Expression et purification de BCL-2 humaine

Afin de pouvoir réaliser les études biochimiques nécessaires à la bonne compréhension de cette interaction, il m’a fallu produire et purifier la protéine l’isoforme α de BCL-2 humaine, en quantités suffisantes pour la mise en œuvre des expériences.

I.1. Expression de BCL-2 humaine

Pour débuter mon travail j’ai surexprimé la partie cytosolique de la protéine BCL-2 humaine (∆220-239) dépourvue de son domaine transmembranaire C-terminal, avec une étiquette His-tag en C-terminal pour faciliter la purification et détecter facilement la protéine en immunoblot. BCL-2 ainsi exprimée renferme 239 acides aminés, avec un poids moléculaire de 25 kDa et un point isoélectrique de 6,95.

Figure 83 : Schématisation de la protéine BCL-2 (∆220-239) humaine produite avec l’étiquette His-tag en Cterminal.

La protéine a été produite à l’aide du plasmide pET28b-BCL-2∆(220-239) qui nous a été donné par notre collègue à l’ICSNEric Jacquet. Le protocole d’expression et de purification à partir de la protéine exprimée sous forme soluble proviennent aussi du laboratoire d’Eric Jacquet.

La protéine a été exprimée par transformation de la souche d’E. coli BL21(DE3) par le plasmide pET28b exprimant la protéine BCL-2 délétée de son domaine transmembranaire en N-terminal et fusionnée à une étiquette poly-histidine à son extrémité C-terminale. Tout comme pour

118

l’expression de CISD2, celle de BCL-2 est induite par addition d’IPTG lorsque la DO600 nm atteint 0,4 environ.

Figure 84 : Schématisation de la mise en place de la culture pour exprimer BCL-2 humaine

Le lendemain, les culots cellulaires sont collectés par centrifugation, resuspendus dans un tampon de lyse et broyés par sonication. Les extraits cellulaires sont ensuite centrifugés afin de séparer les protéines solubles (surnageant) et le reste (culot) comme décrit précédemment pour CISD2 (voir chapitre 3-III).

119

I.2. Purification de BCL-2 humaine

Puisque la protéine exprimée possède une étiquette poly-histidines à son extrémité C-terminale, l’utilisation d’une colonne à nickel demeure le choix le plus efficace pour une première étape de purification qui sera suivie par une gel filtration qui permettra d’enlever les impuretés restantes.

Figure 86 : Les différentes étapes de la purification de BCL-2

I.2.1. La colonne à nickel

Le surnageant jaune est chargé sur un colonne à nickel qui va retenir préférentiellement la protéine que j’ai exprimée car elle possède une étiquette poly-histidine. Après lavage de la colonne par un tampon contenant de l’imidazole en faible concentration pour éliminer les protéines en interactions non ou faiblement spécifiques, BCL-2 est éluée par application d’un gradient linéaire croissant d’imidazole. Typiquement, CISD2 est éluée avec 250 mM imidazole. L’éluât est fractionné et les fractions représentant le pic de l’élution sont analysées sur gel de polyacrylamide dénaturant. Les fractions contenant la protéine d’intérêt sont rassemblées et la purification se poursuit.

Figure 87 : Analyse sur gel SDS-page à 16% coloré au bleu de Coomassie des fractions présentant une absorption dans l’UV à l’issu de la colonne à nickel. M étant le marqueur et la protéine migrant a 26 kDa.

Colonne à nickel

• Fixation sur la colonne HiTrap Chelating HP 5mL, via le HisTag

Gel filtration

• Séparation des impuretés sur colonne superdex 75 Hiload 16/60

120

I.2.2. La gel filtration

J’ai réalisé cette étape afin d’éliminer des impuretés qui restaient après la première étape de purification. J’ai une première fois réalisée la chromatographie avec un tampon contenant 25 mM Tris-HCl pH 8 et 150 mM NaCl. Or, alors que j’ai injecté des quantités facilement détectables sur la colonne, la protéine n’était pas présente dans les fractions en sortie de colonne. J’ai alors changé le pH du tampon de chromatographie (essais à pH 7 ; 7,5 et 9) mais je ne suis pas arrivée à éluer la protéine de la colonne. BCL-2 possède une longue boucle non structurée comprise entre l’helice α1 et α2 qui lui procure une très forte tendance à s’agréger. Ainsi, à ce jour les structures RMN et cristallographique qui nécessitent une grande quantité de BCL-2 ont été réalisées avec une forme modifiée de la protéine pour laquelle cette boucle est remplacée par celle, plus courte, de Bcl-XL (Robbins et al., 2012). Il est donc fort probable que la présence de cette boucle soit à l’origine de la rétention de la protéine sur la colonne. Cependant, constatant que la protéine présente une pureté suffisante après la colonne à nickel, j’ai décidé d’utiliser la protéine obtenue après cette unique étape de purification.

Figure 88 : Analyse sur gel SDS-page à 16% colorée au Bleu de Coomassie de la protéine BCL-2 migrant a 26 kDa après la colonne a Nickel.

Pour finir, j’ai essayé de concentrer la protéine mais j’ai perdu une grande quantité en la concentrant (la concentration finale ne correspondant pas à la concentration espérée), problème toujours lié à l’agrégation de la protéine.

I.2.3. Conclusion

J’ai fait de nombreux essais de purification de BCL-2 humaine et j’ai rencontré de très nombreux problèmes liés à sa très forte capacité à s’agréger : non-élution de la colonne de gel filtration, perte lors de la concentration de la protéine purifiée. En conclusion, à partir de la fraction soluble de ma culture bactérienne, j’ai pu purifier BCL-2 humaine sans son domaine transmembranaire par une étape sur colonne nickel et j’ai décidé de concentrer très peu la protéine pour qu’elle n’agrège pas. Au final, la moyenne de la concentration obtenue après les

121

différentes purifications réalisées est de 14 µM, avec 2 mL obtenus par litre de culture. Pour bien m’assurer que la protéine purifiée est bien BCL-2, j’ai vérifié la protéine obtenue par immunoblot à l’aide d’un anticorps spécifique pour BCL-2.

Figure 89 : Analyse de la protéine purifiée par immunoblot à l’aide d’un anticorps reconnaissant spécifiquement BCL-2 .

(M représentant le marqueur, et P représentant BCL-2)