Description précise du modèle murin oro-oculaire

III.1.3Description précise du modèle murin oro-oculaire

L’inoculation de la suspension virale est réalisée dans la lèvre gauche de la souris. Une lésion vésiculaire labiale, comparable à un bouton de fièvre, est observée au 2^ème jour pi en regard du site d’inoculation. Au 4^ème jour pi, une infection généralisée apparaît chez toutes les souris, caractérisée par un hérissement du poil et une perte de poids. Une infection oculaire, essentiellement de l’iris, du corps ciliaire, et de la cornée est observable chez les deux tiers des souris à 6 jours pi., dont la moitié (soit un tiers de l’effectif total) décède entre le 6^ème et le 10^ème jours pi , alors que les symptômes régressent chez les autres souris jusqu'a disparaître complètement. L’analyse systématique des tissus de souris euthanasiées pendant les 10 premiers jours de l’infection à montré que la propagation du virus HSV-1 se fait depuis la lèvre dans plusieurs voies neuronales de façon parallèle (Labetoulle et al, 2000).

La première chaine neuronale positive pour l’expression d’antigènes viraux est la voie autonome sympathique. Depuis la lèvre, le virus emprunte les terminaisons nerveuses sympathiques jusqu’au ganglion cervical supérieur (SCG) gauche, premiers relais sympathique. Après réplication dans les neurones du SCG, qu’il infecte totalement, le virus remonte la chaine sympathique pour gagner la colonne intermédiolaterale gauche (IML) de la moelle épinière, avant de passer dans l’IML droite entre le 8^ème et 10^ème jour chez un tiers des animaux.

99 En parallèle, le virus emprunte les terminaisons sensitives depuis la lèvre gauche jusqu’au ganglion trigéminé (TG) gauche, siège de l’innervation sensitive de la face, qu’il atteint entre le 4^ème et le 6^ème pi, pour se répliquer dans les corps neuronaux avant de se propager dans le noyau du tractus spinal trigéminé de l’hypothalamus, la zona incerta, le thalamus ventro-postérieur, qui sont donc les relais secondaires de l’infection du système sensitif. Enfin, le virus injecté dans la lèvre se propage aussi via les terminaisons nerveux motrices situées dans la lèvre jusqu’au noyau moteur facial, responsable de l’innervation motrice d’une grande partie des muscles de la face.

Toutes ces données sur la propagation de HSV-1 depuis la lèvre sont parfaitement expliquées par les propriétés de transfert antérograde ou rétrograde du virus au sein d’un réseau de neurones connectés entre eux par de synapses, car on sait que les particules virales se déplacent depuis les noyaux des neurones jusqu’à leurs extrémités en empruntant les réseaux architectonique des dendrites et des axones. Cependant, le virus HSV-1 a aussi une capacité de transfert local, c’est à dire de passer entre deux neurones adjacents situés dans une même structure anatomique mais non connectés entre eux par une synapse (Labetoulle et al, 2000).

Dans le modèle oro-oculaire, le virus peut ainsi se propager dans d’autres réseaux neuronaux que les seules voies sympathiques, sensitives et motrices décrites précédemment. Ainsi, les long des voies sensitives, les particules virales fabriquées dans les corps des neurones du TG dont les terminaisons innervent la lèvre peuvent aussi se propager à d’autres neurones sensitifs tels que ceux innervant le segment antérieur de l’œil. Cela explique l’infection irienne et cornéenne observée entre le 6^ème et le 8^ème jour pi. De même, les particules virales qui suivent les neurones depuis le TG jusqu’à l’œil via les voies sensitives rencontrent les neurones parasympathiques lors de leur passage dans le ganglion ciliaire, lui aussi infecté à 6 jours pi. Le transfert local dans cette structure explique les atteintes du noyau d’Edinger-Westphall puis du noyau paraventriculaire et du colliculus supérieur observées ce modèle. Un schéma simplifié de ces voies de propagation est proposé dans le schéma ci-dessous.

En complément des données de propagation virale obtenues par analyse immuno-histologique de l’expression des antigènes viraux, le modèle oro-oculaire a aussi été largement utilisé pour analyser l’évolution des marqueurs biologiques moléculaires de l’infection virale. Ces données seront largement reprises dans les deux articles présentés dans

100 ce manuscrit. En bref, entre la phase aigu (6^ème jour pi) et latente (28^ème jour pi), il fut observé une extinction des transcrits précoces codant la thymidine kinase et des transcrits tardifs codant UL18, comme attendu lors de la mise en place de l’infection latente. Parallèlement était observé une réduction du nombre de copie d’ADN génomique dans toutes les structures et une augmentation des LAT dans les TG, alors que les quantités de LAT avaient plutôt tendance à diminuer dans les autres structures testées (moelle, SCG, hypothalamus) (Labetoulle et al, 2003, Maillet et al, 2006, Crepin et al, soumis).

Figure 30: Représentation de la propagation du virus HSV-1 âpres injection dans la lèvre d’une suspension virale de la souche SC16 du virus HSV-1 au cours du temps. (adapté de Labetoulle et al., 2003). AP : area postrema ; CG : ganglion ciliaire ; EW : noyau d’Edinger-Westphal ; TG : ganglion Trigéminé ; IML : colonne intermédiolatérale de la moelle ; Pa : noyau para ventriculaire ; SCG : ganglion cervical supérieur ; Sch : noyau suprachiasmatique ; Sol : noyau du tractus solitaire ; SP5 : noyau du tractus spinal trigéminé ; 7 : noyau du nerf facial.

III.2

Type de souris utilisées

Nous avons utilisé des souris consanguines BALB/c femelles de 6 semaines. L’âge de 6 semaines a été choisi en raison de l’existence d’un plateau de sensibilité à l’infection herpétique entre les âges de 4 et 12 à 14 semaines. Si les souris sont infectées trop jeunes, le risque est celui d’une trop grande sensibilité conduisant à la mort rapide des individus, ce qui est incompatible avec la compréhension des mécanismes de mise en place de l’infection latente. A l’inverse, l’utilisation d’animaux trop âgés est liée à une moindre reproductibilité de la sensibilité à l’infection, et donc à la nécessité d’utiliser plus d’individus pour obtenir le nombre suffisants d’animaux réellement infectés. La souche de souris Balb/c a été choisie

Lèvre (1) SCG (2) TG (4)

7

101 pour sa susceptibilité à l’infection par HSV1 (Lopez et al, 1975, Pepose et Whittum-Hudson 1987), ce qui permet de réduire le nombre d’individus utilisés. De même, la consanguinité des souris a permis de réduire les variations inter-individuelles (Lopez et al, 1975) et donc le nombre d’individus à utiliser pour obtenir des résultats fiables.Enfin, notre choix était guidé par le fait que le modèle d’infection oro-oculaire a été initialement caractérisé avec cette souche de souris, ce qui permettait, encore une fois, de réduire le nombre d’individus inclus dans les études au plus strict minimum pour obtenir des résultats analysables sur le nombre puisque les doses de virus pour induire tel ou tel type d’infection avaient été préalablement étalonnées (Labetoulle et al, 2003).

Toutes nos démarches expérimentales ont tenté de répondre à la consigne de « réduction » mise en valeur dans le règles d’éthique de l’expérimentation animale. De même, tous les animaux ont été nourris et abreuvés sans restriction tout au long de l’étude, conformément aux standards actuels des règles d’éthique, en particulier celles de l’Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Statement for the Use of Animals in Research.

III.3

Souche virale

Les résultats présentés dans ce travail de thèse ont tous été réalisés avec la souche SC16 de HSV-1. Il s’agit d’une souche sauvage, isolée en Angleterre à partir de lésions herpétiques buccales d’un patient (Hill 1975). Cette souche est considérée comme hautement neurovirulente (Shimeld et al, 1985, Ugolini et al, 1987, Ugolini et al 1992). Son principal avantage est son caractère sauvage, c’est à dire l’absence de modifications génomiques majeures liées à des processus d’adaptation aux conditions de laboratoires. Elle est don supposée refléter, au moins en partie, la virulence réelle des souches de HSV-1 humaines, à la différence d’autres souches utilisées pourtant de façon courante par un grand nombre d’équipes de recherche. C’est la cas par exemple de la souche KOS, très souvent utilisée dans le domaine de la recherche sur les mécanismes de régulation de l’infection herpétique latente. On sait en effet que la souche KOS est caractérisée par des mutations dans la glycoprotéine B (fortement impliqué dans les mécanismes de reconnaissance du récepteur) (Yuhasz et al, 1993, Mitchell et al, 1996), le gène gamma 34.5 (impliqué dans la neurovirulence), et le gène US9 (impliqué dans le transport des particules virales dans les neurones) (Negatsch et al, 2011). A titre d’exemple, dans un modèle d’infection rétinienne testé par notre équipe, 1,5x10⁴ à 2x10⁵ PFU de la souche KOS sont nécessaires pour induire une rétinite chez 19% à

102 57% des souris (Atherton et al, 1987, Pepose et al, 1987, Metzger et al, 1987) alors que 90 PFU de la souche SC16 sont suffisantes pour obtenir 100% d’infection rétinienne (Labetoulle et al, 2000). De la même façon, 70 PFU de la souche SC16 suffisent à induire le même taux d’atteinte oculaire dans le modèle de scarification cornéenne que 10⁶ PFU de la souche KOS (Crépin et al, soumis).

III.4

Préparation des concentrés viraux

Des cellules BSR (clone de lignée cellulaire BHK 21, issues de rein de hamster nouveau-né) amenées en confluence en culture (boites Falcon, Becton-Dickinson, USA) ont été infectées à une multiplicité d’infection de 0,05 PFU (Plaque Forming Unity). Les cellules et le surnageant de culture ont été récoltées après 72 heures de culture, puis soumises à une centrifugation de 4500 tours/min (tpm, rotor JA 14, Beckman, USA) pendant 30 minutes à 4°C. Le culot a été soumis à des ultrasons (sonication) pendant 30 secondes puis à nouveau centrifugé dans les mêmes conditions. Le surnageant de la première centrifugation a été rassemblé avec le surnageant de la seconde, et le tout a été déposé dans un tube a centrifugation sur un coussin de TNE (Tris-HCL pH 7,5 :10mM, NaCl 50mM, EDTA : 1mM) + 25% glycérol. Apres centrifugation à 27000 tpm pendant 1 h a 4°C (rotor sw28, Beckman), le culot a été suspendu dans du tampon de dilution (NaCl : 137mM, KCL : 5mM, Na2HPO4 : 0,7mM, Tris-HCL PH7,5 :25mM) puis conservé a -80°C.

III.5

Titrage du virus

Les virus purifiés ont été titrés selon la méthode des plages de lyse. Des dilutions croissantes de suspension virale (200µl/puits) ont été incubées 1 heure à 37°C sur des cellules Vero (cellules de rein de singe vert du Gabon) menées à confluence en culture monocouche dans des plaques de titrage à 6 puits (Multiwell, Falcon, Becton-Dickinson™). Les dilutions ont été calculées de manière à obtenir un nombre significatif de plage (20 à 200) dans plusieurs des 6 puits de la boite de titrage. Après l’adsorption du virus sur les cellules puis rinçage, un gel de MEM + agarose 0,4% enrichi avec 2% de sérum de veau fœtal a été coulé dans chaque puits, puis les boites ont été mises a incuber à 37°C pendant 3 jours. Les tapis cellulaires ont été colorés au rouge neutre 0,1% (Gibco™) et les plages de lyse cellulaire ont été comptées. Des titres de 10⁹ à 5x10⁹ UFP/ml ont été obtenus selon les sessions de purification.

103

III.6

Inoculation des animaux

Toutes les inoculations ont été réalisées sous anesthésie générale par injection intrapéritonéale d’équithesine (pentobarbital sodique : 1 %, hydrate de chloral : 270mM, propylène glycol : 40%, MgSO4 : 86 mM) à la dose de 40 µl/10g de poids de l’animal. L’injection à été réalisée dans la lèvre supérieure gauche, à la jonction cutanéo-muqueuse, en utilisant une 1µl de suspension virale, à l’aide d’une micropipette en verre reliée à un système d’injection mécanisé (Infusionpump, Harvard™, Royaume-Uni).

III.7

Sacrifice des animaux

Le sacrifice des animaux a aussi été réalisé sous anesthésie générale à dose létale, par injection intrapéritonéale d’une solution de pentobarbital sodique à 54,7 mg/ml (dose injectée : 2mg/10g de poids). Après obtention de l’anesthésie complète, une sternotomie était pratiquée pour mise en place d’une perfusion intracardiaque (aiguille de 21 gauges, Terumo™, Belgique avec 20 mL de tampon PBS (phosphate buffer saline, NaCl : 137mM, KCl : 27mM ; Na2HPO4 :101mM ; KH2PO4 :17,6mM, PH 7,4), puis 150 ml de tampon PBS+ 4% de para formaldéhyde (Prolabo™, France) et enfin 60 ml de tampon PBS + 20% de saccharose (Prolabo™). Le débit de perfusion était réglé sur 10 ml/minute. Les souris ont ensuite était disséquées sous loupe binoculaire.

Pour les analyses en biologie moléculaire, les prélèvements (TG, SCG, moelle, hypothalamus) ont été placés pendant 24h à 4°C dans 10 volumes de RNA Later (Qiagen™), puis congelés à -80°C après retrait de la solution de RNA Later.

Pour les études histologiques, les crânes entiers et les colonnes vertébrales ont été placés pendant 10 jours à 4°C dans un tampon PBS + EDTA 0.1 M pour décalcification, puis dans un tampon PBS + 20% de saccharose pendant 2 jours pour protection des tissus au moment de la congélation. Les tissus ont ensuite été enrobés de milieu de congélation (Tissutek, Thermo Scientific™, USA) avant d’être stocker à -80°C.