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4 CARACTERIZAÇÃO DA SUBSTÂNCIA QUÍMICA DE REFERÊNCIA

De acordo com definição da OMS, padrões de referência farmacopeicos são produtos de uniformidade reconhecida, destinados ao uso em ensaios onde uma ou mais de suas propriedades serão comparadas com a da substância em exame (FARMACOPEIA BRASILEIRA, 2010).

Existem duas categorias de substâncias químicas de referência (SQR), as de origem farmacopeicas, que são as produzidas por fontes reconhecidas, como Farmacopeia Americana, Farmacopeia Européia, Farmacopeia Brasileira, entre outras e as não-farmacopeicas, que são substâncias com um elevado grau de pureza, entretanto necessitam ser criteriosamente caracterizadas a fim de elucidar sua estrutura química por meios de testes analíticos adequados (FDA, 2000b; SWARTZ e KRULL, 1998). Segundo o Food and Drug Administration (FDA), (2000b) as SQR não-farmacopeicas devem ser caracterizadas, quando aplicável, pelos seguintes métodos analíticos: espectroscopia na região do infravermelho (IV), espectrometria na região do ultravioleta (UV), espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN), espectrometria de massa (MS) e análise do grupo funcional.

4.1 SQR DE RISPERIDONA

A matéria-prima de risperidona, com teor declarado de 99,9%, foi gentilmente doada pela Cristália Produtos Químicos e Farmacêuticos Ltda. Para a caracterização da mesma, utilizaram-se as seguintes técnicas: faixa de fusão, espectroscopia na região do infravermelho, espectroscopia na região do ultravioleta, ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN

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H) e de carbono (RMN 13C) e volumetria.

4.2 MATERIAIS

Acetato de sódio (Synth – Brasil – Lote 167641); acetonitrila (MERCK – Alemanha – Lote: L631830212); ácido acético - (Synth – Brasil – Lote 168955); ácido clorídrico (Sigma-

Aldrich – Alemanha – Lote: SZBB2230V);brometo de potássio (J.T. Baker– Lote: C49668); filtro de seringa de celulose regenerada 0,45 µm (Sartorius Stedim – Alemanha – Lote: 17765); fosfato de potássio monobásico (Sigma-Aldrich – Alemanha – Lote: SZBA3560V); hidróxido de sódio (Sigma-Aldrich – Suíça – Lote: SZBA258AV); tetraidrofurano - (Tedia – EUA – Lote 1105236).

4.3 CARACTERIZAÇÃO DA MATÉRIA-PRIMA DE RISPERIDONA COMO SQR

4.3.1 Determinação do ponto de fusão

As análises pelo método do capilar foram realizadas em equipamento Electrothermal - Modelo 9100 (Reino Unido), previamente calibrado. A amostra foi compactada em tubo de capilar, com diâmetro de 1 mm e 7,5 cm de comprimento.

4.3.1.1 Resultados e discussão

Ponto de fusão pode ser definido como o momento, a uma dada temperatura, que uma substância passa do estado sólido para o estado líquido. É uma análise indicativa de pureza e de identificação de compostos, pois cada substância apresenta uma faixa de fusão característica, que pode ser alterada pela presença de contaminantes (FARMACOPEIA BRASILEIRA, 2010; GIL, 2010).

Daniel e colaboradores (2013) referenciaram uma faixa de fusão de 169 a 173 ºC e o The Merck Index (2006) um ponto de fusão a 170 ºC, para a risperidona. A amostra analisada fundiu em 170 ºC + 0,12 (n=3), valor semelhante ao encontrado na literatura pesquisada, sendo um indício de pureza do produto.

4.3.2 Espectrofotometria na região do ultravioleta

Foram preparadas soluções de risperidona em mistura de acetonitrila e THF (50:50), na concentração de 1000 µg/mL e posteriormente diluídas em acetonitrila, tampão ácido clorídrico pH 1,2, tampão acetato pH 4,5 e tampão fosfato pH 6,8, até a concentração de 10 µg/mL.

Traçaram-se os espectros da risperidona em cromatógrafo Shimadzu LC (Japão), acoplado com bomba modelo LC-20AT, injetor automático SIL-20A, forno da coluna CTO- 20AC, detector de diiodo SPD-M20A e software LC solution, na faixa de 200 a 400 nm, utilizando-se as condições cromatográficas previamente padronizadas.

4.3.2.1 Resultados e discussão

A espectrofotometria de absorção na região do ultravioleta não é uma técnica conclusiva para a identificação de fármacos, mas pode servir como um parâmetro importante para a escolha das bandas de absorção máxima da risperidona. Os espectros de absorção da risperidona em diferentes meios estão apresentados na figura 4.1.

Os espectros obtidos na análise da risperidona demonstraram perfis similares, independente dos solventes utilizados. Os picos máximos de absorção foram em 277 nm e 236 nm e, o mínimo em 253 nm. A risperidona é classificada como uma base forte, sendo praticamente insolúvel em água, moderadamente solúvel em etanol e acetonitrila, solúvel em diclorometano, tetraidrofurano e em soluções ácidas (BRITISH PHARMACOPOEIA, 2012; THE MERCK INDEX, 2001; THE UNITED STATES PHARMACOPEIA, 2013). Devido às variações de solubilidade do fármaco nos diferentes meios testados, podemos observar que a intensidade do sinal sofreu alterações, sendo maior em acetonitrila (A) e tampão ácido clorídrico pH 1,2 (B), onde é mais solúvel, e menor em tampão acetato de sódio pH 4,5 (C) e tampão fosfato pH 6,8 (D), onde é menos solúvel.

200 250 300 350 nm 0 5 10 15 20 25 30 35 mAU 5.15/ 1.00 200 250 300 350 nm 0 10 20 30 40 50mAU 5.39/ 1.00 200 250 300 350 nm 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90mAU 5.14/ 1.00 200 250 300 350 nm 0 10 20 30 40 50 60 70 mAU 5.20/ 1.00

Figura 4.1 -Espectros da risperidona, na faixa de 200 a 400 nm, obtidos por cromatografia a líquido de alta eficiência. Condições cromatográficas (coluna Waters® Bridge C8 (250 x 4,6

mm, 5 µm); fase móvel:acetonitrila, metanol, tampão fosfato pH 7,0 (45:15:40); vazão: 1mL/min.; volume de injeção: 20 µL). A:acetonitrila; B:tampão ácido clorídrico pH 1,2; C:tampão acetato 4,5; D:tampão fosfato pH 6,8.

Alguns trabalhos encontrados na literatura utilizam o detector na região do UV para a quantificação da risperidona, não somente para métodos espectrofotométricos como para métodos cromatográficos, em diferentes matrizes. Titier e colaboradores (2002) e Lu e colaboradores (2008) analisaram a presença da risperidona no plasma no comprimento de onda de 280 nm e Avenoso e colaboradores (2000), utilizando o mesmo tipo de amostra, detectaram a presença do fármaco em 278 nm. Dong e colaboradores (2012) e Silva e colaboradores (2012), determinaram a risperidona em nanoparticulas lipídicas sólidas, em 280 nm. Muthu e colaboradores (2009) e Prieto e colaboradores (2011), utilizaram a espectrofotometria para a determinação do fármaco em estudo em nanopartículas de PLGA e dendrimeros, nos comprimentos de onda de 279 nm e 280 nm, respectivamente. Na figura 4.1, podemos observar que praticamente existe um platô entre os comprimentos de onda que vão de 277 nm até 280 nm, o que explica a variação encontrada nos trabalhos acima citados.

B 280 C A D 2 77 2 77 2 77 2 77 2 36 2 36 2 36 2 36 2 53 2 53 2 53 2 53

4.3.3 Espectroscopia de absorção na região do infravermelho

A caracterização da matéria-prima de risperidona por espectroscopia de absorção na região do infravermelho foi realizada por meio da preparação de uma pastilha contendo 1,5 mg da amostra e 150 mg de brometo de potássio (KBr), em espectrofotômetro infravermelho com transformada de fourier, Perkin Elmer - modelo spectrum one - Japão.

4.3.3.1 Resultados e discussão

O espectro de infravermelho é único para cada substância, sendo pouco provável que duas substâncias que não são enantiômeros, apresentem o mesmo espectro nesta região. Uma análise das bandas características de determinados grupos permite a identificação da estrutura de moléculas (SILVERSTAIN; WEBSTER; KIEMLE, 2007).

O espectro de absorção do infravermelho obtido para a risperidona está apresentado na figura 4.2 e as suas principais bandas de absorção, com as respectivas frequências estão apresentadas na tabela 4.1. Os resultados encontrados estão de acordo com os dados da literatura, assegurando a identidade da matéria-prima.

Figura 4.2 - Espectro de absorção na região do infravermelho da risperidona em pastilha de KBr.

Tabela 4.1- Frequências de absorção das principais bandas de absorção da risperidona e suas respectivas atribuições

Frequência (cm-1) Atribuição

3055 Banda fraca correspondente a deformação axial C-H aromático. 1643 Banda forte correspondente a deformação axial C=Ocom estiramento

do anel -lactama.

1611 Banda de intermediária a forte, correspondente ao estiramento da ligação C=C do anel aromático.

1535 – região A Banda de intermediária a forte, correspondente ao C-N e C-O, com deformação angular do anel oxazol.

1193 Banda intermediária correspondente a amina terciária do anel piperidina.

1130 Banda forte correspondente ao flúor.

4.3.4 Espectroscopia de ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN 1H) e de carbono (RMN 13C)

Os espectros de RMN 1H e de RMN 13C da risperidona fora realizados em equipamento Bruker, modelo AM 4000 (Alemanha), utilizando clorofórmio-D (CDCl3) como

solvente.

4.3.4.1 Resultados e discussão

As atribuições dos hidrogênios da molécula de risperidona estão descritas a seguir, com seus respectivos deslocamentos químicos, multiplicidade, número de hidrogênios envolvidos e sua localização, de acordo com a estrutura química e espectro apresentado na figura 4.3.1H NMR (CDCl3, 400 MHz)  = 1,65 (q, J = 2,20 Hz, 2 H, H7‘, 8‘), 1,88 (q, J =

2,05 Hz, 2 H, H 11, 15), 2,31 (s, 3 H, H18), 2,28 – 2,38 (m, 4 H, H 12, 14), 2,55 (t, J = 2,09 Hz, 2 H, H 17), 2,77 (t, J = 2,09 Hz, 2 H, H 16), 2,87 (t, J = 2,13 Hz, 2 H, H 9), 3,036 – 3,14

(m, 4 H, H 10), 3,94 (t, J = 2,05 Hz, 2 H, H 6’), 7,05 (dt, J = 1,01 Hz, 1H, H 7), 7,23 (dd, J = 0,96 Hz, 1 H, H 5), 7,70 (dd, J = 1,00 Hz, 1 H, H 8) ppm.

Figura 4.3 - Espectro de RMN 1H em CDCl3 da risperidona e sua respectiva estrutura

química.

As atribuições dos carbonos da molécula de risperidona estão descritas a seguir, com seus respectivos deslocamentos químicos, números de carbonos envolvidos e sua localização, de acordo com a estrutura química e espectro apresentado na figura 4.4.13C NMR (CD Cl3,

100 MHz)  = 19,17(C8‘); 21,19(C7‘);21,92(C18), 23,75(C17), 30,54 (2C, C11, C15), 31,36(C9‘), 34,57(C10), 42,55(C6‘), 53,32 (2C, C12, C14), 56,66 (C16), 97,27 (d, C5), 112,45 (d, C7), 117,27 (C9), 119,27(C3C), 122,49 (d, C8), 155,80(C10), 158,31(C2‘), 162,49(C1) , 162,74(C4‘), 163,79 (d, C6), 165,23(C4) ppm.

De acordo com a literatura consultada, a interpretação dos espectros de RMN 1H e RMN 13C demonstrou que os sinais obtidos estão de acordo com as atribuições esperadas para a molécula de risperidona e com os grupamentos químicos presentes (CHUN et al., 2004; DANEL et al., 2008; SILVERSTAIN; WEBSTER; KIEMLE, 2007).

Figura 4.4 - Espectro de RMN 13C em CDCl3 da risperidona e sua respectiva estrutura

química.

4.3.5 Quantificação da risperidona

Dissolveu-se 160 mg de risperidona em 70 mL da mistura de ácido acético e metil etil cetona (10:60) e titulou-se com ácido perclórico 0,1 M, previamente padronizado. Determinou-se o ponto final potenciometricamente com auxílio de titulador automático Metrohm 809 titrando (Suiça). Cada mL de ácido perclórico 0,1 M equivale a 20,53 mg de risperidona (BRITISH PHARMACOPOEIA, 2012).

4.3.5.1 Resultados e discussão

Os valores obtidos no doseamento da risperidona estão descritos na tabela 4.2 e uma imagem da curva de titulação obtida está representada na figura 4.5. O fato de correção encontrado na padronização da solução volumétrica foi de 0,9994.

Tabela 4.2 - Resultados obtidos no doseamento da matéria-prima de risperidona por método volumétrico. Teor (%) Média (%) DP DPR (%) 100,00 100,08 99,99 0,085 0,085 99,91

A British Pharmacopoeia (2012) especifica que a matéria-prima de risperidona deve ter seu teor dentro dos limites de 99,0 a 101,0%. Os resultados encontrados estão dentro dos valores descritos na literatura oficial e coerente ao resultado declarado pelo fornecedor, que foi de 99,9%.

Figura 4.5 - Representação gráfica da curva de titulação obtida no doseamento da risperidona matéria-prima.

4.4 CONCLUSÕES

 A substância candidata a SQR de risperidona apresentou faixa de fusão semelhante à preconizada na literatura;

 A interpretação do espectro no infravermelho demonstrou que as bandas obtidas estão de acordo com as atribuições esperadas para a molécula de risperidona;

 A interpretação do espectro de RMN 1

H e de RMN 13C demonstrou que os sinais obtidos estão de acordo com as atribuições esperadas para a risperidona;

 O teor da risperidona, determinado por método volumétrico, está dentro dos limites farmacopeicos estimados para esse fármaco e de acordo com o declarado pelo fabricante;  Tendo em vista os resultados obtidos, concluímos que a matéria-prima de risperidona

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Capítulo 5. Determinação da solubilidade da risperidona em diferentes