Ma thèse a porté sur CISD2 humaine. Cette protéine à centre [2Fe-2S], tout comme mitoNEET et CISD3, appartient à la famille des protéines NEET. Cette famille de protéines est caractérisée par la coordination atypique de leur centre [Fe-S] par 3 cystéines et une histidine. Cette coordination atypique confère une labilité au centre qui lui permet d’être transféré, au moins in
vitro, à une apo-protéine réceptrice sous contrôle de son état d’oxydation (seule la forme oxydée
du centre peut être transférée). CISD2 est une protéine homodimérique avec un centre [2Fe-2S] par sous-unité. Son domaine N-terminal transmembranaire l’ancre à la membrane du réticulum endoplasmique au niveau des sites de contact avec la mitochondrie. La majeure partie de CISD2, dont le site de coordination du centre [Fe-S], est cytosolique. Ce domaine cytosolique est très proche en séquence et en structure de celui de mitoNEET (90% d’identité entre les protéines humaines). Dans les deux cas, la structure cristallographique du domaine cytosolique montre deux domaines : un domaine β-cap et un domaine de fixation du centre [2Fe-2S]. Ces deux protéines étant si proches en structure et en séquence, j’ai eu la curiosité de comparer en premier lieu la stabilité de leurs centres et l’effet de certaines molécules sur cette stabilité. J’ai remarqué clairement que, en présence d’oxygène, la stabilité du centre [Fe-S] de CISD2 est plus faible aux pHs acides qu’aux pHs proches de la neutralité, tout comme mitoNEET. Cependant CISD2 est beaucoup moins sensible aux variations de pH que mitoNEET. Des résultats similaires avaient été publié en 2009 (Conlan et al., 2009b).
Figure 97 : Comparaison des temps de demi vie (t1/2) de la stabilité des centres [Fe-S] de CISD2 et mitoNEET en présence d’oxygène en fonction du pH.
80 4000 5.7 5.9 6.1 6.3 6.5 6.7 6.9 7.1 t1/ 2 (m inu tes ) pH
CISD2
mitoNEET
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La première molécule dont j’ai étudié l’effet sur la stabilité du centre [Fe-S] de CISD2 est le GSH, molécule extrêmement importante pour l’homéostasie rédox de la cellule. Cet effet avait été étudié précédemment avec mitoNEET au sein de notre équipe. Plusieurs phénomènes distincts avaient été mis en évidence. A pH neutre, le GSH n’a pas d’effet en aérobie tandis qu’en anaérobie, une réduction partielle du centre [Fe-S] est observée. A pH plus acide, le GSH induit une déstabilisation du centre S] tandis qu’à pH 5,8, il semble ligander le centre [Fe-S] de mitoNEET (l’histidine ligand à pH acide devient alors un très mauvais ligand du centre [Fe-S] et le GSH semble alors prendre sa place). C’est pour cela que j’ai voulu étudier son effet sur CISD2. Le GSH diminue très clairement la stabilité du centre [Fe-S] de CISD2. Plus le pH est acide, plus CISD2 est sensible en présence du GSH. Cependant, tout comme pour la stabilité du centre en présence d’oxygène, la sensibilité de CISD2 au GSH est moins fortement dépendante du pH.
A pH 5,8 je n’observe pas d’indication d’une implication du GSH dans la coordination du centre [Fe-S] de CISD2. Il avait été montré aussi au laboratoire que le centre [Fe-S] de mitoNEET est très stable vis-à-vis d’H2O2. Cette stabilité du centre est beaucoup plus élevée que celles d’autres protéines capables de transférer leur centre [Fe-S] comme IscU, impliquée dans la biogenèse des centres [Fe-S] ou encore SufB, impliquée dans cette même biogenèse mais en condition de stress (Blanc et al., 2014). Cette très grande stabilité du centre [Fe-S] de mitoNEET a conduit à un modèle dans lequel mitoNEET est impliquée dans la réponse de la cellule au stress (Ferecatu et al., 2014). Je me suis alors demandé si CISD2 présentait aussi une telle résistance au stress oxydant. J’ai remarqué que, comme mitoNEET, plus le pH est acide, plus CISD2 est sensible à H2O2 en anaérobie tandis qu’il n’a pas d’effets a des pH neutres. Ainsi en comparant avec mitoNEET, on remarque que les deux protéines sont très résistantes au stress oxydant. pH t 1/2CISD2 (min) t 1/2 mitoNEET (min) 6,2 15 17 6,7 52 50 8 > 10 000 > 10 000
Figure 98 : Comparaison des temps de demi-vie (t1/2) de CISD2 et de mitoNEET en présence du H2O2 (250 µM).
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IscU SufB mitoNEET/CISD2
70 équivalents (éq.) d’ H2O2
T 1/2 <5 min T 1/2 ≈ 10 min Pas/très peu d’effet
Stabilité - + ++++
Figure 99 : Comparaison des temps de demi-vie (t1/2) de CISD2 et de mitoNEET avec d’autres protéines a centre [Fe-S] en présence du H2O2 à pH 8 (Blanc et al., 2014) Ainsi, tout comme mitoNEET, le centre [Fe-S] de CISD2 est très résistant au stress oxydant. Donc nous pouvons envisager que CISD2 puisse être impliquée dans une réponse à un stress oxydant.
Une étude par RMN réalisée au laboratoire avait montré que la perte du centre [Fe-S] de mitoNEET induisait une déstructuration de la protéine. Ainsi, le centre [Fe-S] est clairement nécessaire au repliement de mitoNEET (Ferecatu et al., 2018). J’ai décidé d’utiliser le dichroïsme circulaire afin de voir l’effet de la perte du centre [Fe-S] de CISD2 sur la structuration globale de la protéine. Cette technique a l’avantage de ne pas nécessiter de marquage de la protéine comme la RMN. Ainsi, j’ai pu suivre d’un côté la signature du centre [Fe-S] (entre 300 et 700 nm) tout en regardant la composition en structure secondaire de la protéine (190 et 300 nm). Cette étude par DC n’ayant pas été faite précédemment sur mitoNEET, je l’ai réalisée directement sur les deux protéines. J’ai alors constaté que les deux protéines avaient des comportements similaires et que, tout comme pour mitoNEET, le centre [Fe-S] de CISD2 est crucial pour le repliement global de la protéine.
Une propriété commune aux protéines NEET est leur capacité à transférer leur centre [Fe-S] vers une protéine réceptrice ayant perdu son centre (apo-protéine). Cette capacité à transférer le centre [Fe-S] in vitro est très clairement démontrée pour les trois protéines NEET (Tamir et
al., 2015). Cécile Mons s’était focalisée sur le transfert in vitro du centre [Fe-S] de mitoNEET
vers une protéine modèle réceptrice, la ferrédoxine d’E. coli. Elle avait alors montré que ce transfert est direct et que deux centres [Fe-S] de mitoNEET (ce qui équivaut à un dimère de mitoNEET) sont nécessaires à la formation d’un centre [Fe-S] de même nucléarité sur la ferrédoxine, utilisée comme protéine réceptrice. Pour finir, elle avait montré que ce transfert ne peut se réaliser que si le centre [Fe-S] de mitoNEET est oxydée, que l’oxygène n’influence par
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la réaction et que cette même réaction est très sensible au pH. Ainsi, le transfert est très rapide à des pH d’environ 6 (t1/2 = 16 minutes) tandis que ce même transfert est très faible à pH 8. Il avait été proposé alors que mitoNEET était un interrupteur moléculaire (l’état d’oxydation du centre contrôle sa capacité à être transféré) mais aussi un senseur de pH (une faible variation du pH induisant un très fort effet sur la vitesse de transfert du centre (Golinelli-Cohen et al., 2016; Mons et al., 2018). J’ai donc réalisé l’étude du transfert du centre [Fe-S] de CISD2 vers l’apo-ferrédoxine pour pouvoir comparer les capacités de ces deux protéines à transférer leur centre.
Figure 100 : Comparaison des t1/2 de la réaction de transfert du centre [Fe-S] de CISD2 et mitoNEET vers la ferrédoxine d’E. coli à 25°C et 20 µM pour chacune des protéines.
J’ai alors constaté que la capacité de CISD2 à transférer son centre n’est que peu dépendante du pH. Ce résultat très important montre que contrairement à mitoNEET qui pourrait être considérée comme un donneur de centre [Fe-S] à pH acide (Zuris et al., 2011), CISD2 semble être un mauvais donneur de centre. CISD2 et mitoNEET sont très proches en séquences et en structures, cependant elles ont des comportements très différents autant sur le plan cellulaire que biochimique. CISD2 étant plus stable et sa stabilité moins dépendante des variations du pH, elle a une capacité inférieure que celle de mitoNEET à transférer son centre à une protéine réceptrice in vitro. Par contre, ces deux protéines sont résistantes au stress oxydant, pouvant être impliquées dans la résistance/réponse à ce dernier.
Le Syndrome de Wolfram de type 2 est une maladie d’origine génétique induite par des mutations dans le gène CISD2. Je me suis intéressée à deux mutations ponctuelles récemment
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identifiées à savoir les mutations N72S et S104P. J’ai tout d’abord observé que ces deux mutations n’ont pas la même localisation par rapport au centre [Fe-S].
J’ai exprimé et purifié le domaine cytosolique de CISD2 avec soit la mutation N72S soit S104P suivant le même protocole que pour WT. La forme S104P ne s’exprime pas du tout. Ceci indique probablement une protéine non repliée dans E. coli qui est ensuite dégradée par les protéases bactériennes. La forme N72S se purifie sans trop de problème. Cependant, j’obtiens une protéine dépourvue de son centre [Fe-S]. J’ai cherché à réinsérer un centre [Fe-S] par reconstitution du centre [Fe-S]. J’ai ainsi obtenu une protéine de couleur jaune-vert qui présente un spectre d’absorption UV-visible compatible avec un centre [4Fe-4S] très instable en présence d’oxygène. Ainsi, cette forme mutée semble capable de coordiner un centre [Fe-S] ; cependant, les propriétés de ce dernier semblent très fortement affectées comparé à la protéine WT. Ainsi chez les patients portant cette mutation, CISD2 pourrait être affectée dans les propriétés de son centre [Fe-S]. Cette mutation parait ainsi très intéressante pour investiguer l’implication du centre [Fe-S] de CISD2 dans ses fonctions cellulaires.
Pour finir je me suis intéressée à l’interaction entre CISD2 et la protéine anti-apoptotique BCL-2. Cette interaction montrée dans les cellules n’avait été étudiée in vitro qu’à l’aide de peptides issus de BCL-2 (Tamir et al., 2014a). Si cette étude a permis de montrer l’implication des domaines BH3 et BH4 de BCL-2, il m’a semblé important de l’étudier à l’aide de protéines entières afin de pouvoir regarder finement les régulations de cette interaction. Cette étude a été fortement affectée par la difficulté à purifier BCL-2 et à l’obtenir à des concentrations compatibles avec des études biochimiques (problème d’agrégation). Cependant, je suis arrivée à en obtenir assez pour initier l’étude. J’ai tout d’abord regardé l’effet de BCL-2 sur la stabilité de CISD2 en anaérobie afin de m’affranchir de l’effet de l’oxygène sur le centre. J’ai constaté que BCL-2 affectait de manière très limitée la stabilité de CISD2. Puis j’ai démontré très clairement, et pour la première fois, l’interaction entre les deux protéines in vitro à l’aide de la centrifugation analytique. Cette confirmation de la présence de l’interaction par cette méthode étant réalisée sur la protéine BCL-2 entière et non sur des peptides, s’approche beaucoup plus et confirme ce qui pourrait se passer entre les deux protéines entières au sein de la cellule. Ceci va nous pousser à mieux comprendre les différentes conditions qui pourraient affecter l’interaction entre ces deux dernières afin de pouvoir analyser ce qui se passe sur le plan cellulaire.
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Perspectives
Tous ces résultats amènent un certain nombre de questionnements et de perspectives. Tout d’abord la forme mutée N72S qui après reconstitution assemble un centre [Fe-S] dans le spectre d’absorption UV-visible est compatible avec l’assemblage d’un centre [4Fe-4S]. Il semble extrêmement important de confirmer ce résultat et d’aller plus loin dans la caractérisation de cette forme mutée. Il serait ainsi important dans un premier temps de le caractériser par dichroïsme circulaire puis par RPE (résonance paramagnétique électronique) et Mössbauer. Si ces expériences confirment la présence d’un centre [4Fe-4S] il serait alors important d’essayer de faire la purification entièrement en anaérobie afin de voir si un tel centre est bien présent dans la protéine exprimée dans E. coli sans étape de reconstitution du centre [Fe-S]. Nous pouvons aussi envisager de faire de la RPE sur des cellules d’E.coli qui expriment cette forme mutée afin de voir si un signal d’un centre [4Fe-4S] est observé. Cela peut être envisagé sur des cellules entières ou après avoir fait une purification partielle, mais entièrement en anaérobie, à l’aide d’une résine à nickel. Dans un 2ieme temps, une telle expérience pourrait être réalisée avec expression de ce mutant dans des cellules humaines afin de vérifier si un tel centre [Fe-S] est observé. Une fois toutes ces confirmations réalisées, une étude biochimique et biophysique de la forme mutée reconstituée me parait importante dont la mesure du potentiel redox du centre [Fe-S]. Pour finir, il me serait nécessaire de vérifier dans les cellules humaines si cette forme mutée est capable d’interagir avec les partenaires identifiés de CISD2 dont BCL-2 et IP3R.
Le deuxième axe portera sur BCL-2 et son interaction avec CISD2 in vitro. Pour poursuivre cette étude il me faudrait réaliser une étude par MST (microscale thermophoresis) sur le campus de Gif-sur-Yvette. Cette technique présente comme avantage de consommer très peu de protéines. Elle nous permettra d’optimiser les conditions expérimentales pour favoriser l’interaction entre CISD2 et BCL-2 (pH, concentration en sel) et d’envisager de regarder l’effet de l’état rédox du centre [Fe-S] sur cette interaction en maintenant une forte concentration de réducteur dans la réaction. Cette étude pourrait être complétée par une étude par Biacore en collaboration avec une plateforme de Paris. Elle permettrait d’obtenir des informations sur l’interaction (Kd, Kon, Koff). On pourrait envisager de faire aussi cette expérience en présence d’un réducteur pour voir l’effet de l’état d’oxydation du centre [Fe-S] sur cette interaction. Pour finir, par RMN, nous pourrions voir l’effet de l’addition de CISD2 sur la structure de BCL-2, notamment sur le repliement de son domaine intrinsèquement désordonné qui joue un rôle fondamental dans la régulation de l’interaction de BCL-2 avec ses partenaires physiologiques.
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Il est à noter qu’un nouveau protocole de purification de BCL-2 vient d’être publié avec utilisation d’un détergent (Ådén et al., 2020) qui pourrait permettre d’obtenir une protéine en quantité suffisante pour envisager de telles expériences. Ce protocole est actuellement testé dans l’équipe de recherche.
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