D. Diagnostic de l’infection par le SARS-CoV-2
3. Diagnostic biologique de l’infection par le COVID-19
a. Diagnostic biologique non spécifique
De nombreuses modifications biologiques accompagnent l’infection par le SARS-CoV-2 :
Bilan hématologique
A la numération Formule sanguine on retrouve Une Elévation des polynucléaires neutrophiles et une lymphopénie, étendue aux lymphocytes CD4 et CD8 (dont le ratio CD4/CD8 semble préservé). L’anémie et la thrombopénie semblent rares. [92]. Au bilan de la coagulation sont observés une diminution du TP (jusqu’à 94 % des
patients) et une augmentation des D-dimères (23,3–46,4 %), stigmates d’une coagulopathie associés aux formes graves et prédictives de la mortalité [93].
Bilan biochimique
Elévation de la CRP (60,7–85,6 %), jusqu’à 150 mg/L, hypoalbuminémie (médianes 32–32,3 g/L), hyperferritinémie (78,5–80 %) [93].
Elévation des ALAT/ASAT dans environ 25 % des cas (21,7–31 %) et hyperbilirubinémie (5,1–10,5 %) [92].
Elévation des LDH pour environ 40 % des patients (13–98 % selon le seuil choisi dans les études)
Elévation de la troponine chez 17 % des patients avec 23 % d’insuffisance cardiaque aiguë [93].
Alcalose respiratoire chez 28 % des patients, probablement secondaire à la polypnée [94].
L’insuffisance rénale aiguë apparaît peu fréquente (jusqu’à 4,5 %) alors que l’élévation de l’urée pourrait être associée à un pronostic péjoratif [92].
b. Diagnostic biologique spécifique
b. 1. Phase pré-analytique
b. 1.1 .Précautions à prendre par le personnel avant le prélèvement
La littérature rapporte des cas de contamination du personnel médical, toutefois aucun cas de contamination du personnel de laboratoire n’a été décrit [95].
Les précautions à prendre avant le prélèvement sont :
Faire porter un masque chirurgical au patient à prélever
Le préleveur s’équipe de lunettes de protection, d’un masque FFP2, d’une blouse, d’une surblouse, d’une paire de gants.
Faire asseoir le patient.
Enlever le masque chirurgical du patient. Réaliser le prélèvement naso-pharyngée
Nettoyer les surfaces aux désinfectants usuels virucides tels que l’hypochlorite de sodium 0,5%, l’acide peracétique/peroxyde d’hydrogène, l’éthanol ou l’isopropanol à 70%, glutaraldéhyde...selon la norme EN 14476 en respectant les recommandations du fabricant (respect de la concentration et du temps de contact).
Enlever les équipements de protection individuelle dans l’ordre suivant = gants puis surblouse puis faire une friction des mains avec une solution hydroalccolique et enfin enlever lunettes et masques. Désinfecter les lunettes de protection. Conserver le masque 4 heures.
Se laver les mains.
Selon les recommandations de l’OMS, les prélèvements microbiologiques d’un patient suspect de la COVID-19 peuvent être manipulés au niveau d’un laboratoire de sécurité biologique niveau 2 et cela en respectant les bonnes pratiques de travail, surtout au cours de la manipulation qui peut entrainer accidentellement des aérosols, d’où l’intérêt de mettre à disposition du personnel du laboratoire une conduite à tenir pratique en cas d’incident. La culture du virus peut se faire dans un laboratoire biologique de niveau 3 [96].
b. 1.2 Prélèvements
Les prélèvements à réaliser pour le diagnostic de COVID-19 sont par ordre de sensibilité : le lavage broncho-alvéolaire (93 %), les expectorations (72%), les écouvillonnages nasopharyngé (63%), et les écouvillonnages oropharyngé (32%). Ce dernier prélèvement doit être répéter pour diminuer le taux des faux négatifs [97].
b. 1.3 . Modalités de conservation et de transport
Les modalités de conservation des prélèvements pour le diagnostic du COVID-19 sont illustrées dans le tableau 2.
Les prélèvements respiratoires sont acheminés au laboratoire par un transporteur en utilisant un conditionnement de catégorie B (norme UN 3373)/triple emballage (tube – contenant rigide à visser – Biotainer rigide UN 3373). Ne pas utiliser de pneumatique.
Tableau 2: Modalités de prélèvement et de conservation des prélèvements pour le diagnostic du COVID-19 [98].
b. 2. Phase analytique
b. 2.1 Diagnostic direct
Le diagnostic direct est un diagnostic biologique mettant en évidence la présence directe soit du Virus lui-même (culture cellulaire-Microscopie électronique), ou de l’un de ses constituants notamment le génome par biologie moléculaire, et les Ag viraux par technique immuno-enzymatique.
b. 2.1. 1 Biologie moléculaire
Deux protocoles de détection de virus par biologie moléculaire ont été proposés, la RT-PCR en temps réel et le séquençage de nouvelle génération. Au Maroc, la détection qualitative de l’ARN viral se fait par la technique de référence qui est la RT-PCR en temps réel également appelée PCR quantitative (ou q PCR ou rRTPCR), qui est une technique précise, efficace et rapide pour la détection des acides nucléiques.
C’est une méthode qui consiste à mesurer la quantité d’ADN polymérisé à chaque cycle (temps réel) grâce à un marqueur fluorescent, ce qui permet de suivre l’augmentation de la fluorescence et de la quantité d’ADN au fil des cycles en temps réel (d’où l’appellation) [99].
b. 2.1. 2 Isolement du virus par culture cellulaire
Selon le postulat traditionnel de Koch, la culture virale est le gold-standard pour le diagnostic de virus en laboratoire. Le spécimen est cultivé et incubé avec des cellules primaires de singe et des lignées cellulaires telles que Vero et LLC-MK2 pour l'apparition d’effets cytopathiques caractéristiques (CPE). Une recherche a révélé qu'un CPE distinct a été observé dans les lignées cellulaires Vero après 6 jours d’inoculation de SARS-CoV-2 [100].
L’effet cytopathogène désigne l’ensemble des altérations métaboliques, biochimiques et morphologiques d’une cellule hôte infecté par un virus.
La réplication virale mobilise en effet l’essentiel des ressources biochimiques de la cellule, qui s'en trouve profondément impactée d'une façon spécifique à chaque virus.
Concernant l’isolement du SARS-CoV-2, l’ECP est traduit par des cellules abimés qui se regroupent.
La confirmation des cas est basée sur la détection de séquences uniques d’ARN viral par la technique de transcription inverse suivie de réaction en chaîne de la polymérase en temps réel (rRT-PCR) avec confirmation par séquençage de l’acide nucléique si nécessaire.
Cependant, le CDC (centers for desease control and prevention) (2020) recommande uniquement la culture virale à des fins de recherche, comme recherche antivirale, recherche sur la pathogenèse et la stabilité des virus, mais pas pour le diagnostic positif en pratique courante car la culture virale nécessite des laboratoires de niveau 3 de biosécurité avec un personnel qualifié et expérimenté [101].
(a) (b)
Figure 12: (a) tapis cellulaire non abîmé par les virus (b) tapis cellulaire avec effet cytopathogène (ECP) visible, les cellules infectées par le virus sont détruites.
b. 2.1. 3 Microscopie électronique
La microscopie électronique peut aider à visualiser le virus et à reconnaître les détails ultra- structuraux des cellules infectées. La visualisation du coronavirus en microscopie électronique a révélée un virus sphérique entouré de pointes en couronne (protéine S en microscopie électronique) responsable de sa nomination [100].
Les premières images du nouveau virus SARS-CoV-2 à l'origine de la pandemie COVID-19 sont issues du laboratoire Rocky Mountain (RML) du National Institute of Allergy and Infectious Diseases (Niaid), qui a analysé un échantillon issu d'un patient américain.
L'image est une combinaison de deux techniques :
La microscopie électronique à balayage (MEB), qui permet de visualiser la surface et la forme d'un échantillon en détectant les électrons qui rebondissent, et la microscopie à transmission qui permet d'observer l'organisation et la structure interne du virus. Elle a ensuite été colorisée artificiellement.
Figure 13 : Image de ME d’un coronavirus [102].
b. 2.1. 4 Recherche antigénique
Comme le virus se réplique activement, les antigènes viraux sont fortement exprimés et peuvent être détectés par dosage immunologique. [103].
La recherche des antigènes viraux consiste à détecter les protéines du virus produites par la réplication du virus au sein des cellules infectées présentes dans les prélèvements des patients. Les antigènes viraux peuvent être visualisés par les techniques immuno-sérologiques mettant en évidence la spécificité de la réaction Ag-Ac.
Parmi les techniques les plus utilisées pour cette recherche, on cite :
La technique immuno-enzymatique ELISA et la technique d’immuno-fluorescence, qui utilise des anticorps spécifiques à chaque virus marqués par la fluorescéine [104].
b. 2.2 Diagnostic indirect
Ce diagnostic va mettre en évidence la présence de l’infection virale indirectement par la recherche des anticorps produits par l’organisme suite à l’invasion virale.
b. 2.2. 1 Technique immuno-enzymatique (ELISA)
Les tests ELISA sont des tests simples, rapides qui testent des échantillons de sérum ou de plasma de patients infectés. Le diagnostic par ELISA est basé sur la détection des anticorps IgM et IgG dirigés contre la nucléoprotéine Rp3 du SARS-CoV-2 au cours des premiers stades de la maladie COVID-19 [105].
Okba et al.7 ont développé des tests sérologiques se basant sur la technique ELISA pour la détection des anticorps dirigés contre les protéines N et S, ainsi que les sous-unités S1 et le domaine de liaison au récepteur (RBD) de la protéine S du SARS-CoV- 2. Ces auteurs ont indiqué que la sous unité S1 est l'antigène le plus spécifique pour le diagnostic du COVID-19 et que la sous-unité S2 est la plus conservée, jouant ainsi un rôle dans la réactivité croisée avec la protéine S du MERS-CoV [106].
Des rapports de la littérature suggèrent que des résultats « faux positifs » peuvent survenir avec une infection par le SARS-CoV-1, car la protéine N est extrêmement conservée parmi les β-coronavirus infectant l'homme [107].
Bien que l'ELISA pour la détection de la protéine S soit plus spécifique, chez les patients présentant une infection légère, les protéines N et RBD étaient plus sensibles que S1, indiquant la nécessité de détecter des anticorps contre différents antigènes pour éviter des résultats faux négatifs [108].
Figure 14 : Schéma de la technique immuno-enzymatique ELISA
b. 2.2. 2 Immunofluorescence indirecte (IFI)
C’est une technique immunologique dans laquelle les anticorps spécifiques présents dans le sang de la personne, se lient aux antigènes viraux préalablement fixés sur des puits des lames de verre et qui seront détectés par des anticorps secondaires marqués par un fluorochrome dirigé contre les IgG ou les IgM humains, ou les deux et qui les rends brillants d'une couleur vert pomme lorsqu'on les examine sous un microscope à fluorescence ,ce test
Les résultats d’IFI peuvent également être obtenus en quelques heures.
La technique d’IF donne généralement des résultats positifs autour du 10ème jour suivant le début de la maladie. Les résultats peuvent être quantifiés en utilisant des dilutions en série des sérums des patients.
Ce test peut générer des faux positifs. La réactivité croisée aux protéines virales conservées limite l'utilisation de ces IFI à base de virus entiers, surtout que des anticorps contre les coronavirus d'un genre sont généralement connus par les Ag du virus entier des autres genres.
Figure 15 : Schéma du principe de l’immunoflurescence indirecte (IFI)
Si un échantillon clinique est positif à la fois par ELISA et IFI, l'échantillon est déclaré positif.
Si un échantillon clinique est positif par ELISA mais indéterminé ou négatif par IFI, Il faut effectuer ensuite un test de confirmation supplémentaire.
b. 2.2. 3 Test de neutralisation
Le test de neutralisation virale (VNA viral neutralization assay) est une méthode très sensible et spécifique généralement utilisée pour étudier la réponse des anticorps à un virus et étudier l'inhibition de la réplication virale. C’est un type spécialisé de dosages immunologiques car il ne détecte que les anticorps qui peuvent inhiber la réplication du virus et pas toutes les réactions antigène-anticorps. . Ceci est très important car les antigènes courants peuvent être partagés par des groupes de virus apparentés, mais seuls certains de ces antigènes sont ciblés par les anticorps neutralisants [109].
Le VNA peut être utilisé pour le sérotypage car un sérotype viral est généralement basé sur sa neutralisation comme dans le poliovirus, qui est connu pour avoir trois sérotypes majeurs (sérotypes de neutralisation). Par conséquent, un vaccin efficace contre le poliovirus doit induire des anticorps neutralisants contre tous les sérotypes (types 1, 2 et 3) pour protéger de l’infection [109].
La méthode conventionnelle de ce test est basée sur l'inhibition du virus en neutralisant les anticorps dans culture de cellules. Le titre des anticorps neutralisants peut être déterminé sur la base de la présence / absence d’effets cytopathiques (CPE) ou coloration intracellulaire si vous utilisez une technique d'immunocytochimie (ICC); et par conséquent, la dilution de sérum la plus élevée qui inhibe l'infectivité établit le titre [110]. Tests VNA se déroulent en quatre étapes, y compris la dilution du sérum, l'incubation du sérum et du virus, la culture cellulaire inoculation et détection. Bien que le VNA soit très sensible, il est plus complexe, il prend du temps et nécessite une main-d'œuvre possédant de bonnes compétences techniques pour effectuer le test par rapport à d'autres tests sérologiques [111].
Face à la nouvelle épidémie de COVID-19, le développement de méthodes prophylactiques et thérapeutiques évolue à un rythme accéléré en employant diverses approches, notamment vaccin à virus entier inactivé, vaccin sous-unitaire, vaccin à vecteur viral et neutralisation monoclonale anticorps.
Figure 16 : Test de neutralisation de coronavirus
b. 2.2. 4 Test rapide d’orientation diagnostique
Tests immuno-chromatographiques étudiés dans le cadre du COVID-19. Il s’agit d’un test rapide réalisé par application d’une goutte de l’échantillon du patient (sang total, sérum ou plasma) et d’un tampon spécifique sur un bâtonnet immunochromatographique. Par attraction capillaire, l'analyse d'intérêt (une protéine ou un peptide du SRAS-CoV-2) se lie à son anticorps spécifique dans une zone de réaction et la réaction antigène-anticorps sera mise en évidence par la formation d'une bande colorée (or colloïdal présentant un couleur rouge ou sélénium colloïdal présentant une couleur bleue). Cette réaction doit toujours contenir un contrôle de test (bande qui apparaîtra toujours), ainsi qu'une ou deux autres bandes; une bande lorsque le test détecte des anticorps totaux anti-SRAS-CoV-2 et deux bandes lorsque le test différencie l'anticorps IgM et IgG
Culture des cellules Infection Acquisition et analyse des données
Placer les cellules vero dans une plaque de puits
de culture
Mélanger les coronavirus avec les anticorps et les placer sur la couche des cellules vero pour induire une infection
Colorer les cellules vivantes et tracer la courbe pour calculer IC50 où la concentration d'anticorps montre 50% de neutralisation
Figure 17 : Test rapide pour le diagnostic du COVID-19 [112].
b. 2.2. 5 Cinétique des anticorps dans la COVID-19
Guo et al. Ont montré, que les IgA et IgM anti-protéine de la nucléocapside sont détectés dans un délai médian de cinq jours après l’apparition des premiers symptômes dans 85,4 % et 92,7 % des cas respectivement. Les IgG sont détectées dans un délai médian de quatorze jours et dans 77,9 % des cas. L’association RT-PCR et test Elisa IgM détectent 98,6 % des cas [ 113].
Une seconde étude portant sur 173 patients a montré un délai plus long pour la détection des IgM anti protéine M, avec un délai médian de douze jours [ 114].
La littérature décrit que la réponse IgM aux protéines S et N SARS-CoV-1 atteint son maximum quatre semaines après le début des symptômes et n'est plus détectée trois mois après l'apparition des symptômes, tandis que la détection des IgG a été détectée vers le 14e jour après le début des symptômes, et restent détectables jusqu'à 36 mois. Dans le cas du SARS-CoV-2, une étude portant sur 34 patients a montré une positivité pour les IgM et les IgG à la 3ème semaine après l'apparition des symptômes, avec une diminution des taux d'IgM à la 4ème semaine et une augmentation des IgG de la 4ème à la 7ème semaine après l'apparition des symptômes [115].