CISD2, protéine à centre Fe-S impliquée dans différentes pathologies humaines

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CISD2, protéine à centre Fe-S impliquée dans différentes

pathologies humaines

Myriam Salameh

To cite this version:

Myriam Salameh. CISD2, protéine à centre Fe-S impliquée dans différentes pathologies humaines. Cancer. Université Paris-Saclay, 2021. Français. �NNT : 2021UPASL025�. �tel-03213000v2�

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CISD2, protéine à centre [Fe-S] impliquée

dans différentes pathologies humaines

Thèse de doctorat de l'université Paris-Saclay

École doctorale n°568: signalisations et réseaux intégratifs en biologie (Biosigne) Spécialité: aspects moléculaires et cellulaires de la biologie Unité de recherche : Université Paris-Saclay, CNRS, Institut de Chimie

des Substances Naturelles, UPR 2301, 91198, Gif-sur-Yvette, France Référent : Faculté de médecine

Thèse présentée et soutenue à Paris-Saclay,

le 25/03/2021, par

Myriam SALAMEH

Rapportrice et Examinatrice Rapportrice et Examinatrice Examinateur Président du jury

Composition du Jury

Herman VAN TILBEURGH

Professeur, I2BC-Université Paris

Saclay Béatrice PY

Directeur de recherche, CNRS

Myriam SEEMAN

Directeur de recherche, CBAT-CNRS

Victor DUARTE Chargé de Recherche, LCBM-CNRS

Direction de la thèse

Marie-Pierre GOLINELLI Directeur de recherche, ICSN-CNRS Directrice de thèse

Thèse de

doctorat

NNT : 202 1UPASL025

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Il me sera très difficile de remercier tout le monde car c’est grâce à l’aide de nombreuses personnes que j’ai pu mener cette thèse à son terme.

Je voudrais tout d’abord remercier grandement ma directrice de thèse, Marie-Pierre Golinelli pour toute son aide, son soutien et sa présence tout au long de ces trois années. Je suis ravie d’avoir travaillé en sa compagnie car outre son appui scientifique, elle a toujours été là pour me soutenir et me conseiller au cours de l’élaboration de ce travail que ça soit dans le cadre de la thèse ou dans le quotidien de toutes nos longues journées. Il m’est impossible d’oublier son aide précieuse pour ma recherche bibliographique, elle a toujours fait tout son possible pour m’aider.

Je remercie également madame Béatrice Py et madame Myriam Seemaan qui ont accepté d’être les rapporteurs de ma thèse, monsieur Victor Duarte et monsieur Herman Van Tilbeurgh qui m’ont fait l’honneur d’être examinateurs de ma thèse, ils ont pris le temps de lire et participer à mon travail de recherche.

Je tiens à remercier particulièrement monsieur Michel Lepoivre et ma chère collègue Sylvie Riquier pour toutes nos discussions et ses conseils qui m’ont accompagné tout au long de mon cursus, également aux membres de notre équipe Laurence, Meng-Er, et Olivier.

Il m’est impossible d’oublier Camille et Mélanie pour leurs aides précieuses au cours de leurs stages au sein de notre équipe. Je remercie toutes les personnes avec qui j’ai partagé mes études et notamment ces années de thèse.

Mes derniers remerciements vont à ma petite famille surtout mon fiancé Joe et sa famille, mon frère Paul et sa copine Laurenne qui ont tout fait pour m’aider, maman et papa qui m’ont soutenu et surtout supporté dans tout ce que j’ai entrepris. Et à ma grande famille d’amis : Israa, Antonia, Nour, Layla, Rasha, koko, Souraya, Nancy, Joe, Flaria, Marcelle, Céline et Rachelle. Un grand merci à Rola Kadri pour sa voix angélique qui m’a servi d’agent anti-stress tout au long de ces années (Ses chansons sont bien conseillées avec la lecture de la thèse également ..)

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5

Table des matières

Liste des figures ... 9

Abréviations ... 13

Chapitre 1 : Introduction ... 15

I. Les protéines à centre fer-soufre ... 15

I.1. Généralités sur les protéines à centre [Fe-S] ... 15

I.2. Les différents types de centre [Fe-S] ... 16

I.2.1. Les centres [1Fe] ... 16

I.2.2. Les centres [2Fe-2S] ... 16

I.2.3. Les centres [4Fe-4S] ... 17

I.2.4. Les centres [3Fe-4S] ... 17

I.2.5. Les centres [Fe-S] plus complexes ... 18

I.3. Les différents types de coordination des centres [2Fe-2S] ... 18

I.3.1. La coordination par quatre cystéines ... 19

I.3.2 La coordination par deux cystéines et deux histidines ... 19

I.3.3. La coordination par trois cystéines et une arginine ... 20

I.3.4. La coordination atypique par deux cystéines et deux molécules de glutathion ... 21

I.3.5. La coordination atypique par trois cystéines et une histidine ... 22

I.4. Les diverses fonctions des protéines à centre [Fe-S] ... 22

I.4.1. Transfert d’électrons ... 23

I.4.2. Régulation de la transcription ... 24

I.4.3. Réplication et réparation de l’ADN ... 24

I.4.4. Centre à activité enzymatique ... 26

I.4.5. Stockage de fer ... 26

I.4.6. Transfert du centre Fe-S ... 27

II. La famille de protéines NEET ... 29

II.1. Généralités ... 29

II.2. Les protéines NEET humaines ... 32

II.2.1. Localisation ... 32

II.2.2. Structures ... 32

II.2.3- Un centre [Fe-S] aux propriétés remarquables ... 34

II.2.4. Fonctions cellulaires ... 35

II.2.5. Maladies associées à leurs mutations/dysfonctionnement ... 35

(7)

6

III.1. Localisation ... 40

III.2. Structure et comparaison avec mitoNEET ... 40

III.3. Implications cellulaires ... 41

III.3.1. CISD2 et destin cellulaire ... 41

III.3.2. CISD2 et homéostasie du calcium ... 46

III.3.3. CISD2 et homéostasie des EROSs et du fer ... 48

III.3.4 CISD2 et vieillissement mitochondrial et cellulaire ... 48

III.4. Syndrome de Wolfram de type 2 ... 49

III.4.1. Description du Syndrome ... 49

III.4.2. Les différentes origines génétiques du Syndrome de Wolfram ... 50

III.4.3. Le Syndrome de Wolfram de type 1 (WS1) ... 51

III.4.4. Le syndrome de Wolfram de type 2 (WS2) ... 53

Objectifs de la thèse ... 55

Chapitre 2 : Matériel et méthodes ... 57

I. Obtention des protéines purifiées nécessaires aux études. ... 57

I.1. Expression et purification de CISD2 humaine ... 57

I.2. Expression et purification de CISD2 ∆ (1-56) - C92S - N72S ... 60

I.3. Expression et purification de la FDX d’E. coli ... 60

I.4. Expression et purification BCL-2 humaine ... 61

II. Dosage protéique par la méthode de Bradford ... 62

III. Préparation des expériences de transfert de centre [Fe-S] de CISD2 ... 62

III.1. Elimination de petites molécules par colonne Microbiospin ... 63

III.2. Production d’apo-FDX à partir d’holo-FDX d’E. coli ... 63

IV. Reconstitution du centre [Fe-S] de CISD2 ... 63

V. Les techniques d’analyse ... 63

V.1. Gels SDS PAGE ... 63

V.2. Spectroscopie d’absorption UV-visible ... 64

V.2.1. Principe de la spectroscopie d’absorption UV-visible ... 64

V.2.2 Matériel utilisé ... 65

V.2.3 Informations obtenues ... 65

V.2.4 Spectres d’absorption UV-visible de CISD2s ... 65

V.2.5 Etude de la stabilité du centre [Fe-S] de CISD2s ... 67

V.2.6. Expériences de transfert de centre [Fe-S] de CISD2s vers apo-FDX ... 68

V.3. Gels natifs ... 70

(8)

7

V.3.2 Préparation des échantillons ... 70

V.3.3 Migration et coloration des gels ... 70

V.4. Dichroïsme circulaire ... 71

V.5. Centrifugation analytique ... 73

Chapitre 3 : Purification de CISD2 soluble humaine ... 75

I. Système d’expression. ... 75

II. Les tests d’expression ... 76

III. Purification de CISD2s ... 79

III.1. Colonne à Nickel ... 81

III.2. Clivage de l’étiquette poly-histidine par la thrombine ... 81

III.3. Gel filtration ... 82

III.4. Colonne échangeuse de cations ... 82

IV. Conclusion ... 83

Chapitre 4 : Etude biochimique comparative de CISD2 et mitoNEET ... 85

Is CISD2 just an ER-localized mitoNEET? ... 86

1. Introduction ... 86

2. Materials and Methods ... 88

2.1. Protein Sequence Alignment ... 88

2.2. Cell Culture and Treatment ... 88

2.3. Preparation of Cell Extracts and Immunoblot ... 88

2.4. siRNA Transfections ... 88

2.5. Protein Expression Levels in Mouse Tissues ... 89

2.6. Purification of Holo-CISD257-135 ... 89

2.7. Purification of mitoNEET and Preparation of apo-FDX ... 90

2.8. Circular Dichroism ... 90

2.9. In vitro CISD2 Cluster Loss and Transfer Reactions ... 90

3. Results ... 91

3.1. Tissue-specific Expression of CISD2 ... 91

3.2. CISD2 is a long-lived protein in cells ... 91

3.3. Intracellular CISD2 Stability is not senstive to Iron Chelator Treatments ... 92

3.4. The Fe-S Cluster is required for a global Folding of CISD2 ... 92

3.5. Stability of oxidized CISD2 Cluster is moderately dependent on pH. ... 94

3.6. CISD2 is highly resistant to Hydrogen Peroxide compared to other [2Fe-2S] transfert protein. 95 3.7. CISD2 is a poor Fe-S Cluster Donor ... 96

(9)

8

References ... 100

Chapitre 5 : Interaction entre CISD2 et le glutathion réduit (GSH) ... 103

Chapitre 6 : Etudes de mutations causant le syndrome de wolfram de type 2 (SW2) ... 107

I. CISD2-C92S-N72S ... 110

II. CISD2-C92S-S104P ... 111

III. Conclusion des mutations pathogènes ... 114

Chapitre 7 : Interaction entre CISD2 et la protéine anti-apoptotique BCL-2. ... 115

I. Expression et purification de BCL-2 humaine ... 117

I.1. Expression de BCL-2 humaine ... 117

I.2. Purification de BCL-2 humaine ... 119

I.2.1. La colonne à nickel ... 119

I.2.2. La gel filtration ... 120

I.2.3. Conclusion ... 120

II. Etude de l’interaction CISD2 – BCL-2 ... 121

II.1. Effet de BCL-2 sur la stabilité du centre [Fe-S] de CISD2 ... 121

II.2. Mise en évidence de la formation du complexe entre CISD2 et BCL-2 ... 123

II.2.1 Le pull-down ... 124

II.2.2. La centrifugation analytique ... 125

III. Conclusion de l’interaction entre CISD2 et BCL-2 ... 128

Chapitre 8 : Discussion et perspectives ... 129

Bibliographie ... 136

Titre : CISD2, protéine à centre [Fe-S] impliquée dans différentes pathologies humaines. ... 145

(10)

9

Liste des figures

Figure 1 : Modèle représentant un centre [1Fe] ... 16

Figure 2 : Modèle représentant un centre [2Fe-2S] ... 16

Figure 3 : Modèle d’un centre [4Fe-4S] ... 17

Figure 4 : Modèle d’un centre [3Fe-4S] ... 17

Figure 5 : Structure cristallographique de la nitrogénase. ... 18

Figure 6 : Structure de HydC de Thermotoga maritima ... 19

Figure 7 : Représentation de la protéine de Rieske de T. thermophilus ... 20

Figure 8 : Représentations des centres Fe-S de la biotine synthase d’E.coli ... 21

Figure 9 : Implication de GRX5 dans la biogenèse des centres fer-soufre ... 22

Figure 10 : Résumé de l’ensemble des fonction des protéines a centre [Fe-S] ... 23

Figure 11 : Schéma illustrant l’implication des centres Fe-S comme cofacteurs dans le complexe I (A) et complexe II (B) de la chaîne respiratoire des mammifères ... 23

Figure 12 : Implication de SoxR dans la voie de la transcription de gènes impliqués dans la détoxification chez E.coli ... 24

Figure 13 : Processus de réparation de l'ADN par excision de base ... 25

Figure 14 : Schéma illustrant la communication des glycolases entre elles par transfert d’électrons ... 26

Figure 15 : Schématisation d’un transfert de centre [Fe-S] d’une holo-protéine donneuse vers une apo-protéine réceptrice ... 27

Figure 16 : Transfert et biogenèse des centres Fe-S dans une cellule eucaryote ... 28

Figure 17 : Représentation du transfert in vitro du centre [Fe-S] de l’holo-mitoNEET vers l’apo-ferrédoxine ... 28

Figure 18 : Alignement des séquences d’acides aminés des trois protéines NEET humaines qui montre le domaine CDGSH bien conservé ... 29

Figure 19 : Le domaine CDGSH caractéristique des protéines NEET est conservé à travers un grand nombre d’espèces ... 31

Figure 20 : Localisation des différentes protéines NEET humaines ... 32

Figure 21 : Représentation de l’organisation des domaines des protéines NEET humaines ... 33

Figure 22 : Représentation des structures de la partie soluble de mitoNEET, de CISD2 et CISD3 ... 33

Figure 23 : Représentation de l’histidine ... 34

Figure 24 : Elévation du niveau d’expression de CISD2 dans les tumeurs chez les patients atteints du cancer du larynx ... 36

Figure 25 : Elévation du niveau d’expression de CISD2 dans les tumeurs chez les patients atteints du cancer gastrique ... 36

Figure 26 : Histogramme montrant l’augmentation de l’expression de CISD2 avec la progression du cancer gastrique ... 37

Figure 27 : Représentation de l’espérance de vie en fonction du niveau d’expression dans des cellules de cancer du sein ... 37

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10

Figure 28 : mitoNEET et CISD2 (appelé ici NAF-1) sont nécessaire pour promouvoir la

croissance de tumeurs du sein ... 38

Figure 29 : Un aperçu de l’évolution de la maladie neurodégénérative Parkinson ... 39

Figure 30 : Structure du domaine cytosolique de CISD2 humaine ... 40

Figure 31 : Comparaison des structures cristallographiques de CISD2 et mitoNEET humaines ... 41

Figure 32 : Ensemble des protéines de la famille BCL-2 associées à leur sous-groupe et leur localisation ... 44

Figure 33 : Rôle de BCL-2 (Bcl-2) au niveau de la mitochondrie et du RE, et différents phénomènes déclenchés. ... 45

Figure 34 : Représentation des différents domaines de CISD2 et iASPP ... 46

Figure 35 : Implication de CISD2 dans la régulation des échanges calciques entre le RE et la mitochondrie. ... 48

Figure 36 : Evolution de l’âge des souris selon le niveau de CISD2 ... 49

Figure 37 : Localisation des gènes codant la Wolframine et CISD2 sur le chromosome 4 ... 50

Figure 38 : Schématisation d’une maladie autosomique récessive ... 51

Figure 39 : Représentation de l’organisation des domaines de la Wolframine avec localisation des domaines transmembranaires. ... 53

Figure 40 : Représentation schématique du gène CISD2 détaillée ... 53

Figure 41 : Représentation du mécanisme d’interaction de CISD2 et BCL-2 au niveau du RE ... 56

Figure 42 : Représentation du plasmide pET-28a (+) ... 57

Figure 43 : Séquence protéique de CISD2s ∆ (1-56) humaine avec l’étiquette polyhistidine en N-terminal ... 58

Figure 44 : formules chimique de l’histidine (A) et de l’imidazole (B). ... 59

Figure 45 : Séquence protéique de CISD2m humaine avec l’étiquette polyhistidine en N-terminal ... 60

Figure 46 : Séquence de la protéine humaine HisTag-BCL-2 ∆ (220-240) ... 61

Figure 47 : Spectre d’absorption UV-visible de l’holo-CISD2s ... 66

Figure 48 : Spectre d’absorption UV-visible d’apo-CISD2s ... 66

Figure 49 : Spectre de l’absorbance de CISD2 en fonction des longueurs d’onde a différents temps t ... 67

Figure 50 : Suivi du transfert du centre [Fe-S] de CISD2 à l’Apo-ferrédoxine ... 69

Figure 51 : Courbes en DC des différents types de structures secondaires présentes dans les protéines ... 72

Figure 52 : Schématisation du principe de base de la centrifugation analytique ... 73

Figure 53 : Carte du plasmide pET-28a-c(+) ... 75

Figure 54 : Représentation de la protéine de fusion entre CISD2s et une étiquette poly-histidine N-terminale. ... 76

Figure 55 : Conditions de culture pour l’optimisation du milieu de culture pour l’expression de CISD2s. ... 77

Figure 56 : Analyse par immunoblot du niveau protéique de CISD2s dans les différents extraits solubles. ... 77

(12)

11

Figure 57 : Analyse par immunoblot du niveau protéique de CISD2s dans les différents extraits

solubles avec une expression de la protéine à 37°C. ... 78

Figure 58 : Conditions des tests réalisés pour l’optimisation de la concentration d’IPTG. ... 78

Figure 59 : Analyse par immunoblot du niveau protéique de CISD2s dans les différents extraits solubles afin d’optimiser la concentration en IPTG. ... 78

Figure 60 : Préparation de la préculture de CISD2s bactérienne après la transformation bactérienne par le plasmide d’expression ... 79

Figure 61 : Schématisation de la culture à grande échelle pour l’expression de CISD2s ... 79

Figure 62 : Préparation des extraits solubles à partir des culots cellulaires ... 80

Figure 63 : les différentes étapes de la purification de CISD2s ... 80

Figure 64 : Analyse sur gel SDS-page à 16% coloré au Coomassie des fractions colorées obtenues après l’étape de gel filtration ... 82

Figure 65 : Analyse sur gel SDS-page à 14% coloré au Coomassie des fractions colorées obtenues après la colonne échangeuse de cations ... 82

Figure 66 : Gel SDS-PAGE à 16% avec des quantités croissantes de CISD2 coloré au Coomassie. ... 83

Figure 67 : Spectre d’absorption UV-visible de CISD2 purifiée ... 83

Figure 68 : Résultats des moyennes de la concentration de CISD2 purifiée ... 84

Figure 69 : Structure chimique du glutathion réduit ... 103

Figure 70 : Effet du GSH sur la stabilité du centre [Fe-S] de CISD2 à 15°C à différents pH 104 Figure 71 : Suivi par spectroscopie d’absorption UV-visible de la perte du centre [Fe-S] de mitoNEET (A) et de CISD2 (B) à 15°C, en aérobie en fonction du pH en absence du GSH. ... 105

Figure 72 : Suivi par spectroscopie d’absorption UV-visible de la perte du centre [Fe-S] de mitoNEET (A) et de CISD2 (B) à 15°C, en aérobie en fonction du pH en présence du GSH. ... 105

Figure 73 : Conservation de la séquence protéique de CISD2 dans la région de l'acide aminé Asp72 ... 107

Figure 74 : Analyse in silico de CISD2 WT et mutée N72S ... 108

Figure 75 : Alignement de séquences multiples de CISD2 humaine. ... 108

Figure 76 : Le site actif de la protéine WT (A) et de la protéine mutée S104P (B) ... 109

Figure 77 : La localisation des deux mutations N72S et S104P sur la structure cristallographique de CISD2-C92S ... 109

Figure 78 : Spectre d’absorption UV-visible de la forme mutée CISD2-N72S ... 110

Figure 79 : Spectre d’absorption UV-visible de la forme mutée CISD2-C92S-N72S après reconstitution biochimique du centre [Fe-S] ... 111

Figure 80 : Plan suivi pour les tests d’expression de CISD2-C92S-N72S ... 112

Figure 81 : Analyse sur gel SDS-PAGE colorés au Coomassie des surnageants/culots des différents tests d’expression. ... 112

Figure 82 : Résultats de la comparaison entre l’expression de CISD2-C92S (tous les C) et CISD2-C92S-S104P (tous les B) dans les culots sur un gel SDS-PAGE colore au bleu de Coomassie. ... 113

Figure 83 : Schématisation de la protéine BCL-2 (∆220-239) humaine produite avec l’étiquette His-tag en Cterminal. ... 117

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12

Figure 84 : Schématisation de la mise en place de la culture pour exprimer BCL-2 humaine ... 118 Figure 85 : Obtention d’extraits cellulaires contenant BCL-2 soluble. ... 118 Figure 86 : Les différentes étapes de la purification de BCL-2 ... 119 Figure 87 : Analyse sur gel SDS-page à 16% coloré au bleu de Coomassie des fractions présentant une absorption dans l’UV à l’issu de la colonne à nickel ... 119 Figure 88 : Analyse sur gel SDS-page à 16% colorée au Bleu de Coomassie de la protéine BCL-2 migrant a BCL-26 kDa après la colonne a Nickel. ... 1BCL-20 Figure 89 : Analyse de la protéine purifiée par immunoblot à l’aide d’un anticorps reconnaissant spécifiquement BCL-2 . ... 121 Figure 90 : Résultats par spectroscopie d’absorption UV-visible de l’effet du peptide 16-30 de BCL-2 sur la stabilité du centre [Fe-S] de CISD2 en quantité stœchiométrique. ... 122 Figure 91 : Mesure de la perte du centre [Fe-S] de CISD2 en absence (orange) et en présence (bleu) de BCL-2 en anaérobie a pH 6,2. ... 123 Figure 92 : Schématisation de la technique de pull-down mise en place pour vérifier l’interaction entre CISD2 et BCL-2 . ... 124 Figure 93 : Dépôt de l’éluat et du lavage de l’expérience et de son contrôle négatif sur un gel SDS-PAGE ... 125 Figure 94 : Analyse des données obtenues par ultracentrifugation analytique de BCL-2 à 2,4 µM (A) et CISD2 à 23,4 µM (B) par mesure de l’absorbance à 280 nm ... 126 Figure 95 : Analyse des données obtenues par ultracentrifugation analytique du mélange BCL-2/CISD2 à 2,4/23,4 µM par mesure de l’absorbance à 280 nm ... 126 Figure 96 : Analyse des données obtenues par ultracentrifugation analytique par mesure de l’absorbance à 460 nm de CISD2 à 23,4 µM (A) et du mélange BCL-2/CISD2 à 2,4/23,4 µM mesuré par absorbance à 460 nm (B) ... 127 Figure 97 : Comparaison des temps de demi vie (t1/2) de la stabilité des centres [Fe-S] de CISD2 et mitoNEET en présence d’oxygène en fonction du pH. ... 129 Figure 98 : Comparaison des temps de demi-vie (t1/2) de CISD2 et de mitoNEET en présence du H2O2 (250 µM). ... 130 Figure 99 : Comparaison des temps de demi-vie (t1/2) de CISD2 et de mitoNEET avec d’autres protéines a centre [Fe-S] en présence du H2O2 à pH 8 ... 131 Figure 100 : Comparaison des t1/2 de la réaction de transfert du centre [Fe-S] de CISD2 et mitoNEET vers la ferrédoxine d’E. coli à 25°C et 20 µM pour chacune des protéines. ... 132

(14)

13

Abréviations

ARNm ARN messager

Bcl-2 B-cell lymphoma 2

CIA Cytosolic Iron-sulfur cluster Assembly

CISD CDGSH Iron-Sulfur Domain

DCA Direct coupling analysis

DIDMOAD (Diabete Insipidus, Diabete Melitus, Optic Atrophy and Deafness)

DTT DiThioThréitol

DXMS Spectrométrie de masse à échange de deuterium EDTA Ethylène Diamine TétraAcétique

ERO Espèce Réactive de l’Oxygène

FDX FerréDoXine

Fe-S Fer-soufre

GRX GlutaRédoXine

Hyd Hydrogenase

IPTG IsoPropyl β-D-1-ThioGalactopyranoside

Isc Iron sulfur cluster

LB Lysogeny Broth

NIF Nitrogen mobilisation RE Reticulum endoplasmique SAM S-adénosylméthionine

SERCA Alco(endo)plasmic reticulum Ca2+ ATPase

SUF Sulfur mobilization

UV Ultra-Violet

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(16)

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Chapitre 1 : Introduction

Découverts en 1960 chez une bactérie anaérobe, les centres [Fe-S] sont des cofacteurs composés uniquement de fer et de soufre inorganique (Beinert, 1960). Ils constituent l’un des groupements les plus fréquemment retrouvés au sein des protéines. Longtemps considérés comme restreints à ces organismes anaérobes de par leur sensibilité à l’oxygène, leur existence est désormais démontrée dans les trois domaines de la vie et dans tous les compartiments cellulaires des cellules eucaryotes (Johnson et al., 2005). Les protéines à centre [Fe-S] interviennent dans de nombreux processus biologiques essentiels tels que la respiration cellulaire et la photosynthèse et ont des fonctions très diverses allant du transfert d’électrons à la régulation de l’expression de gènes.

Dans une première partie, je vais vous présenter les protéines [Fe-S] puis je me focaliserai sur la famille des protéines NEET et plus particulièrement sur CISD2, protéine NEET humaine sur laquelle mes travaux de thèse portent.

I.

Les protéines à centre fer-soufre

I.1. Généralités sur les protéines à centre [Fe-S]

Les centres [Fe-S] ont des compositions très diverses allant du centre 1Fe trouvé dans la rubrédoxine à des centres très complexes comme ceux rencontrés dans l’hydrogénase [Fe-Fe] (Johnson et al., 2005). Cependant, les deux structures les plus abondantes au sein des protéines sont les centres [2Fe-2S] et [4Fe-4S]. Les soufres présents dans ces centres, à l’exception du centre 1Fe bien évidemment, proviennent de la désulfuration de cystéine libre présente dans la cellule. Chaque fer peut être soit à l'état oxydé Fe(III), soit à l'état réduit Fe(II). Si bien que les centres [Fe-S] peuvent avoir différents états d’oxydation. Cependant, dans les protéines les centres [Fe-S] présents ne se trouvent que dans deux états ; les autres états d’oxydation n’étant pas accessibles. Typiquement, chaque fer est impliqué dans quatre liaisons avec soit d’autres atomes du centre soit un atome de la protéine. Ainsi, les centres sont reliés à la chaîne polypeptidique de la protéine via des liaisons non-covalentes avec un hétéroatome d’une chaîne latérale d’un acide aminé. L’atome de soufre provenant d’une cystéine est le plus souvent rencontré. Cependant, d’autres atomes tels que l’azote (arginine, histidine) ou l’oxygène (thréonine, sérine) sont également trouvés (Johnson et al., 2005).

(17)

16

I.2. Les différents types de centre [Fe-S]

Dans cette partie, je vais décrire les types de centres [Fe-S] les plus fréquemment rencontrés.

I.2.1. Les centres [1Fe]

Cette configuration du centre est retrouvée au sein des rubrédoxines bactériennes connues pour leur implication dans les transferts d’électrons. Les centres [1Fe] sont composés d’un seul atome de fer relié à quatre atomes de soufre de la chaîne polypeptidique (chaînes latérales des cystéines).

Figure 1 : Modèle représentant un centre [1Fe]

L’atome de fer est représenté en rouge et les soufres en jaune. Image provenant de (Parent et al., 2015) L’environnement soufré de ces centres, qui ressemble à l’environnement des autres centres [Fe-S] leur permet de faire part de la famille des protéines à centre [Fe-[Fe-S] (Imlay, 2006)

I.2.2. Les centres [2Fe-2S]

Les centres [2Fe-2S] ont une géométrie tétraédrique. Ils sont composés de deux atomes de fer et deux atomes de soufre inorganique et sont typiquement coordinés par quatre cystéines de la chaîne polypeptidique de la protéine (Kakuta et al., 2001).

Figure 2 : Modèle représentant un centre [2Fe-2S]

Les atomes de fer sont représentés en rouge et les soufres en jaune. Image provenant de (Parent et al., 2015).

Chaque atome de fer interagit donc avec deux atomes de soufre inorganique, et deux atomes de soufre provenant de chaînes latérales de cystéines de la protéine. Ces centres peuvent exister

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sous deux états d’oxydation. L’état oxydé [2Fe-2S]2+ présente deux ions ferriques (Fe3+) et l’état réduit [2Fe-2S] + comporte un ion ferrique (Fe3+) et un ion ferreux (Fe2+).

I.2.3. Les centres [4Fe-4S]

Les centres [4Fe-4S] ont une géométrie cubique, avec alternativement sur les sommets un atome de fer et un atome de soufre inorganique.

Figure 3 : Modèle d’un centre [4Fe-4S]

Les atomes de fer sont représentés en rouge et les soufres en jaune. Image provenant de (Parent et al., 2015)

Les centres [4Fe-4S] peuvent exister sous trois états d’oxydation à savoir [4Fe-4S]1+ , [4Fe-4S]2+ et [4Fe-4S]3+. Cependant, pour une protéine donnée le centre ne peut avoir que deux états d’oxydation à savoir (1+ ou 2+) pour les centres dits à bas potentiel et (+2 ou +3) pour les centres dits HiPIP.

I.2.4. Les centres [3Fe-4S]

Ils sont composés de trois atomes de fer et de quatre atomes de soufre inorganique.

Figure 4 : Modèle d’un centre [3Fe-4S]

Les atomes de fer sont représentés en rouge et les soufres en jaune. Image provenant de (Parent et al., 2015)

Un tel centre est retrouvé notamment dans quelques enzymes comme l’hydrogénase de

Desulfovibrio gigas (Beinert, 1990) ou la fumarate réductase d’E. coli (Johnson et al., 2005).

Récemment, il a été proposé qu’un tel centre était présent dans l’enzyme Thil chez les bactéries et les archées. Cette enzyme est impliquée dans la thiolation des ARNt, modification qui permet

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notamment la stabilisation des ARNt. Ainsi, chez Methanococcus maripaludis, Thil contiendrait un centre [3Fe-4S] qui est essentiel son activité enzymatique ((Liu et al., 2016). Cependant, on ne peut pas exclure que cette stœchiométrie du centre provienne de la dégradation oxydative d’un centre [4Fe-4S] comme cela a déjà été observé comme par exemple pour l’aconitase humaine.

I.2.5. Les centres [Fe-S] plus complexes

Les centres [Fe-S] que je viens de présenter dans les paragraphes précédents sont des centres de faible nucléarité, mais il existe des centres plus complexes de plus haute nucléarité et/ou présentant d’autres métaux en plus du fer.

Des centres fer-soufre complexes sont rencontrés par exemple dans la nitrogénase, enzyme qui fixe l’azote de l’air et le transforme en ammoniac, une réaction d’une importance capitale pour les plantes (cycle de l’azote) et qui surprend les chimistes depuis très longtemps. Pour catalyser cette réaction de réduction, deux centres à base de fer et de soufre ont été identifiés: le centre P fait de huit atomes de fer et de sept atomes de soufre, qui participe essentiellement au transfert des électrons vers le second centre, et le centre Fe-Moco constitué de sept atomes de fer, un atome de molybdène, un atome de carbone et de neuf atomes de soufre, qui est le site de la fixation de N2 et de sa réduction multiélectronique (Beatty et al., 2011).

Figure 5 : Structure cristallographique de la nitrogénase (chemtube 3D (Beatty, 2011)). I.3. Les différents types de coordination des centres [2Fe-2S]

Les travaux de recherche que j’ai menés tout au long de cette thèse portent sur une protéine à centre [2Fe-2S] avec une coordination atypique impliquant trois cystéines (et non quatre) et une histidine. J’ai donc choisi de présenter dans le paragraphe suivant les différents types de

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coordination des centres [2Fe-2S] afin de mieux comprendre les caractéristiques de cette coordination non-cysteinyl.

I.3.1. La coordination par quatre cystéines

C’est le type de coordination le plus couramment rencontré. Il confère une stabilité au centre [Fe-S] liée à la très forte interaction entre les groupements thiols des cystéines et le fer. Par exemple, les ferrédoxines (FDX) utilisent ce type de coordination et ainsi que HydC, une sous-unité de la [FeFe] hydrogénase de Thermotoga maritima.

Figure 6 : Structure de HydC de Thermotoga maritima (Birrell et al., 2016)

Agrandissement de la structure autour du site actif de l’enzyme

Cependant, d’autres types de coordination ont été identifiés faisant intervenir des résidus non -cystéinyls ce qui modifie les propriétés du centre [Fe-S] (stabilité du centre, potentiel d’oxydo-réduction…) avec un effet majeur sur la fonction des protéines portant ces centres.

I.3.2 La coordination par deux cystéines et deux histidines

Ce type de coordination est retrouvé dans la protéine Rieske de la chaîne respiratoire ainsi que dans les oxygénases de type Rieske (Balk et al., 2004). La protéine de Rieske, qui est un des composants du complexe III de la chaîne respiratoire participe au transfert des électrons.

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Figure 7 : Représentation de la protéine de Rieske de T. thermophilus (Stegmaier et al., 2018).

De manière intéressante, la réduction du centre [2Fe-2S] de la 1,2-dioxygenase de Pseudomonas putida va engendrer la modification des liaisons d’hydrogène autour de ce même centre [Fe-S] (Stegmaier et al., 2018). Une liaison entre l’histidine coordinant le centre et une asparagine, toutes deux réduites, va permettre à l’oxygène de se fixer et ainsi initier la réaction enzymatique en question (Ferraro et al., 2015) I.3.3. La coordination par trois cystéines et une arginine

Ce type de coordination est rencontré notamment dans la biotine synthase. Cette enzyme est impliquée dans la catalyse de la dernière étape de la synthèse de la biotine, coenzyme impliquée dans plusieurs voies métaboliques, dont la voie de synthèse des acides gras, des glucides et de vitamines. La structure cristallographique de la biotine synthase d’E. coli révèle la présence d’un centre [4Fe-4S] lié à une molécule de S-adénosylméthionine, autrement appelé radical SAM, mais aussi un centre [2Fe-2S] lié à trois cystéines et une arginine.

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Figure 8 : Représentations des centres Fe-S de la biotine synthase d’E.coli

(A) Structure des centres [2Fe-2S] et [4Fe-4S] de la biotine synthase d’E. coli (Peters et al., 2015). Les

atomes de fer sont en orange, de soufre en jaune, d’oxygène en rouge et d’azote en bleu. Le radical SAM constitue le quatrième ligand du centre [4Fe-4S] et un résidu arginine (R260) dont les contours sont matérialisés en orange celui du centre [2Fe-2S]. (B) Coordination du centre [2Fe-2S] de la biotine synthase (Taylor, Stoll, Britt, & Jarrett, 2011). Les Cys97, Cys128, Cys188 (vert) et Arg260 (rouge) coordonnent le centre [2Fe-2S], (Fe3+ : brun, S2− : jaune).

Le centre [2Fe-2S] sert de source de soufre pour la réaction catalysée et sa coordination atypique lui donne un compromis entre la stabilité du centre [Fe-S], et les différents types de réactions que l’enzyme peut effectuer.

I.3.4. La coordination atypique par deux cystéines et deux molécules de glutathion

Ce type de coordination a été retrouvé au sein de certains types de glutarédoxines (GRX) dont la GRX-C1 de peuplier (Feng et al., 2016) et la GRX2 humaine (Berndt et al., 2006). Les protéines GRX jouent un rôle dans la réduction de ponts disulfures, dans la déglutathionylation de protéines (Kalinina et al., 2015), mais aussi dans la biogenèse des centres [Fe-S] (Py et al., 2014).

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Figure 9 : Implication de GRX5 dans la biogenèse des centres fer-soufre (Lill, 2020) I.3.5. La coordination atypique par trois cystéines et une histidine

Cette coordination de type trois cystéine et une histidine est l’une des caractéristiques de la famille des protéines NEET, famille à laquelle appartient CISD2 qui fait l’objet de cette thèse. Ce type de coordination est retrouvé aussi dans IscU, protéine impliquée dans la biogenèse des centres [Fe-S]. Il a été clairement montré que dans ce cas la coordination du centre par trois cystéines et une histidine est indispensable au fonctionnement d’IscU (Hidese et al., 2014)Le facteur de transcription bactérien IscR qui permet la régulation de la biogenèse des centres [Fe-S] possède lui aussi ce type de coordination (Mandin et al., 2016). Il en est de même pour le complexe glutarédoxine (GRX) - Fra2 chez la levure Ces protéines sont impliquées dans le transport du facteur de transcription Aft1 du cytosol vers le noyau et joue un rôle dans la régulation de l’entrée du fer qui sert de stockage du fer dans la cellule (Li et al., 2009). Ce type de coordination atypique confère une labilité du centre Fe-S lui permettant d’être transféré à une protéine réceptrice.

I.4. Les diverses fonctions des protéines à centre [Fe-S]

Les protéines à centre [Fe-S] ont longtemps été connues pour leur implication dans le transport d’électrons (Beinert, 1960). Cependant, au fil des années, il est apparu que leurs fonctions sont nettement plus diverses et inclues la catalyse enzymatique, la régulation de la transcription, la

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23

synthèse et la réparation de l’ADN, le transfert de centre [Fe-S] vers d’autres protéines et le stockage de fer.

Figure 10 : Résumé de l’ensemble des fonction des protéines a centre [Fe-S] I.4.1. Transfert d’électrons

Comme vu précédemment, les atomes de fer du centre [Fe-S] peuvent se retrouver sous deux états d’oxydation : Fe2+ (état réduit) et Fe3+ (état oxydé). Ainsi, les centres [Fe-S] utilisent cette capacité pour accepter et donner des électrons. Dans des processus biologiques essentiels tel que la photosynthèse et la respiration, des centres [Fe-S] présents en grand nombre forment des chaînes et participent aux transferts d’électrons sur des distances importantes (Johnson et

al., 2005).

Figure 11 : Schéma illustrant l’implication des centres Fe-S comme cofacteurs dans le complexe I (A) et complexe II (B) de la chaîne respiratoire des mammifères

B

A

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24

I.4.2. Régulation de la transcription

Les protéines à centre [Fe-S] jouent aussi un rôle important dans la régulation de la transcription bactérienne (Py et al., 2014). On peut citer par exemple SoxR d’E. coli, qui joue un rôle majeur dans la réponse bactérienne à un stress oxydant en contrôlant l’expression d’un grand nombre de gènes impliqués dans les réactions de détoxification (Blanchard et al., 2007). Cette protéine a la particularité de réguler son activité par l’état d’oxydation de son centre [Fe-S].

Figure 12 : Implication de SoxR dans la voie de la transcription de gènes impliqués dans la détoxification chez E.coli (Kim et al., 2015)

I.4.3. Réplication et réparation de l’ADN

La réplication de l’ADN est un processus qui aboutit à la duplication de l'ADN, au cours duquel l'ADN est synthétisé grâce à l'ADN polymérase. Ainsi, à partir d'une molécule d'ADN, deux molécules identiques à la molécule initiale sont obtenues et distribuées aux deux cellules filles. Plusieurs protéines à centre [4Fe-4S] interviennent ainsi dans les processus de réplication de l’ADN mais aussi dans sa réparation suite à un dommage. On peut ainsi citer l’ADN primase humaine, une ARN polymérase qui permet la synthèse de courts segments d'ARN qui sont ensuite utilisés comme amorces par l'ADN polymérase réplicative (Baranovskiy et al., 2017). De plus, certaines ADN glycosylases contiennent un centre [4Fe-4S]. Ainsi, dans le processus de la réparation par excision de base (ou BER pour Base excision repair en anglais) qui est un mécanisme de réparation d'un dommage au niveau d’une base individuelle de l’ADN, l’ADN glycosylase élimine la base endommagée puis d’autres enzymes interviennent pour cliver le désoxyribose, et puis réparer l’ADN endommagé.

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Figure 13 : Processus de réparation de l'ADN par excision de base (Matthieu Simon, 2018- cours pharmacie)

Parmi ces glycosylases à centre [Fe-S], on peut citer MutY et l’endonucléase III. Longtemps il a été considéré que leur centre [Fe-S] avait uniquement un rôle structural (Thayer et al., 1995). Cependant, depuis quelques années, un modèle et apparu qui propose que les glycosylases communiquent entre elles par transfert d’électrons le long de l’ADN en utilisant leur centre [Fe-S]. La présence d’un dommage à l’ADN présent entre deux glycosylases interromprait alors le transfert d’électrons ce qui indiquerait aux glycosylases qu’un dommage à réparer est présent à proximité (Barton et al., 2019).

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Figure 14 : Schéma illustrant la communication des glycolases entre elles par transfert d’électrons

La radical guanine est un des dommages majeurs à l’ADN causé par le stress oxydatif. MutY possède un centre [4Fe-4S]. Lorsque le centre est oxydé, l’affinité de la protéine pour l’ADN est augmentée. La présence d’un radical guanine va permettre l’oxydation du centre de MutY et sa stabilisation sur l’ADN. Elle pourra ensuite être réduite par une seconde protéine par transfert d’électron le long d'ADN. Cependant, si une lésion est présente entre les deux protéines, le transfert d’électrons n’est pas possible, les protéines restent alors oxydées et vont scanner l’ADN à la recherche de la lésion. Dans le cas contraire, elles sont réduites et vont se dissocier de l’ADN (Barton et al., 2019)

I.4.4. Centre à activité enzymatique

L’exemple le plus souvent cité dans cette catégorie est l’aconitase. Cette enzyme mitochondriale qui intervient dans le cycle de Krebs possède un centre [4Fe-4S] lié à trois cystéines (Lauble et al., 1992). Le citrate, substrat de l’aconitase, est le quatrième ligand du centre [Fe-S] de cette dernière puis est converti en isocitrate par une réaction de déshydratation.

Dans ces déshydratases, la géométrie du centre [Fe-S] permet l’accès du substrat au site catalytique mais aussi l’éxpose à des entités chimiques délétères, comme le superoxyde, le peroxyde d’hydrogène ou les métaux. Cette géométrie optimale du centre s’accompagne d’une fragilité intrinsèque vis-à-vis de produits toxiques. Ainsi, le quatrième atome de fer, qui est tout particulièrement labile, peut être perdu suite à un stress oxydant/nitrosant. L’aconitase possède alors un centre [3Fe-4S] et est inactive (Flint et al., 1993). Ce centre peut ensuite être totalement détruit (Py et al., 2014).

I.4.5. Stockage de fer

Une ferrédoxine retrouvée chez l’archéobactérie Methanobacterium thermoautotrophocum, qui est une poly-FDX peut accepter jusqu’à 12 centres [4Fe-4S], ce qui représente une forme de stockage de fer. Cependant cette poly-FDX n’est pas retrouvée chez les mammifères. Ces

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dernières possèdent à la place la ferritine qui accepte 4500 atomes de fer, stockés sous la forme de Fe3+ (Harrison et AEROSsio, 1996).

I.4.6. Transfert du centre Fe-S

Le transfert du centre fer-soufre s’explique d’une manière simplifiée par le passage du centre de l’holo-protéine (protéine qui possède son centre fer soufre) à l’apo-protéine (protéine qui a perdu son centre [Fe-S]) qui peut le recevoir (exemple de la figure ci-dessous). Il en résulte le passage de l’holo-protéine ayant donné son centre à l’état « apo-protéine », et inversement l’apo-protéine ayant reçu un centre passe ainsi à l’état « holo-protéine ».

Figure 15 : Schématisation d’un transfert de centre [Fe-S] d’une holo-protéine donneuse vers une apo-protéine réceptrice (Mons et al., 2017)

La biogenèse bactérienne des centres [Fe-S] constitue le premier phénomène cellulaire où un phénomène de transfert a été observé. Ainsi il peut être observe au niveau des trois machineries connues : ISC (Iron-Sulfur Centre) ; SUF (SUlFur mobilization) et NIF (NItrogen mobilisation) (Chahal et al., 2012)et dans des organismes aussi divers que la levure Schizosaccharomyces

pombe (Wu et al., 2002), les plantes (Bandyopadhyay et al., 2008) ; (Mapolelo et al., 2013) et

l’humain. (Paul et al., 2015). Ainsi, ces phénomènes de transfert de centre interviennent à plusieurs étapes de la biogenèse des centres : transfert d’IscU à GRX5, de GRX5 aux protéines IscA, BolA, IBA57, NFU puis pour délivrer les centres [Fe-S] aux protéines finales à maturer (Paul et al., 2015).

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Figure 16 : Transfert et biogenèse des centres Fe-S dans une cellule eucaryote (Maio et al., 2015)

Le transfert de centre Fe-S n’est pas uniquement impliqué dans la biogenèse de ces mêmes centres, mais aussi dans leur réparation (Ferecatu et al., 2014) . Ainsi une protéine [Fe-S] qui perd son centre métallique suite notamment à un stress oxydant ou nitrosant devient non fonctionnelle, le transfert d’un centre d’une holo-protéine à cette apo-proteine endommagée permet de réparer cette dernière et de la rendre fonctionnelle.

Un exemple de transfert a été particulièrement étudié dans l’équipe de recherche dans laquelle j’ai effectué ma thèse. Cette étude porte sur une protéine homodimerique à centre [2Fe-2S], mitoNEET de la famille de protéine NEET, qui peut transférer son centre [Fe-S] grâce à la labilité conférée par la coordination atypique de ce centre (ces éléments seront abordés plus en détails plus loin). MitoNEET représente la protéine donneuse (holo-protéine), qui va transférer son centre vers une protéine réceptrice (apo-ferrédoxine, dans le cadre d’une étude in vitro modèle). Sous forme oxydée, mitoNEET peut transférer son centre à l’apo-ferrédoxine. L’apo-ferrédoxine passe ainsi à l’état d’holo-L’apo-ferrédoxine après le gain du centre [Fe-S] de mitoNEET qui, à l’inverse, passe à l’état apo-mitoNEET après la perte de son centre (Mons et al., 2018).

Figure 17 : Représentation du transfert in vitro du centre [Fe-S] de l’holo-mitoNEET vers l’apo-ferrédoxine (Mons et al., 2017)

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29

II.

La famille de protéines NEET

La famille protéines NEET est une famille de protéine à centre [2Fe-2S] découverte au cours de ces dernières années. Comme nous le verrons après, elle présente de nombreuses particularités qui induisent un intérêt grandissant dans la communauté. Dans cette partie je vais présenter la famille de protéines NEET, en me focalisant plus particulièrement sur les protéines humaines.

II.1. Généralités

L’histoire de cette famille remonte à 1978. A cette époque, un signal en résonance paramagnétique électronique (RPE) est détecté dans un extrait de membranes mitochondriales correspond à une protéine avec un centre [2Fe-2S] (Heidrich et al., 1978). Ce résultat est la première indication de l’existence d’une telle protéine ancrée dans la membrane de la mitochondrie qui sera appelée plus tard mitoNEET (aussi connue sous le nom de CISD1). Mais, c’est seulement en 2003 que mitoNEET sera identifiée formellement comme étant la cible potentielle d’un médicament utilisé dans la lutte contre le diabète de type II la pioglitazone (Colca et al., 2004), interaction qui depuis a été remise en cause par les mêmes auteurs (Colca

et al., 2013).

La recherche de protéines humaines présentant des homologies de séquences avec mitoNEET a mis en évidence l’existence de CISD2 (nommée aussi Miner1, NAF-1) et de CISD3 (connue aussi sous le nom de Miner2).

Figure 18 : Alignement des séquences d’acides aminés des trois protéines NEET humaines qui montre le domaine CDGSH bien conservé (Wiley et al., 2007)

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La nomenclature « NEET » fait référence à la séquence d’acides aminés asparagine (N), deux acides glutamiques (EE) et thréonine (T) présente en C-terminal de la séquence de ces trois protéines. De manière plus générale, ces protéines contiennent une séquence conservée de 39 acides aminés appelé CDGSH à l’origine de l’appellation CISD des gènes des trois protéines humaines pour CDGSH Iron Sulfur Domain [C-X-C-X2-(S/T)-X3-P-X-C-D-G-(S/A/T)-H]. (Tamir et al., 2015) Parmi ces 39 acides aminés, 16 acides aminés sont extrêmement conservés et contiennent les quatre ligands du centre [2Fe-2S] (Wiley et al., 2007).

La recherche de domaine CDGSH dans d’autres organismes a montré qu’un tel domaine est présent dans des protéines d’organismes eucaryotes très divers, mais aussi chez certains procaryotes.

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Figure 19 : Le domaine CDGSH caractéristique des protéines NEET est conservé à travers un grand nombre d’espèces (Inupakutika et al., 2017)

La séquence conservée C-X-C-X2-(S/T)-X3-P-X-C-D-G-(S/A/T)-H est une caractéristique déterminante de la famille des protéines CDGSH (les acides aminés 3Cis-1His sont en gras et le motif CDGSH est mis en évidence en jaune). La présence ou l'absence de chaque type de protéine dans les bactéries, archées, champignons, algues, plantes et animaux est indiquée à droite. Les protéines CISD1 / CISD2 humaines appartiennent aux groupes 1 et 3, et la protéine CISD3 humaine appartient au groupe 2.

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II.2. Les protéines NEET humaines

Dans cette partie je vais me focaliser sur les protéines NEET chez l’Humain à savoir mitoNEET, CISD2 et CISD3.

II.2.1. Localisation

En 2007, le professeur Nechushtai et ses collaborateurs ont démontré que mitoNEET se localise au niveau de la membrane externe mitochondriale (OMM, outer mitochondrial Membrane) avec le centre Fe-S dans le cytosol (Wiley et al., 2007)Elle aussi membranaire, CISD2 se localiserait au niveau du réticulum endoplasmique (RE) au niveau des sites de contact avec les mitochondries (ou MAMs - mitochondria-associated ER membranes) (Wiley et al., 2013)avec le centre [Fe-S] dans le cytosol. Ces deux protéines sont ancrées aux membranes par un domaine transmembranaires N-terminal. CISD3 résiderait, quant à elle, à l'intérieur de la matrice mitochondriale (Inupakutika et al., 2017).

Figure 20 : Localisation des différentes protéines NEET humaines II.2.2. Structures

CISD2 et mitoNEET sont homodimériques avec un motif CDGSH et un centre [Fe-S] par monomère, tandis que Miner2 est monomérique avec deux motifs CDGSH dans le même monomère qui sont en tandem.

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Figure 21 : Représentation de l’organisation des domaines des protéines NEET humaines Ainsi, l’ensemble des protéines de cette famille NEET contiennent deux centres [2Fe-2S], obtenus soit par duplication du domaine CDGSH (CISD3 ou Miner2) soit par dimérisation de la protéine (CISD2 et mitoNEET).

Figure 22 : Représentation des structures de la partie soluble de mitoNEET, de CISD2 et CISD3 (d’après (Karmi et al., 2018))

La structure cristallographique de la partie soluble de mitoNEET et CISD2 c’est-à-dire délétée de leur ancre membranaire N-terminale montre deux domaines bien différenciés : le domaine ß-cap qui se localise au sommet de la protéine et le domaine de liaison au centre [Fe-S] où se fixe le centre [Fe-S] au niveau de la partie centrale de la protéine (Hou et al., 2007).

Miner2

mitoNEET

CISD2

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34

Figure 21 : Représentation des structures de la partie soluble de CISD2 et de mitoNEET montrant les deux domaines structuraux bien différenciés.

II.2.3- Un centre [Fe-S] aux propriétés remarquables

Positionné à la surface de la protéine, le centre [2Fe-2S] des protéines NEET possède une coordination atypique par trois cystéines et une histidine (et non 4 cystéines comme rencontré couramment). Cette coordination non-cysteinyl va donner des propriétés remarquables au centre [Fe-S]. En effet, l’histidine est un résidu protonable ce qui n’est pas le cas de la cystéine. L’histidine peut alors exister sous deux formes différentes en fonction du pH : la forme neutre protonée et la forme négativement chargée. Cette particularité de la coordination va participer à la labilité de son centre mais aussi à la très forte dépendance de son potentiel d’oxydoréduction vis-à-vis du pH (Bak et al., 2013).

Figure 23 : Représentation de l’histidine A : Forme protonée. B : Forme négativement chargée.

L’histidine est exposée au solvant et donc facilement protonable, suggérant potentiellement une fonction de détection pour ce résidu des changements de l’environnement protéique. Un réseau de liaison hydrogène complexe participe aussi à la modulation de la stabilité du centre. Il a été

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également constaté que la distance entre les centres diffère selon les espèces étudiées, ce qui montre que le fonctionnement de ces protéines est probablement indépendant de l’interaction ou de la communication entre les centres.

L’étude sur mitoNEET menée dans l’équipe de recherche a montré que la stabilité du centre [Fe-S] de mitoNEET est fortement dépendante de la présence de dioxygène mais aussi du pH. Inversement, en anaérobie ou lorsque son centre est réduit, la protéine est très stable. Le centre [Fe-S] de ces protéines, une fois oxydé, peut être transféré indépendamment de la présence d’oxygène à une apo-protéine réceptrice, cette réaction étant, elle aussi, fortement dépendante du pH. mitoNEET est très résistante vis-à-vis de H2O2 (molécule de la famille des espèces réactives de l’oxygène ou EROSs, fortement produite lors d’un stress) (Ferecatu et al., 2014). Pour CISD2 et CISD3 il a été proposé que ces deux protéines pourraient fonctionner de manière similaires que mitoNEET, et tout comme cette dernière elles pourraient transférer leur centre à une protéine réceptrice (Karmi et al., 2018).

II.2.4. Fonctions cellulaires

Des études biologiques ont montré que les protéines NEET participent la régulation de l’homéostasie du fer dans la mitochondrie, des centres [Fe-S] et des EROSs.

MitoNEET serait impliquée dans la prolifération des cellules cancéreuses, l’homéostasie du fer au niveau des mitochondries, la réparation des protéines a centre [Fe-S] par transfert de centre, et la régulation de l’entrée des lipides dans la cellule (Tamir et al., 2014b). En utilisant des modèles murins de souris exprimant/sur-exprimant mitoNEET, il a été démontré que la surexpression de cette protéine mène à une augmentation du fer mitochondrial par rapport à la normale chez les souris sauvages (Kusminski et al., 2012).

Il a été démontré que, en plus des fonctions très générales associées aux protéines NEET, CISD2 participerait à la régulation de l’autophagie et à l’homéostasie du calcium (détails dans la partie III.3). En ce qui concerne Miner2, l’étude de ces fonctions n’est pas très développée jusqu’à présent.

II.2.5. Maladies associées à leurs mutations/dysfonctionnement

Plusieurs maladies sont associées aux protéines NEET. Tout d’abord des mutations dans le gène

CISD2 sont la cause du Syndrome de Wolfram de type 2, également connu sous son acronyme

anglophone DIDMOAD (pour « diabetes insipidus, diabetes mellitus, optic atrophy, and deafness ») appartenant au groupe des maladies dites orphelines, des maladies rares (Amr et

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36

al., 2007). Je consacrerai toute une partie de mon introduction sur cette maladie qui est au cœur

de mon travail de thèse.

II.2.5.1. Le cancer

Des études récentes ont montré que les protéines CISD2 et mitoNEET seraient fortement exprimées dans un certain nombre de cancers dont les cancers du sein (Salem et al., 2012) ; (Holt et al., 2016) du larynx (Yang et al., 2016) et gastrique (Wang et al., 2016).

Figure 24 : Elévation du niveau d’expression de CISD2 dans les tumeurs chez les patients atteints du cancer du larynx (Yang et al., 2016).

Immunoblot montrant les niveaux d’expression de CISD2 chez des patients atteints de cancer du larynx dans les cellules cancéreuses (T) et non cancéreuses (ANT)

Figure 25 : Elévation du niveau d’expression de CISD2 dans les tumeurs chez les patients atteints du cancer gastrique (Wang et al., 2016).

Immunoblot montrant les résultats de l’expression de CISD2 chez des patients atteints du cancer gastrique dans les cellules cancéreuses (T) et non cancéreuses (ANT).

De plus, le niveau d’expression de ces protéines augmenterait avec la gravité de la maladie et du stade atteint (Wang et al., 2016)

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37

Figure 26 : Histogramme montrant l’augmentation de l’expression de CISD2 avec la progression du cancer gastrique (Wang et al., 2016)

Ainsi, les patients présentant un niveau d’expression plus élevé de CISD2 ont une durée globale de survie plus courte que les patients présentant une expression plus faible de CISD2.

Figure 27 : Représentation de l’espérance de vie en fonction du niveau d’expression dans des cellules de cancer du sein (Wang et al., 2016)

Il a été également démontré que la suppression d’une des deux protéines dans une lignée de cellules de cancer du sein cause une perturbation au niveau des fonctions de la mitochondrie (accumulation de EROSs et de fer dans la mitochondrie) et conduit à la diminution de la croissance tumorale (Sohn et al., 2013).

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Figure 28 : mitoNEET et CISD2 (appelé ici NAF-1) sont nécessaire pour promouvoir la croissance de tumeurs du sein. (Sohn et al., 2013)

Des cellules du cancer du sein (MDA-231), avec suppression de l'expression de mitoNEET (mNT) ou CISD2 (NAF-1) ont été injectées dans le dos de souris et la croissance de la tumeur a été suivie au cours du temps.

Ainsi, un niveau élevé d’expression de CISD2 ou mitoNEET entrainerait une augmentation du niveau de la respiration mitochondriale, de la résistance à l’autophagie et, par conséquent, favoriseraient la croissance des tumeurs (Sohn et al., 2013)

Une analyse multivariée a alors suggéré que l’expression de CISD2 pourrait être un indicateur de pronostique indépendant pour la survie des patients présentant le cancer du col de l’utérus à un stade précoce (Liu et al., 2014). Les protéines NEET pourraient être alors des cibles prometteuses dans la lutte contre le cancer.

II.2.5.2. Maladies neurodégénératives

Une maladie neurodégénérative correspond à une pathologie progressive qui affecte le cerveau ou plus globalement le système nerveux, entraînant la mort des cellules nerveuses. Les plus célèbres et les plus fréquentes sont la maladie d'Alzheimer et la maladie de Parkinson mais il en existe d'autres.

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Figure 29 : Un aperçu de l’évolution de la maladie neurodégénérative Parkinson

Une étude recherchant des marqueurs moléculaires pour du développement neuronal précoce a permis d’identifier CISD2 (connue alors sous le nom de Noxp70). Par hybridation in situ, il a également été montré que CISD2 était surexprimée dans le cerveau. Ces résultats ont révélé qu’elle était fortement exprimée au niveau de la zone ventriculaire autour du ventricule telencéphalique et peu exprimée au niveau du thalamus/hypothalamus chez un embryon de 15 jours. Ces résultats ont été les premiers à suggérer l’impliquation de CISD2 dans le développement neural (Tamir et al., 2015).

Comme déjà mentionné, la maladie du Parkinson est très fréquente, et touche ainsi environ 1% de la population (des personnes âgées de plus de 65 ans). Il a été démontré que le maintien de l’intégrité et des fonctions mitochondriales sont essentiels pour le bon fonctionnement des cellules telles que les cellules neuronales. MitoNEET interagirait avec PARKIN, une protéine impliquée dans le développement précoce de la maladie de Parkinson. Ainsi, depuis quelques années une recherche assez intensive est apparue autour des protéines NEET comme cibles thérapeutiques dans les maladies neurodégénératives. (Okatsu et al., 2012).

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III. CISD2, une protéine Fe-S aux MAMs au carrefour de différentes voies

cellulaires

III.1. Localisation

Alors que son ancrage membranaire par son domaine N-terminal a été rapidement démontré, sa localisation a été sujette à discussion. Elle a tout d’abord été localisée au niveau du RE (Wiley

et al., 2007) puis à la surface de la mitochondrie (Chen et al., 2009) avant qu’il ne soit proposé

une localisation préférentielle au niveau des MAMs, sites de contact entre la mitochondrie et le RE (Wiley et al., 2013).

III.2. Structure et comparaison avec mitoNEET

Les séquences en acides aminés de CISD2 et mitoNEET sont très proches au niveau de leurs domaines cytosoliques (54% identiques et 69% similaires pour les protéines humaines). Concernant les séquences qui codent leur ancrage, chaque protéine se caractérise par une ancre membranaire qui conduit à sa localisation bien déterminée (au niveau du RE pour CISD2, et de la mitochondrie pour mitoNEET). Contrairement à mitoNEET, CISD2 possède un peptide relativement long (32 acides aminés) dans l’organelle (lumen du RE).

La structure cristallographique du domaine cytosolique de CISD2 humain a été résolue. Il est à noter qu’une mutation (C92S) a dû être introduite afin de limiter l’agrégation de la protéine purifiée (Conlan et al., 2009a).

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La comparaison des structures des domaines cytosoliques de mitoNEET et CISD2 humaines montre un repliement semblable avec les deux domaines caractéristiques à savoir un domaine de fixation du centre [Fe-S] et un domaine ß-cap (Conlan et al., 2009a).

Figure 31 : Comparaison des structures cristallographiques de CISD2 et mitoNEET humaines (Conlan et al., 2009a)

Malgré la grande similarité structurale entre CISD2 et mitoNEET, la variation de la labilité de leur centre vis-à-vis du pH semble être différente (Conlan et al., 2009a). Les deux protéines ont un potentiel d’oxydoréduction Em de 0 mV à pH 7,5.

III.3. Implications cellulaires

Les études cellulaires de CISD2 montrent qu’elle est au croisement de différentes voies cellulaires fondamentales (Mittler et al., 2018) telles que l’autophagie (Chen et al., 2010), l’apoptose (Iosub-Amir et al., 2019) les homéostasies du calcium (Wang et al., 2014), du fer et des EROSs (Tamir et al., 2013), et le maintien de l’intégrité de la mitochondrie (Chen et al., 2009).

III.3.1. CISD2 et destin cellulaire

Tout d’abord, CISD2 est impliquée dans la régulation du destin cellulaire à la fois en contrôlant l’induction de l’entrée de la cellule en autophagie et en étant impliquée dans l’apoptose.

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42 III.3.1.1. Autophagie et apoptose

L’autophagie est un processus d’auto-digestion qui permet la dégradation de composants intracellulaires par le lysosome, tandis que l’apoptose correspond à une mort cellulaire programmée.

L’autophagie est la voie majeure du catabolisme lysosomale qui permet la dégradation des macromolécules et des organites cellulaires. C’est un mécanisme d’adaptation cellulaire induit par différents stimulus ou stress dont notamment la carence nutritionnelle de la cellule. Ce mécanisme a un rôle de contrôle qualité du développement, de la mort cellulaire et contrôle la longévité cellulaire, l’immunité acquise et innée, et la survie cellulaire (contrôle qualité du cytoplasme, production d’énergie en cas de carence en substrat énergétique). L’autophagie est initiée dans le cytoplasme avec la formation d’une membrane qu’on appelle phagophore provenant d’un détachement membranaire issu du réticulum endoplasmique, suivie par la formation d’une vacuole contenant les macroéléments à dégrader (ou autophagosome) et finalement une fusion avec le lysosome (Lin et al., 2015).

L'apoptose est, quant à elle, un mécanisme cellulaire fondamental utilisé par les organismes multicellulaires pour éliminer les cellules qui ne sont plus nécessaires ou potentiellement nuisibles. Elle est essentielle pour l'homéostasie normale des tissus et elle est impliquée dans le renouvellement des cellules dans de nombreux tissus dans le cadre notamment du développement embryonnaire, la morphogenèse et la formation des organismes. Sa dérégulation est associée à diverses maladies ainsi qu'à des anomalies du développement. La machinerie apoptotique est très complexe et sophistiquée et les voies de signalisation qui conduisent à l'apoptose peuvent être divisées en deux voies principales : la voie extrinsèque (récepteur de mort) et la voie intrinsèque (mitochondriale) qui implique les mitochondries comme régulateurs centraux. Les stimuli qui initient cette voie comprennent notamment les dommages à l'ADN, le stress oxydatif, l'accumulation de protéines non repliées, la surcharge en calcium cytosolique. Tous ces stimuli induisent des changements dans la perméabilité des membranes mitochondriales qui entraîne la perte du potentiel transmembranaire mitochondrial, l'arrêt de la synthèse d'ATP mitochondrial et la libération de protéines pro-apoptotiques de l'espace intermembranaire dans le cytosol dont le cytochrome c (Cyt C) ce qui va permettre l’activation de caspases, protéases qui vont mettre en œuvre la mort cellulaire (Kondratskyi et

al., 2014).

L’autophagie est en lien étroit avec l’apoptose et reste en dualité (Mariño et al., 2014). En effet, selon, les conditions, l’autophagie va pouvoir participer et réguler les mécanismes de

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signalisation pro-apoptotiques soit participer à la régulation des mécanismes anti-apoptotiques. Ainsi, en carence nutritionnelle, l’autophagie cible les mitochondries qui sont destinées à être dégradées pour servir de substrat énergétique à la cellule et inhibe l’apoptose en empêchant les mitochondries d’initier les mécanismes d’apoptose via le cytochrome C (rôle anti-apoptotique) (Liu et al., 2012).

III.3.1.2. Famille de protéines BCL-2

La famille des protéines de type BCL-2 joue tout d’abord un rôle clé dans le contrôle de l’apoptose en intervenant dans la régulation très fine du relargage du cytochrome C. On distingue deux classes au sein de ces protéines : celles qui ont une action anti-apoptotique (survie) en bloquant l'efflux du cytochrome c vers le cytosol et celles qui ont une activité pro-apoptotique en le promeuvent. C'est l'équilibre entre ces deux sous-familles de protéines BCL-2 qui va permettre de réguler l’entrée de la cellule en apoptose (Kroemer et al., BCL-2010)

Les familles de protéine BCL-2 contient une vingtaine de membres qui peuvent être classés dans deux groupes en fonction de leur activité (pro- et anti-apopotique) et de leur structure. Elles possèdent un à quatre motifs conservés, appelés domaines d'homologie BCL-2, BH1 à BH4 qui correspondent à des segments hélicoïdaux qui affectent leur structure et leur fonction (Bajwa et al., 2017). Cependant, elles ont toutes en commun le domaine BH3 qui est essentiel pour leur dimérisation.

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Figure 32 : Ensemble des protéines de la famille BCL-2 associées à leur sous-groupe et leur localisation

Ainsi, les protéines de la famille BCL-2 contrôlent la perméabilisation de la membrane externe mitochondriale nécessaire à l’apoptose en se localisant directement sur cette organelle. Cependant, ces protéines sont également présentes dans d'autres compartiments intracellulaires tels que le RE, l'appareil de Golgi, le noyau et les peroxysomes et participent à divers processus cellulaires, l'homéostasie du calcium, le contrôle du cycle cellulaire et l’autophagie. Pour cela, BCL-2 qui possède 3 domaines BH différents (BH1, 2 et 3) formant une poche hydrophobe capable d’interagir avec les domaines BH3 des membres pro-apoptotiques de la famille Becline-like. En absence de signal induisant l’autophagie, BCL-2 se lie à la protéine Becline-1 et cette liaison empêche Becline-1 d’induire l’autophagie. Inversement, en présence de signaux induisant l’autophagie, la cellule va activer les membres pro-autophagiques tel que Bad (qui appartient à la famille BH3-only) qui vont déplacer l’interaction entre BCL-2 et Becline-1 en se liant à BCL-2. Becline-1 est libéré et va pouvoir induire l’autophagie (Chang et al., 2012). De manière intéressante, pour l’apoptose il en est de même concernant le mécanisme, en remplaçant Becline-1 par Bax.

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Références

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