La détection des particules est une étape particulièrement importante dans les études en SPT. La diffusion de la lumière sur les particules d’or (de diamètre 40 nm) permet d’obtenir, en contraste de Nomarski, une image contrastée dont le diamètre apparent est d’environ 200 nm (De Brabander, 1986). Il est ensuite nécessaire de traiter les images afin d’en extraire la trajectoire du colloïde c'est-à-dire un couple de coordonnées (x,y) correspondant au centre de masse, pour chaque image. Deux traitements ont été utilisés au cours de cette thèse : le post-traitement ou le traitement en temps réel.
Figure 24 : Dispositif de SPT. Le grossissement du microscope (1) peut être augmenté par l’ajout d’un zoom X4 (2). La caméra (3) transfère les images au processeur d’images (4) qui améliore le ratio signal sur bruit visualisé en temps réel sur le moniteur de contrôle (5). La séquence d’images est enregistrée sur cassette par le magnétoscope (6), puis traitée sur une station de numérisation (7). Cette dernière étape a été remplacée par une analyse en temps réel, en parallèle de l’enregistrement sur cassette.
Tableau 3 : Valeurs en nm correspondant à 1 pixel sur l’axe des x et des y en fonction du mode de traitement des images.
Post-traitement Temps réel
x 35,0 32,2
→ →→
→ En post-traitement
La séquence d’images précédemment enregistrée est numérisée puis traitée par différentes étapes (fig. 25). Une zone d’intérêt contenant le colloïde (ROI pour Region Of Interest) est délimitée sur laquelle se feront les différentes opérations. Cette ROI doit être la plus petite possible. Dans un premier temps un recadrage des niveaux de gris est effectué afin d’améliorer le contraste du colloïde. Un filtre qui moyenne l’intensité des pixels (3 x 3) est ensuite appliqué, dans le but de diminuer le bruit généré lors de l’étape précédente. La troisième étape consiste à binariser l’image, c'est-à-dire à réduire les 256 niveaux de gris à 2 niveaux : blanc et noir. Il est essentiel que seul le colloïde apparaisse alors en noir sur fond blanc, et non pas des reliefs de la cellule. Enfin, en raison d’un pré-requis du logiciel pour trouver les contours automatiquement, les intensités de l’image sont inversés (le colloïde devient blanc sur fond noir) et le contour du colloïde tracé. Ce contour est utilisé sur l’image de départ pour calculer le barycentre pondéré des niveaux de gris dans la zone déterminée (Daumas, 2003a). Ce traitement est réalisé sur chaque image de la séquence, en conservant la même ROI, par des programmes développés précédemment dans l’équipe et le logiciel Optimas v6.2 (MediaCybernetics, 1997). Chaque image permet d’obtenir un couple de coordonnées (x,y) du colloïde, l’ensemble de la séquence correspond à la trajectoire.
Figure 25 : Traitement d’une image par la station de numérisation (post-traitement) (1) Image brute, détermination de la ROI (2) Ajustement des niveaux de gris (3) application du filtre moyen (3x3 pixels) (4) Binarisation (5) Inversion noir / blanc (6) Détermination du contour (7) calcul du barycentre sur l’image brute dans la zone déterminée
Différents problèmes peuvent se poser. Le colloïde peut être trop clair, et donc ne peut pas être extrait du fond gris de la cellule dans certaines images. Dans d’autres cas il peut y avoir des reliefs cellulaires qui apparaissent aussi foncés que le colloïde, ce qui aboutit à la détection de deux centres de masse, et donc de deux couples de coordonnées pour une seule image. Les trajectoires sont donc vérifiées avant d’être analysées. Les doublons sont éliminés, en ne conservant que le couple (x,y) le plus proche des coordonnées de l’image précédente. Les trous sont comptés et s’ils sont trop nombreux (en nombre supérieur à 10 % du nombre total d’images), la trajectoire est rejetée. La dernière vérification pour accepter une trajectoire est de regarder les séquences d’images en accéléré afin de déterminer si la cellule est bien immobile sur le temps de l’expérience.
→ →→
→ En temps réel
Un système de traitement en temps réel des trajectoires a été mis en place au cours de ce travail par Fréderic Filoche à partir d’un programme développé par Franck Artzner (GMCM, Rennes) sous Labview. Les images sont traitées en temps réel par l’ordinateur dès leur enregistrement, soit en moins de 40 ms. Deux systèmes de détection du colloïde sont alors possibles. Le premier cherche à déterminer le centre de masse de la particule et l’obtention des coordonnées de la particule procède de la même manière que lors de l’analyse en post-traitement. La seconde méthode repose sur le calcul du maximum du produit de convolution à partir des moyennes des intensités des pixels de la ROI en x et en y (fig. 26) pour déterminer le centre du colloïde.
Figure 26 : Premières étapes de la détermination des coordonnées du centre du colloïde par la méthode de convolution. La moyenne des intensités en x et y est calculée dans la ROI. Image d’un colloïde sur la cellule (x252)
ROI
Moyenne des intensités des pixels, en x M o y en n e d es in te n si té s d es p ix el s, en y
Dans les deux cas, il est essentiel de vérifier que les niveaux de gris utilisés ne saturent pas l’appareillage afin que la moyenne des intensités des pixels représente bien une gaussienne avec un pic non écrêté.
Pour les deux méthodes de calcul la ROI est dite mobile, c'est-à-dire qu’elle se déplace avec le colloïde. Elle est fixée sur la première image par l’utilisateur, puis est centrée par le programme sur le couple de coordonnées déterminée à l’image précédente. Ceci permet de travailler avec une ROI petite et toujours centrée sur le colloïde.
L’analyse en temps réel présente l’avantage d’être beaucoup plus rapide que celle en post-traitement. La ROI étant petite cela permet d’exclure la présence de deux jeux de coordonnées pour une seule image (doublon). Enfin les trajectoires obtenues au final ne présentent pas de trous puisque lorsque le colloïde devient trop clair, le programme n’est plus capable de le distinguer du fond et l’enregistrement s’arrête.