Biologie cellulaire

IV.4.1.

Cellules, milieux et anticorps

Les cellules CHO-K1 sont maintenues en milieu DMEM F-12 GlutaMAX (Life Sciences Technologies) en présence de sérum de veau foetal décomplémenté (10 %) et d’un mélange pénicilline et streptomycine (Pen Strep, Gibco). Elles sont cultivées en monocouche à 37 °C sous une atmosphère chargée de 5 % de C02 selon les protocoles standards en vigueur

(Phelan, 2007). Celles-ci sont décrochées de leur support par action d’une solution de Versene (Life Sciences Technologies) puis lavage en tampon PBS. Nous n’avons pas utilisé une solution de trypsine/EDTA puisque le récepteur CR1/CD35 montre une forte susceptibilité à cette protéase (Pascual et al., 1994a). Les cellules HEK 293-FTM sont maintenues comme décrit précédemment (Chapitre 2, III.4.1).

Les cellules HEK 293-FTM et CHO-K1 sont transfectées par l’ADN plasmidique, respectivement en présence de 293FectinTM (Invitrogen) et de Lipofectamine 2000TM (Invitrogen). La transfection (quantité de cellules, d’ADN, de réactif) est réalisée selon les recommandations du fournisseur. Les cellules CHO-K1 sont ensemencées la veille de la transfection dans une boîte 6 puits à 0,5 x 106 cellules/puits pour atteindre 1 x 106 cellules le jour suivant. Chaque puits est transfecté par un mélange de 4 µg d’ADN plasmidique et de 10 µL d’agent de transfection. Les cellules HEK 293-FTM sont transfectées dans un erlen contenant 1 x 10^6 cellules/mL (volume minimal de 20 mL) dans des proportions identiques à celles décrites pour la production (Chapitre 2, III.4.2). Le nombre de cellules à transfecter est déterminé en fonction du nombre d’essais à réaliser. Le temps de transfection a été fixé arbitrairement à 40 H sur la base d’essais d’expression de la forme soluble de CR1 CCP 22- 30 en cellules CHO- K1 et HEK 293-FTM. Les anticorps et les dilutions utilisés pour le marquage des cellules sont indiqués dans le tableau 2.12.

Nom Espèce Epitope reconnu Type Dilution Couplage

Anti-C1q total Lapin C1q (Molécule entière) Polyclonal 1/2000 Non Anti-MBL total Lapin MBL (Molécule entière) Polyclonal 1/2000 Non Anti-CR1 E11 Souris CR1 Monoclonal 1/100 Non Anti-IgG de lapin Chèvre IgG Lapin Polyclonal 1/1000 FITC Anti-IgG de souris Chèvre IgG Souris Polyclonal 1/250 FITC

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IV.4.2.

Analyse de l’expression de CR1 CCP 22-30 TM/Cyto par

Western BLOT

L’expression du récepteur est évaluée par analyse en Western BLOT du lysat total de cellules CHO-K1 ou HEK 293-FTM transfectées ou non par la construction CR1 CCP 22-30 TM/Cyto. Après lavage en PBS, 1 x 106 cellules sont reprises dans 100 µL d’un tampon de lyse [Tris 50 mM, NaCl 150 mM, Triton X-100 (pH 8,0)] additionné d’un cocktail d’inhibiteurs de protéases ajouté extemporanément (Complete EDTA-Free, Roche). Les cellules sont lysées pendant 30 minutes sur la glace puis centrifugées 30 minutes à 13200 rpm (4 °C). 1,25, 2,5 et 5 µL du surnageant sont analysés par Western BLOT (gel SDS-PAGE 10%) avec un anticorps anti-CR1/CD35 (H-300, Santa Cruz Biotechnology) comme décrit dans le Chapitre 2, section II.2.3.

IV.4.3.

Analyse en cytométrie en flux de l’expression de CR1

CCP 22-30 et de la fixation des collagènes de défense

Les cellules transfectées par pcDNA 3.1 CR1 CCP 22-30 TM/Cyto ou pcDNA 3.1 – sans insert sont récupérées, centrifugées puis lavées en tampon PBS (grade biologie cellulaire, Life Technologies) en présence de BSA 1 % (p/v). Elles sont remises en suspension (PBS- BSA 1%) à une concentration de 1 x 106 cellules/mL. Pour chaque essai, 0,5 x 106 cellules sont incubées avec 100 µL des différentes protéines ou anticorps pendant 45 minutes sur la glace. Pour les besoins de l’expérience, C1q et l’ovalbumine (témoin) ont été marqués avec le fluorochrome Alexa 488 à l’aide du Kit commercial « Alexa Fluor 488 Protein Labeling Kit » (Life Technologies) selon les recommandations du fournisseur. Ce marquage permet une révélation directe de la fixation sans passer par l’incubation avec des anticorps. Les différents marquages effectués lors de cette étude ainsi que les témoins réalisés dans chaque cas sont répertoriés dans le tableau ci-après (tableau 2.13). Entre chaque incubation, les cellules sont lavées par 1 mL de PBS BSA 1 % (2 lavages). Les cellules sont finalement fixées par 100 µL de PFA 4 % puis conservées dans 300 µl de tampon PBS à 4 °C jusqu’à l’analyse. Durant toutes ces étapes, les cellules sont centrifugées à 1500 rpm pendant 5 minutes sauf après fixation où la vitesse de centrifugation est augmentée à 1900 rpm. Les échantillons sont analysés avec l’assistance d’Evelyne Gout sur un FACScan (Beckton Dickinson). Les échantillons sont injectés à une vitesse comprise entre 200 et 700 évènements par seconde lorsque cela est possible. Les essais donnant respectivement le signal minimal et maximal sont utilisés pour calibrer l’appareil. Pour chaque mesure, un nombre total de 20000

129 évènements est enregistré. Les données brutes sont analysées à l’aide du logiciel Cellquest Pro (Beckton Dickinson).

Incubation Marquage

expression CR1

Marquage C1q-

Alexa 488 Marquage C1q Marquage MBL

1) Protéines Tampon PBS BSA 1 %

1 ou 4 µg C1q

A488 1 ou 5 µg C1q

2,5 ou 5 µg de MBL 2) Anticorps I Anti-CR1 E11 Anti-C1q total Anti-MBL total 3) Anticorps II Anti-IgG souris _FITC Anti-IgG lapin _FITC Anti-IgG lapin _FITC

Témoins Anticorps II seul

Ovalbumine marquée avec

Alexa 488

Anticorps seuls Anticorps seuls

Tableau 2.13 : Marquages et témoins réalisés pour l’étude de la fixation de C1q et de la MBL à des cellules exprimant CR1 CCP 22-30 en surface

IV.4.3.1. Analyse en immunofluorescence de l’expression de CR1

CCP 22-30

Les cellules préparées pour l’analyse en cytométrie en flux et présentant un signal intéressant sont également analysées en immunofluorescence. 5 x 104 cellules dans un volume de 50 µL sont déposées sur une lamelle de 12 mm traitée à la poly-lysine puis sont centrifugées 5 minutes à 1600 rpm. Cette étape permet de fixer les cellules sur la lamelle. Celles-ci sont ensuite montées sur une lame avec un liquide de montage contenant un colorant du noyau, le DAPI (VectaShield, Vector Laboratories). Le bord des lamelles est recouvert d’un vernis transparent puis les lames sont conservées à 4 °C à l’abri de la lumière jusqu’à leur observation. Les cellules sont observées sur un microscope optique d’épifluorescence IX81 (Olympus) à l’aide d’objectifs plans apochromatiques de grossissement 40 et 60 fois. Des roues dotées de filtres d’excitation (Ex.) et d’émission (Em.) couplées à une caméra haute sensibilité permettent l’analyse de la fluorescence associée au DAPI (Ex./Em. : 387 nm/440 nm), au FITC (Ex./Em. : 490 nm /525 nm) et à l’Alexa 488 (Ex./Em. : 495 nm /519 nm). Un système de contraste interférentiel Nomarski permet également l’observation des cellules en lumière blanche avec un fort contraste. Le pilotage du microscope et l’analyse des données sont assurés par le logiciel Volocity (Perkin Elmer).

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Chapitre 3 : Production d’une forme soluble et