Caractérisation des transcrits du gène US12 modifié par insertion du LAT

Nous avons réalisé le même type d’expériences pour les transcrits du gène US12. L’utilisation du couple d’amorces 472F, PLAT2, a permis l’amplification de deux produits de RT-PCR majoritaires qui correspondaient aux jonctions 5’ du LAT inséré dans des transcrits du gène US12 (figure 2B ; figure S3A et S3B).

La première jonction (US12-nt1218) / (nt224-LAT) a déjà été observée dans des ARN modifiés au moment de la phase de latence du virus, en revanche la seconde jonction, (US12-nt1345) / (nt129-LAT), a été mise en évidence pour la première fois.

169

Figure 2: Détection des transcrits du gène US12 modifiés par RT PCR au moment de la phase aigüe de l’infection 6 jours P.I

Les souris infectées ont été sacrifiées 6 jours p.i. et les ganglions trigéminés gauches ont été extraits. L'ARN total a été isolé et utilisé comme matrice pour effectuer la recherche par RT-PCR des jonctions 3 '(A) et 5' (B) entre le LAT2kb et les transcrits du gène US12.

Dans chaque cas de figure, une représentation schématique des transcrits modifiés du gène US12 a été réalisée. Les couples d'amorces (LATF1 et 47REV1) utilisés pour amplifier la jonction 3’ (A) ainsi que ceux utilisés pour amplifier la jonction 5 ' (422F et PLAT2) sont indiqués par des flèches.

Les gels d'électrophorèse montrant les produits de RT-PCR obtenus sont sur la gauche de chaque panel. Un contrôle sans ARN a également été testé (H20).

À droite des gels, sont représentées, à la fois, les séquences des jonctions obtenues après séquençage des produits de RT-PCR, ainsi que le numéro des nucléotides au niveau de la jonction pour le gène correspondant. En A) les caractères en minuscule et gras correspondent à des conversions de nucléotides.

170 L’utilisation du couples d’amorces LATF1 ; 47REV1, a permis l’amplification d’un produit de RT-PCR unique correspondant à une jonction 3’ entre le LAT et le transcrit du gène US12. Le clonage puis le séquençage de ce produit de PCR ont permis de révéler la jonction (LAT- nt1344) / (nt1351-Us12) (figure2A ; figure S4A et S4B). En aval de la jonction deux nucléotides de la séquence d’US12 étaient modifiés (la cytosine 1352 et l’adénine 1355 était toutes deux changées en guanine).

Parallèlement, a été amplifié un produit non spécifique à partir des ARN extraits des souris MOCK infectées. Le séquençage de se produit a révélé une séquence correspondant à un transcrit murin sur lequel les amorces ne pouvaient en théorie pas s’hybrider.

VI.4

Recherche de l’ensemble des transcrits viraux et cellulaires

susceptible d’être modifiés par le transcrits LAT.

Dans le but d’isoler l’ensemble des ARN viraux et cellulaires modifiés par le LAT, il a été décidé d’utiliser une approche plus globale similaire à celle utilisée dans le chapitre précédent.

Nous avons donc purifié les ARNm poly-adénylés à l’aide d’une chromatographie d’affinités sur une colonne dont la phase fixe est pourvue de fragments d’oligo (dT). Le choix d’isoler uniquement les ARNm avait deux principaux objectifs : caractériser l’ensemble des fonctions cellulaires et virales pouvant être affectées par la transposition du LAT, tout en se débarrassant des LAT_2kb ou LAT_1,5kb non insérés. Ces derniers n’étant pas polyadenylés.

Une fois les transcrits poly-adenylés purifiés, une extension d’une amorce spécifique du LAT a été effectuée par RT (figure 3A). Une PCR a été ensuite effectuée sur les ADNc ainsi obtenus. La migration des produits d’amplification sur gel a révélé plusieurs bandes dans les pistes correspondant aux extraits d’ARN provenant de souris infectées, alors qu’aucun produit n’a été détecté dans les pistes contrôles (RT-PCR effectuée sur H2O ou sur de l’ARN extrait de la souris MOCK). (figure 3B).

171

Figure 3: détection des transcrits viraux et cellulaires modifiés par 5’RACE au moment de la phase aigue de l’infection 6 jours P.I

En A, les principales étapes du 5’RACE utilisé pour amplifier les différents types d’ARN modifiés par insertion du LAT sont décrites. Le gel d'électrophorèse montrant les produits de PCR obtenus est présenté en B. Un contrôle sans transcriptase inverse a été effectué, en plus du contrôle utilisant des ARN extraits d’une souris MOCK infectée. En C et D sont représentées, à la fois, les séquences des jonctions obtenues après séquençage des produits de PCR, ainsi que le numéro des nucléotides engagés dans la jonction pour le gène correspondant. Pour le gène codant la dynamine, les caractères en minuscule et gras correspondent à une séquence nucléotidique qui n’a pu être attribuée ni au gène, ni au LAT

L’ensemble des produits obtenus a pu alors être cloné. Chacun des 69 clones obtenus s’est vu isolé puis séquencé. Malgré l’isolement des ARN poly-adenylés, la grande majorité des clones séquencés (soit un total de 38 clones) a révélé des séquences appartenant au LAT_2kb. Ces séquences peuvent provenir du LAT de 8,3kb qui est poly-adénylé ou bien de LAT_2kb qui n’auraient pas été complètement éliminés lors de la purification sur la colonne d’oligo dT.

Les autres séquences, obtenues à partir des clones isolés, ont permis de séparer les jonctions 5’entre le LAT et un transcrit donné, en deux groupes.

Le premier groupe (figure 3C.), est composé uniquement de séquences comportant des insertions du LAT dans des gènes viraux (21clones au total), quand le second comportait des insertions du LAT dans des gènes cellulaires (10clones au total) (figure 3D).

172 L’analyse des séquences du premier groupe, a permis de confirmer des résultats déjà obtenus. Ainsi parmi les 21 clones du 1^er groupes, 9 d’entre eux comportaient des séquences du LAT intégrées dans le gène RL2. Celles-ci correspondaient à trois types de jonctions distinctes déjà obtenues précédemment ( figure S5A et S5B). Cinq clones comportaient des séquences du LAT intégrées dans le gène US12 (figure S9A et S9B), 3 clones dans le gène UL15 (figure S8A et S8B), 2 dans le gène UL5 (figure S7A et S7B), et 2 dans le gène UL34 (figure S6A et S6B).

Les séquences du second groupe ont permis de mettre en évidence des séquences du LAT dans des gènes cellulaires. Ainsi 6 clones comportaient des séquences du LAT intégrées dans les transcrits codant pour la protéine BCLxL du gène BCL-X (Figure 11A et 11B), et 4 clones comportaient des séquences du LAT intégrées dans les transcrits codant pour la dynamine de type 1 (figure s10A et s10B).

VI.5

Recherche des jonctions 5’ entre les gènes cellulaires, viraux