Spectroscopie d’absorption UV-visible

V.2.1. Principe de la spectroscopie d’absorption UV-visible

Cette technique est basée sur l’absorption des photos qui permet à une molécule de passer d’un état fondamental à un état excite ce qu’on appelle les transitions électroniques. Lors de cette transition, le photon absorbe une énergie définie par E=h𝛎 où h est la constante de Planck et 𝛎

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la fréquence du photon (𝛎 = 1/ λ avec λ correspondant à la longueur d’onde). On ne peut observer que les transitions de faible énergie, en d’autres termes les bandes d’absorption dans l’ultraviolet proche et dans le visible. La loi de Beer Lambert montre la dépendance entre absorbance et concentration de l’échantillon : A (λ) = ε (λ). l.[C] où [C] est la concentration de l’espèce en solution, l'absorbance A (λ) pour une longueur d’onde donnée de celui-ci, son coefficient d’extinction molaire ε (λ) et la longueur l du trajet parcouru par la lumière dans le milieu utilisé.

V.2.2 Matériel utilisé

Pour limiter le volume total de la réaction et réduire au maximum l’absorbance liée à la cuve afin d’avoir une ligne de base de bonne qualité, les cuvettes High-precision Cell (Hellma Analytics, référence 105-201-QS) sont utilisées. Celles-ci permettent d’utiliser un volume réactionnel de 160 μL. Les expériences sont réalisées à l’aide d’un spectromètre d’absorption UV-visible Cary 100 (Agilent) lié à un système de contrôle de la température. L’emplacement multi-cuves de cet appareil permet de suivre plusieurs réactions en parallèle.

V.2.3 Informations obtenues

Dans la partie UV du spectre (longueurs d’onde inférieures à 300 nm) l’absorbance (pic à 280 nm) est due essentiellement à la présence de doubles liaisons dans la chaine latérale d’acides aminés aromatiques (phénylalanine, tyrosine et tryptophane). L’absorption entre 300 et 600 nm (partie visible) est une signature du centre [Fe-S] coloré. L’aspect général du spectre et la position des maximums d’absorbance renseignent sur le type du centre [Fe-S] mais aussi sur son état d’oxydation.

V.2.4 Spectres d’absorption UV-visible de CISD2s

Le spectre de CISD2s oxydée présente plusieurs pics d’absorbance. La première partie du spectre est caractérisée par le pic à 280 nm, qui est dû à l’absorbance des chaines latérales des acides aminés aromatiques. La partie visible du spectre présente des pics à 350 et 460 nm représentatifs du centre [2Fe-2S] oxydé. Ces deux pics sont progressivement perdus lors de la perte du centre (passage de la forme holo à apo-CISD2s).. Par conséquent, lorsque CISD2s est entièrement sous forme apo le spectre est uniquement composé du pic à 280 nm.

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Figure 47 : Spectre d’absorption UV-visible de l’holo-CISD2s

La partie A correspond à la signature spécifique du polypeptide et la partie B représente la signature du centre [Fe-S] dans le visible.

Figure 48 : Spectre d’absorption UV-visible d’apo-CISD2s

La partie A correspond à la signature du polypeptide tandis que l’absorption dans la partie visible est très faible de par l’absence de centre [Fe-S].

0 0.2 0.4 250 350 450 550 650 750 850 Ab so rb an ce longueur d'onde (nm) -0.1 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9 1.1 250 350 450 550 650 750 850 Ab so rb an ce Longueur d'onde (nm)

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V.2.5 Etude de la stabilité du centre [Fe-S] de CISD2s

La perte de centre [Fe-S] de CISD2s est visualisable par spectroscopie d’absorption UV-visible par la diminution progressive de l’absorbance dans la partie visible du spectre. L’absorbance à 460 nm est suivie au cours du temps, ce qui permet ensuite de tracer l’avancement de la réaction. En effet, plus l’intensité du pic à 460 nm diminue, plus la perte du centre fer-soufre est importante, et par la suite on peut déduire l’avancement de cette réaction de perte du centre en suivant l’évolution de l’amplitude du pic à cette longueur d’onde.

Figure 49 : Spectre de l’absorbance de CISD2 en fonction des longueurs d’onde a différents temps t

Le suivi de l’absorbance a 460 nm nous permet de suivre l’évolution de la quantité de centre [Fe-S] dans CISD2 en fonction du temps et donc d’en déduire sa stabilité.

0 0.05 0.1 0.15 0.2 350 400 450 500 550 600 650 700 750 Ab so o rb an ce Longueur d'onde (nm)

0 min 5 minutes 10 minutes 15 minutes 20 minutes 140 minutes 200 minutes 260 minutes 320 minutes 380 minutes 440 minutes 500 minutes 560 minutes 620 minutes 680 minutes 740 minutes 800 minutes 860 minutes 920 minutes

68 V.2.5.1 Préparation des échantillons

20 μM d’holo-CISD2s sont ajoutés dans un tampon contenant généralement 50 ou 100 mM Bis Tris-HCl (pH allant jusqu’à 6,7) ou Tris-HCl (pH supérieurs à 7) et 100 mM NaCl. Si l’effet d’une molécule (H2O2, GSH, …) est testé, celle-ci est ajoutée dans le blanc et son effet est retiré avec le blanc de la réaction pour que les spectres obtenus au cours du temps soient uniquement dus à celle de CISD2s.

V.2.5.2. Suivi de la réaction et analyse des spectres

Les spectres ont été enregistrés au fil du temps et corrigés en enlevant les variations de ligne de base à 900 nm. Le changement de l’intensité du pic à 460 nm, caractérisant la perte du centre fer-soufre au cours du temps t, permet le calcul de l’avancement de la réaction de perte. La progression de la réaction au temps t a été estimée comme (R (t) -Rinitial) / (Rfinal-Rinitial) avec Rinitial, la valeur R initiale au temps 0 et Rfinal est la valeur R au temps nécessaire à l'achèvement de la réaction.

V.2.6. Expériences de transfert de centre [Fe-S] de CISD2s vers apo-FDX

La spectroscopie d’absorption UV-visible permet de visualiser le transfert de centre [Fe-S] entre CISD2s et l’apo-FDX en suivant les pics caractéristiques des deux protéines. Comme déjà vu, CISD2 est détectée par son pic à 460 nm. Par contre, le centre de la ferrédoxine donne un pic caractéristique a 415 nm. La distinction entre holo-CISD2 et holo-FDX est alors possible puisque ces deux espèces ne possèdent pas les mêmes pics d’absorbance dans le visible. Toutes les expériences de transfert sont réalisées en anaérobie (boite à gants-sauf indication contraire) afin d’éviter la ré-oxydation des cystéines libres. Cette technique a été développée au laboratoire par Cécile Mons (thèse réalisée en 2017 au sein de notre laboratoire).

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Figure 50 : Suivi du transfert du centre [Fe-S] de CISD2 à l’Apo-ferrédoxine

Le centre [Fe-S] de holo-CISD2s oxydée est transféré à apo-FDX (A). En fin de réaction, apo-CISD2s et holo-FDX sont obtenues. Les spectres d’absorption UV-visible correspondant à ces quatre espèces sont représentés en (B). (C) Suivi du transfert de centre [Fe-S] par évolution de l’absorbance à 415 et 460 nm et tracé de l’avancement de la réaction au cours du temps.

V.2.6.1. Préparation des échantillons

L’apo-FDX est réduite par 5 mM DTT pendant 30 minutes à pH neutre et à température ambiante. Si nécessaire, le DTT est enlevé de la réaction en utilisant une colonne Micro Bio-Spin 6 (Biorad) (III.1), suivi d’un dosage de la protéine. Holo-CISD2s et apo-FDX sont ensuite mélangées (20 μM de chaque) dans un tampon contenant 100 mM Bis Tris-HCl (pH allant jusqu’à 6,7) ou Tris-HCl (pH supérieurs à 7) et 100 mM NaCl.

V.2.6.2. Suivi de la réaction et analyse des spectres

Le transfert est suivi par acquisition de spectres d’absorption UV-visible à intervalles réguliers. Par exemple, cette acquisition est d’un spectre toutes les 5 minutes pendant une heure afin de mieux suivre le début du transfert puis toutes les 15, 30 et 60 minutes jusqu’à la fin de la réaction. Les spectres sont corrigés pour les variations de ligne de base au cours du temps comme décrit précédemment. Le calcul de l’avancement est calculé comme précédemment à la différence que R(t), Rinitial and Rfinal correspondent respectivement au ratio entre l’absorbance entre 415 nm (caractéristique de ferrédoxine oxydée) et 460 nm (caractéristique de

holo-B

A

C

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CISD2s oxydée) un instant t, au début et à la fin de la réaction. Si le transfert de centres [Fe-S] n’est pas total, une valeur théorique de Rfinal de 1,1 est utilisée.