Détermination des paramètres biophysiques intrinsèques des protéines

Les différents paramètres théoriques et expérimentaux des protéines recombinantes produites et utilisées durant ce projet sont donnés dans le tableau 2.6.

II.1.1. Détermination in silico

La masse moyenne (Da) théorique, le point isoélectrique et le coefficient d’absorption molaire (Abs 1 %/cm : absorbance d’une solution à 10 g/L) de chaque protéine étudiée sont déterminés de manière informatique à l’aide du programme ProtParam, disponible sur le serveur Expasy (http://web.expasy.org/protparam/).

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II.1.2. Détermination de la masse par spectrométrie de masse

(MALDI-TOF)

Les analyses de masses ont été effectuées sur la plateforme de spectrométrie de masse de l’IBS par Lucas Signor et Izabelle Bérard sur un appareil MALDI-TOF MS Autoflex (Bruker Daltonics). Les échantillons solubles sont co-cristallisés avec une matrice d’acide sinapinique (SA) puis déposés sur la cible. Ils sont ensuite désorbés et ionisés par un faisceau laser pulsé puis séparés dans un analyseur temps de vol dans un mode linéaire positif afin de déterminer les rapports m/z. Un traitement informatique des données permet d’obtenir un spectre à partir duquel sera déduite la masse molaire expérimentale moyenne de notre protéine. L’erreur expérimentale observée pour chaque mesure est de l’ordre de 0.1%.

II.1.3. Détermination de la séquence N-terminale des protéines

La détermination de la séquence N-terminale des protéines a été réalisée par Jean-Pierre Andrieu au niveau de la plateforme de séquençage protéique de l’IBS. La séquence a été déterminée à chaque fois sur les 5 à 8 premiers résidus, longueur suffisante pour identifier précisément nos protéines et les possibles contaminants. La détermination de la séquence en acides aminés est basée sur le principe de la réaction de dégradation d’Edman (Edman, 1949). Les dérivés d’acides aminés générés à chaque cycle réactionnel sont identifiés et quantifiés par séparation par HPLC et comparaison avec des standards.

II.1.4. Analyse par spectrométrie de dichroïsme circulaire

L’analyse par dichroïsme circulaire des échantillons protéiques a été réalisée à l’EMBL sous la supervision de Marc Jamin sur un spectropolarimètre 810 (JASCO) thermostaté. Le dichroïsme circulaire est une technique non destructive permettant l’analyse de la conformation secondaire et tertiaire d’échantillons protéiques solubles. Son principe repose sur la capacité des molécules chirales d’absorber différemment la lumière polarisée à gauche et celle polarisée à droite. L’appareil de dichroïsme circulaire permettra la mesure de la différence entre ces deux types d’absorbance (ΔA = AG - AD) qui sera exprimée ici en

100 Dans les protéines, 3 chromophores principaux contribuent au signal observé :

- Les liaisons peptidiques pour des longueurs d’ondes inférieures à 240 nm

- Les acides aminés aromatiques (tryptophane, phénylalanine, tyrosine) entre 260 et 350 nm.

- Les ponts disulfures qui absorbent majoritairement vers 260 nm.

Deux zones spectrales sont alors généralement observées :

- L’UV lointain entre 180 et 260 nm qui nous renseigne sur les structures secondaires des protéines (hélices α , feuillets β). Il est possible de déduire des spectres la proportion relative de chaque structure secondaire.

- L’UV proche entre 260 et 350 nm qui nous renseigne sur la structure tertiaire des protéines.

Les spectres de dichroïsme circulaire ont été enregistrés dans une cuve UV (l = 0,1 cm) à une température de 20 °C dans la région des UV lointains entre 200-210 et 260 nm. Pour chaque mesure, 5 spectres ont été accumulés à une vitesse de 50 nm/min pour une résolution de 0,5 nm. La solution protéique était concentrée entre 10 et 20 µM dans du tampon Phosphate de sodium 20 mM NaF 130 mM (pH 7,3). Ce tampon est particulièrement adapté pour le dichroïsme circulaire du fait de l’absence d’ions chlorure qui ne perturbent pas le signal. Le logiciel Spectra manager (JASCO Corporation) a été utilisé pour acquérir les données. Notons que les spectres de dichroïsme circulaire du fragment CR1 CCP 22-30 sans étiquette poly-histidine ont été enregistrés à l’IBS sur un spectropolarimètre Jobin Yvon CD6 sous la supervision de Dominique Madern à une température de 20 °C. L’échantillon était dilué en tampon phosphate 25 mM NaCl 150 mM (pH 7,5) à une concentration de 0,48 mg/mL. 6 spectres ont été accumulés à une vitesse de 0,5 nm / s dans une cuve de 0,1 cm de trajet optique.

II.1.5. Détermination de la masse apparente par chromatographie

d’exclusion

La chromatographie d’exclusion permet de séparer les constituants d’un mélange complexe en fonction de leur masse apparente et de leur forme. La capacité séparative (ou résolution) de cette technique dépend de la granulométrie, de la porosité et de la hauteur de la phase utilisée. Pour nos analyses, nous avons utilisé une colonne Superose 12 10/300 GL (GE Healthcare, volume de phase = Vt = 24 mL) permettant de séparer des protéines globulaires de 1 à 300

101 kDa. Cette colonne a préalablement été calibrée en tampon Tris-HCl 20 mM NaCl 150 mM CaCl2 5 mM (pH 7,4) avec les standards de protéines globulaires suivants : ovalbumine (43

kDa); BSA monomérique (66 kDa); BSA dimérique (132 kDa); BSA trimérique (198 kDa). Le volume mort (Vm) est déterminé par injection de bleu dextran (2 MDa). Les volumes

d’élutions (Ve) obtenus sont donnés dans la figure 2.7.

Ces volumes d’élution nous permettent de calculer pour chaque molécule le coefficient de partage (KAV) selon la relation :

KAV = (Ve - Vm) / (Vt - Vm)

La relation entre la masse moléculaire (MW) et le KAV (Log MW = a.KAV + b) doit être

linéaire. La courbe obtenue (figure 2.7) nous permet de déduire la masse moléculaire apparente d’une protéine injectée sur la colonne en fonction de son volume d’élution. Cette méthode donnera une bonne estimation de la masse moléculaire apparente, sous réserve que la protéine analysée soit globulaire et n’interagisse pas avec la phase.

Calibration Superose 12 10/300 GL y = -0,2858x + 1,6778 R2 = 0,9998 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 4,6 4,8 5 5,2 5,4 Log MW K A V

Figure 2.7 : Calibration de la colonne Superose 12 10/300 GL

Les volumes d’élution des molécules servant à la calibration sont indiqués dans le tableau de droite. Le graphique de gauche correspond à la courbe de calibration utilisée pour déterminer les masses moléculaires expérimentales. KAV : coefficient de partage; MW : masse moléculaire

Dans le cas de CR1 CCP 22-30 et de ses fragments, l’analyse des échantillons a été effectuée en tampon PBS (pH 7,4). Pour la TcCRT et ses fragments, cette même analyse a été réalisée en tampon Tris HCl 20 mM NaCl 150 mM CaCl2 5 mM (pH 7,4). Les quantités (de 50 à 500

µg) et volumes chargés sur la colonne sont en accord avec les recommandations du fournisseur.

Molécule injectée Volume d’élution (mL) bleu dextran 8,1 BSA (trimère) 10,7 BSA (dimère) 11,5 BSA (monomère) 12,9 ovalbumine 13,7

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