Analyse des échantillons protéiques

II.2.1. Quantification des échantillons protéiques

La présence dans les protéines de résidus aromatiques (Phe, Trp, Tyr) leur procure la capacité d’absorber fortement à une longueur d’onde de 280 nm. Classiquement, cette absorbance permet de déterminer la concentration molaire (mol.L-1) des échantillons protéiques en appliquant la loi de Beer-Lambert (Beer, 1852) :

A =

ε

ε

où A correspond à l’absorbance à 280 nm de l’échantillon, l à la longueur du trajet optique en cm, C à la concentration de l’échantillon en mol.L-1 et ε au coefficient d’extinction molaire à 280 nm en M-1.cm-1.

La concentration massique (g.L-1) peut être obtenue en multipliant la concentration molaire (mol.L-1) par la masse moléculaire de la protéine exprimée en Da ou en g.mol-1. Pour simplifier les calculs, nous avons déterminé pour chaque protéine une valeur correspondant à l’absorbance d’une solution à 10 g.L-1 (Abs 1 %/cm). Une simple règle de trois permet alors de passer de l’absorbance à la concentration en g.L-1.

Le coefficient d’extinction molaire à 280 nm est calculé d’après la méthode de Edelhoch (Edelhoch, 1967) mais en utilisant les coefficients d’extinction molaire de la tyrosine et du tryptophane déterminés par Pace et collaborateurs (Pace et al., 1995). Ce calcul repose sur la composition en acides aminés de la protéine et sur la présence de résidus de cystéines impliqués dans la formation de ponts disulfures (cystines). La formule de calcul du coefficient d’extinction molaire est la suivante :

ε (protéine)= Nbre (Tyr)*ε (Tyr) + Nbre (Trp)* ε (Trp) + Nbre (cystine)*ε (cystine)

Avec ε (Tyr) = 1490 M-1_.cm-1_{, ε (Trp) = 5500 M}-1_.cm-1_{et ε (cystine) = 125 M}-1_.cm-1 _{(ε à 280nm)}

Ce calcul considère l’hypothèse qu’aucun autre groupement n’absorbe à 280 nm (comme notamment les groupements prosthétiques de certaines protéines). L’utilisation du programme ProtParam, disponible sur le serveur Expasy, permet d’automatiser le calcul du coefficient d’extinction molaire (http://web.expasy.org/protparam/).

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II.2.2. Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS

(SDS-PAGE)

La méthode d’analyse par SDS-PAGE (SDS PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) permet de séparer les différents constituants d’un mélange protéique complexe en fonction de leur masse moléculaire et sans considération de charge (Laemmli, 1970).

II.2.2.1. Préparation des échantillons

Les échantillons protéiques qui vont être analysés sur gel SDS-PAGE sont dénaturés par un traitement thermique et chimique. Pour ce faire, on mélange notre échantillon avec une solution dénaturante concentrée 4X [Tris-HCl 0,125M, SDS 6 %, glycérol 20 %, bleu de bromophénol (pH 6,8)] en présence ou non de DTT 100 mM dans le cas ou l’on souhaite des échantillons réduits ou non réduits. Dans les deux cas, les échantillons sont ensuite chauffés 5 minutes à 95 °C à l’aide d’un bain sec. Ceux-ci peuvent être déposés immédiatement sur le gel ou conservés à 4 °C ou -20 °C. Lorsque le volume de l’échantillon est trop important pour être déposé sur gel, celui-ci est précipité par un volume équivalent d’acide trichloroacétique 50 % (TCA ) pendant une nuit à 4 °C. On centrifuge ensuite l’échantillon (4 °C, 30 min, 13200 rpm) avant de retirer le surnageant et de laver 2 fois le culot avec une solution d’acétone pure. Le culot sera ensuite remis en suspension dans un volume adapté de tampon de dénaturation.

II.2.2.2. Préparation du gel

Le gel de polyacrylamide est composé de deux gels distincts aux propriétés séparatives différentes (diamètre des mailles du gel différent) :

- Un gel dit de concentration [Tris-HCl 125 mM pH 6,8, acrylamide 3 % (p/v) - bisacrylamide 0,08 % (p/v), SDS 0,1 % (p/v), persulfate 0,04 % (p/v), N,N,N',N'- tétra-méthyl-éthylènediamine (TEMED) 0,4 % (v/v)] permettant de concentre le mélange de protéines avant la séparation.

- Un gel dit de séparation [Tris-HCl 375 mM pH 8,8, acrylamide 7.5 – 12.5 % (p/v) - bisacrylamide 0,2 – 0,33 % (p/v), SDS 0,1 % (p/v), persulfate 0,025 % (p/v),

N,N,N',N'-tétra-méthyl-éthylènediamine (TEMED) 0,2 % (v/v)] permettant de

séparer les constituants du mélange protéique en fonction de leur masse moléculaire. C’est en jouant sur le pourcentage d’acrylamide présent dans ce gel que l’on pourra optimiser la séparation des échantillons protéiques.

104 Le gel est placé dans un système d’électrophorèse vertical (Dual Vertical Mini-Gel Electrophoresis System, CBS Scientific Co). Le tampon de migration [Tris-HCl 25 mM Glycine 192 mM SDS 0,1 %, pH non ajusté] est ensuite ajouté et les échantillons sont chargés dans les puits. La migration des échantillons s’effectue grâce à la génération d’un champ électrique (générateur PowerPac 300, Biorad) à une tension de 200 Volt. Les échantillons alors chargés négativement (présence du SDS), migreront de l’anode (-) vers la cathode (+).

L’utilisation d’un mélange protéique prêt à l’emploi (Prestained Protein Ladder Plus, Euromedex) contenant des protéines de masse moléculaire connue [250 kDa, 130 kDa, 95 kDa, 72 kDa, 55 kDa, 36 kDa, 28 kDa, 17 kDa et 10 kDa] comme standard de migration, permettra ensuite de localiser facilement nos protéines d’intérêt et d’obtenir une approximation de leurs masses moléculaires. Une fois la migration achevée, on procèdera soit à la révélation des protéines du gel à l’aide d’une solution de bleu de Coomassie instantanée (Instant Blue, Expedeon) soit au transfert sur membrane de nitrocellulose (immunorévélation) ou de PVDF (en vue du séquençage).

II.2.3. Transfert sur membrane de nitrocellulose (Western Blot)

Le transfert sur membrane ou Western Blot est une technique permettant de révéler à l’aide d’anticorps hautement spécifiques certaines protéines séparées par SDS-PAGE. Le transfert sur une membrane de nitrocellulose rend alors accessible aux anticorps les protéines qui étaient contenues à l’intérieur du gel SDS-PAGE.

II.2.3.1. Préparation de la membrane

Après la séparation électrophorétique, on équilibre le gel ainsi qu’une membrane de nitrocellulose (Whatman) dans du tampon de transfert [Tris-HCl 25 mM, glycine 192 mM, éthanol 20 % (v/v), pH non ajusté] pendant quelques minutes. On procède ensuite au montage ci-après (figure 2.8). Ce montage est ensuite placé un appareil de transfert (Mini Blot Cell, Biorad) en présence de tampon. Le transfert s’effectue soit à 4 °C à 100 Volt pendant une heure soit à 12 Volt pendant la nuit. Les échantillons protéiques présents dans le gel étant chargés négativement (SDS), ils migreront depuis la borne – vers la borne + de l’appareillage.

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Figure 2.8 : Schéma de montage en vue de la réalisation d’un transfert sur membrane de nitrocellulose

II.2.3.2. Immunorévélation

Une fois le transfert effectué, on rince 2 fois la membrane avec du tampon PBS (10 minutes/lavage). On pourra éventuellement la colorer avec une solution de rouge ponceau (Ponceau S solution, Sigma Aldrich) afin de vérifier l’efficacité du transfert. La membrane est ensuite mise en présence d’une solution de blocage [tampon PBS + 5 % (p/v) de lait lyophilisé] pendant 1 H à 37 °C sous agitation pour saturer les sites non spécifiques.

Un anticorps primaire spécifique d’un épitope de la protéine d’intérêt à révéler est ensuite ajouté. Celui-ci est dilué dans la solution de blocage et est mis en présence de la membrane pendant 1 H à 37 °C ou une nuit à 4 °C sous agitation. Après 3 lavages de 10 min avec du tampon PBS additionné de 0,05 % de Tween 20 (PBS-T), la membrane est incubée dans les mêmes conditions que précédemment avec un second anticorps, spécifique de l’isotype de l’anticorps primaire et couplé à peroxydase de Raifort (HRP) ou à la phosphatase alcaline. Après de nouveau 3 lavages de 10 min en PBS-T, la membrane est séchée avant de procéder à sa révélation. Les dilutions et les anticorps utilisés sont donnés dans le tableau 2.6.

Nom commercial Espèce Type Epitope Dilution Couplage Anti CR1 H-300 (Santacruz) Lapin Polyclonal (I) CCP 27-30 CR1 1/400 non

Anti-histidine (Sigma) Souris Monoclonal (I) étiquette poly-

histidine 1/2000 HRP Anti-lapin Chèvre Polyclonal (II) IgG de lapin 1/12500 HRP Anti-lapin Chèvre Polyclonal (II) IgG de lapin 1/5000 Phosphatase

alcaline

Tableau 2.6 : Anticorps et dilutions utilisés pour l’immunorévélation par Western Blot

106 Pour la HRP, la révélation de la membrane est réalisée par chimioluminescence à l’aide d’un kit commercial (ECL Advance Western Bloting detection kit, GE Healthcare) contenant le substrat de la peroxydase. La détection de la réaction est quant à elle réalisée à l’aide d’une caméra CCD (Image Station, Kodak) associée à un logiciel de traitement d’image (Image Analyser Software, Kodak). Le temps d’exposition de la caméra sera choisi en fonction de l’intensité du signal désirée.

Pour la phosphatase alcaline, la membrane est mise en contact avec 1 mL de substrat NBT/BCIP Uptima (Interchim) pendant quelques minutes jusqu’à obtenir l’intensité de signal désirée. Pour stopper la réaction, la membrane est simplement lavée plusieurs fois avec de l’eau distillée.

II.2.4. Transfert sur membrane de PVDF

Le transfert sur membrane peut être également utilisé pour le séquençage N-terminale des

protéines contenues dans un mélange complexe et séparé sur gel SDS-PAGE. De la même manière que pour le Western Blot, les protéines du gel SDS-PAGE sont transférées sur une membrane mais ici de PVDF. Cette membrane sera ensuite colorée avec du bleu de Coomassie [bleu de Coomassie G250 0,1% (p/v), éthanol 40 % (v/v), acide acétique 1 % (v/v)] puis décolorée avec une solution d’éthanol 50 % (v/v) jusqu’à l’apparition de la bande correspondant à la protéine. Celle-ci est ensuite séchée, découpée puis donnée en séquençage. L’utilisation de membrane de nitrocellulose n’est pas possible car l’un des solvants utilisé pour le séquençage la dissout.