre dans le nombre d’excimères du cholestérol-pyrène, tandis que R9 et RW9 montrent une diminution d’excimères plus marquée. Pour interpréter cette diminution, trois hypothèses peuvent être proposées :
1. Soit la contribution des domaines riches en cholestérol (caractère Lo) augmente et le cholestérol-pyrène se dilue dans ces domaines (moins d’excimères) ; 2. Soit la contribution des domaines riches en cholestérol est constante et le
cholestérol-pyrène devient monomère à l’intérieur de cette zone ;
3. Soit le cholestérol-pyrène quitte les domaines riches en cholestérol, avec une éventuelle réduction de ces zones.
Afin d’expliquer l’augmentation du ratio 𝐂𝐏𝐲𝐋𝐨
𝐂𝐏𝐲𝐋𝐝 pour le cholestérol-pyrène sous forme de
monomère, deux mécanismes sont envisageables :
• Soit un monomère se déplace vers une zone à caractère Lo plus importante que l’environnement dans lequel il se trouvait précédemment ;
• Soit un cholestérol-pyrène quitte un excimère pour se positionner dans une zone dont le caractère Lo est plus important que la moyenne pour des monomères. L’approche suivie a ses limites qui nous empêchent de sélectionner une de ces hypothèses (schématisées dans la figure 78) et il serait nécessaire d’avoir une technique qui présente plus de finesse et de résolution dans le temps, comme par exemple des approches faisant intervenir la résonance paramagnétique électronique sur des phases à l’échelle de la nanoseconde, ou bien la fluorescence résolue dans le temps. Ainsi, afin de mieux comprendre les phénomènes ayant lieu dans la membrane avec cette sonde, nous avons étudié les variations d’anisotropie, l’objectif étant de mieux cerner le mouvement du cholestérol-pyrène dans la membrane.
Figure 78. Modèle du mouvement du cholestérol-pyrène dans une situation d’augmentation d’excimères en haut et de diminution d’excimères en bas. Les différents modes de redistribution du cholestérol-pyrène peuvent avoir des conséquences sur le rapport CPyLo/CPyLd comme illustré tout en haut et en bas des schémas.