Mise en évidence de la formation du complexe entre CISD2 et BCL-2

Pour bien étudier cette interaction, il faut trouver des techniques qui permettent de contrôler les différents paramètres qui pourraient affecter celle-ci : le pH, la force ionique, l’état rédox du centre [Fe-S] ainsi que la présence ou l’absence de ce dernier. Pourquoi s’intéresser à cette question de l’état redox ? En effet, si CISD2 est un senseur de stress oxydant on pourrait imaginer qu’en fonction de son état rédox elle va interagir ou non avec certains de ces partenaires comme BCL-2. Un exemple de protéine à centre [Fe-S] qui interagit avec ses partenaires en fonction de son état rédox est la protéine ShetnaII qui interagit avec la nitrogénase (chez les bateries) que lorsque son centre [Fe-S] est oxydé (Golinelli-Cohen et al., 2017).

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 A v anc em ent ( en % ) Temps (minute) pH 6.2 avec Bcl-2 pH 6.2 sans Bcl-2

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II.2.1 Le pull-down

J’ai essayé par cette technique biochimique classique de démontrer l’interaction entre les deux protéines. BCL-2 ayant une étiquette poly-histidine, j’ai décidé de l’utiliser pour fixer la protéine sur des billes à nickel. Une fois BCL-2 fixée, j’ai fait plusieurs lavages pour enlever la protéine non fixée sur les billes puis j’ai rajouté CISD2 (sans étiquette poly-histidine). La résine est ensuite lavée plusieurs fois par un tampon sans imidazole puis BCL-2 est éluée par addition d’un tampon avec imidazole. Les lavages et l’éluat final sont analysés sur gel de protéines dénaturant. Si CISD2 interagit avec BCL-2, alors CISD2 sera présent dans l’éluat final tandis que, dans le cas contraire, il sera présent dans les lavages de la colonne. J’ai réalisé un contrôle négatif pour lequel la même expérience est réalisée sans BCL-2 (cela permet de vérifier que les lavages permettent l’élimination complète de CISD2 non retenu par BCL-2 fixé sur la colonne.

Figure 92 : Schématisation de la technique de pull-down mise en place pour vérifier l’interaction entre CISD2 et BCL-2 .

J’ai réalisé l’expérience à plusieurs reprises (optimisation de la quantité de protéines dans la réaction pour être capable de les détecter par révélation au Coomassie, optimisation du nombre de lavages pour m’assurer un contrôle négatif de qualité), je n’ai jamais pu détecter BCL-2 dans l’éluat ce qui indique que BCL-2 n’a pas été élué de la colonne.

?

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Figure 93 : Dépôt de l’éluat et du lavage de l’expérience et de son contrôle négatif sur un gel SDS-PAGE

M étant le marqueur, A représente BCL-2, B représente CISD2, E pour les éluats et L pour les lavages. Le signe (–) représente le contrôle négatif de l’expérience.

Conclusion

Cette technique, normalement efficace pour démontrer l’interaction entre deux protéines n’a pu aboutir probablement à cause de la précipitation et du collage de BCL-2 sur la surface des billes à nickel, comme pour lors de l’étape de purification sur gel filtration.

II.2.2. La centrifugation analytique

La centrifugation analytique est apparue comme une méthode biophysique de choix car elle peut être réalisée en anaérobie (les cellules d’analyse sont alors montées en boîte à gants) et ainsi permettre d’étudier l’effet de l’état d’oxydation du centre [Fe-S] de CISD2 sur cette interaction. Cette étude a été réalisée en collaboration avec Christophe Velours de la Plateforme Interactions des Macromolécules - Institut de Biologie Intégrative de la Cellule UMR 9198 (CNRS, Gif-sur-Yvette).

La centrifugation analytique est une méthode d'analyse des suspensions et émulsions donnant des informations sur leur granulométrie, masse, leur taille, leur forme et leur composition. Les expériences réalisées sont suivies par absorbance à 280 nm et à 460 nm et interférence. Le suivi à 280 nm d’une première expérience réalisée avec 2,4 µM de BCL-2 a permis de monter la formation de deux espèces. L’espèce majoritaire possède un coefficient de sédimentation de 2.86S. CISD2 présente une seule espèce en absorbance à 280 nm, 460 nm et interférence avec un coefficient de sédimentation de 2.0S correspondant au dimère. De manière

BCL-2 CISD2

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très intéressante, le mélange de CISD2 à 23,4 µM en présence de 2,4 µM de BCL-2 entraine la disparition totale du pic à 2.86S et permet de d’observer deux pics en absorbance à 280 et 460 nm et en interférence avec un coefficient de sédimentation de 2.0 S (dimère de CISD2 dont l’amplitude diminue par rapport à CISD2 seul) et un nouveau pic à 3.5S.

`

Figure 94 : Analyse des données obtenues par ultracentrifugation analytique de BCL-2 à 2,4 µM (A) et CISD2 à 23,4 µM (B) par mesure de l’absorbance à 280 nm

Figure 95 : Analyse des données obtenues par ultracentrifugation analytique du mélange BCL-2/CISD2 à 2,4/23,4 µM par mesure de l’absorbance à 280 nm

D’autre part, l’analyse a également été faite par suivi de l’absorbance à 460 nm, longueur d’onde qui correspond au pic d’absorbance du centre [Fe-S] oxydé de CISD2. Le suivi à 460 nm permet ainsi de suivre les espèces contenant de l’holo-CISD2. Ainsi, lorsque holo-CISD2 est seule, on constate un seul pic à 2.0S tandis que l’addition de 2,4 µM de BCL-2 induit la formation d’un nouveau pic avec un coefficient de sédimentation de 3.5S.

A

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Figure 96 : Analyse des données obtenues par ultracentrifugation analytique par mesure de l’absorbance à 460 nm de CISD2 à 23,4 µM (A) et du mélange BCL-2/CISD2 à 2,4/23,4 µM mesuré par absorbance à 460 nm (B)

Ces analyses par ultracentrifugation analytique permettent de constater que la protéine BCL-2 est essentiellement monomérique en solution. En effet pour obtenir un coefficient de sédimentation de 2,6S avec un f/f0 (rapport des coefficients de friction) proche de 1,2 (valeur obtenue expérimentalement), il est nécessaire que BCL-2 soit monomérique. Cette expérience confirme aussi que holo-CISD2 est, quant à elle, dimérique en solution. En effet, pour obtenir un coefficient de sédimentation de 2,0S avec un f/f0 (rapport des coefficients de friction) proche de 1,44 (valeur obtenue expérimentalement), il est nécessaire que CISD2 soit dimérique. Ces valeurs de f/f0 indiquent que la protéine BCL-2 est globulaire tandis que le dimère de CISD2 est légèrement allongé. Lors de l’analyse du mélange CISD2/BCL-2, j’ai ainsi constaté la disparition à 280 nm du pic correspondant à BCL-2 monomérique. BCL-2 serait entièrement complexée et l’apparition à 460 nm d’une nouvelle espèce en plus du dimère d’holo-CISD2.

Conclusion

Ces résultats démontrent pour la première fois l’interaction entre CISD2 et BCL-2 entières in

vitro. Ainsi, j’ai pu par centrifugation analytique démontrer l’interaction entre CISD2 et

BCL-2. Il faudrait ensuite étudier les paramètres qui affectent cette interaction. Les premiers paramètres seraient des conditions de tampons avec le pH et la force ionique. Ensuite, il serait nécessaire d’étudier l’effet de la présence du centre [Fe-S] (il est peu probable que la forme apo-protéine soit capable d’interagir car comme démontré dans le chapitre 2 le centre de CISD2 joue un rôle prépondérant dans la structuration du domaine cytosolique) et de son état rédox.

A

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