fichier est ensuite analysé.
L’analyse comparative de regroupements de fichiers préalablement triés ou non a confirmé que le résultat final n’était pas biaisé par le tri tel qu’il est effectué. Néanmoins il permet de diminuer la barre d’erreur du couple (D, M) obtenue, et également par la suite l’erreur sur la taille des domaines.
1.3.2 – Analyse par rayon
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→ La fraction mobile
Le fichier regroupé est analysé selon le même principe qu’un fichier individuel, et permet de déterminer un couple (M, Dexp) pour chaque rayon d’observation R. Les couples obtenus sont alors étudiés en fonction du rayon d’observation.
- Dans le cas où les molécules sont libres de diffuser à longue distance ; la fraction mobile est constante et ce, quelle que-soit la taille de la zone observée. La fraction immobile (MI) correspondant aux molécules incapables de diffuser dans le plan (fig. 19A) est alors égale à :
) 1 ( M
MI = − (Eq. 9)
- Au contraire, s’il existe des contraintes au déplacement des molécules, la fraction mobile et le coefficient de diffusion seront variables en fonction du rayon d’observation. L’analyse d’un système modèle (sondes dans des domaines clos : billes de silice), ainsi que des simulations numériques menées dans l’équipe (fig. 20), ont permis de déterminer les équations régissant la diffusion des sondes par FRAPrv (Salome, 1998).
La fraction mobile de molécules compartimentées varie linéairement en fonction du rayon selon : p M R r A M = × + (Eq. 10)
Où A est une constante (égale à 0,634), r le rayon des domaines, R le rayon de la zone d’observation et Mp la fraction mobile permanente (fig. 19B). Dans le cas où les domaines sont strictement clos, cette valeur est égale à zéro. Au contraire dans le cas où ces domaines sont ouverts, une proportion de sondes est capable d’en sortir (fuite) qui constitue la fraction mobile permanente.
Cette proportion de molécules capables de diffuser à longue distance peut être reliée à un pourcentage d’ouverture du périmètre des domaines. Il s’avère qu’une ouverture faible des domaines (4 %) permet à une assez grande proportion de molécules de diffuser à longue distance (33 %). Enfin la différence entre 100% de retour et la valeur de M trouvée pour le plus petit rayon permet d’appréhender une valeur approchante de la fraction immobile (fig.19B).
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→ Le coefficient de diffusion
Les variations du coefficient de diffusion en fonction de la présence des domaines, de leur taille et du rayon d’observation ont également été analysées (Salome, 1998).
Figure 20 : Simulations réalisées dans (Salome, 1998). Les hexagones bleus représentent les domaines clos, les points jaunes les sondes fluorescentes et le cercle rouge la zone d’observation. Après photoblanchiment, seuls les domaines à cheval sur la zone d’observation participent au retour de fluorescence.
Avant photoblanchiment Photoblanchiment Retour de fluorescence Figure 19: Fraction mobile en fonction de l’inverse du rayon d’observation. Cas d’un environnement sans limite à la diffusion des sondes (A) ou cas de la diffusion de sondes dans des domaines ouverts (B).
(A) M 1/R 100% Fraction immobile (MI) Fraction mobile M 1/R 100% Fraction immobile (MI) Fraction mobile permanente (Mp) (B)
- Lorsque la membrane n’est pas compartimentée, le coefficient de diffusion Dexp obtenu est invariant avec le rayon d’observation. On a alors :
Dréel = Dexp (Eq. 11)
- En présence de domaines, le coefficient de diffusion expérimental Dexp varie avec la taille de la zone d’observation et peut être corrigé en utilisant la taille des domaines (r) et celle de la zone d’observation (R) selon :
2 exp 2 1 × = R r D Dreel (Eq.12)
Une fois corrigé, le coefficient de diffusion Dréel devient invariant en fonction du rayon d’observation.
Les études sur système modèle et par simulation ont donc permis de caractériser les variations des deux paramètres M et D en fonction du rayon d’observation en présence de domaines. Les valeurs obtenues lors des expériences sont traitées selon les équations explicitées ci-dessus et permettent donc de déterminer l’existence et la taille de domaines.
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→ Tailles relatives de la cellule, de la zone d’observation et des domaines
Il est essentiel pour effectuer un retour de fluorescence de se placer dans les conditions dites de réservoir infini c'est-à-dire lorsque le réservoir de molécules fluorescentes (c’est-à-dire la cellule) est au moins 5 fois plus grand que l’aire d’observation (surface observée << surface cellule). Lorsqu’elles sont arrondies, les SH-SY5Y ont un diamètre de 12 µm, soit une surface totale d’environ 450 µm². La zone d’observation maximale utilisée dans cette étude a un rayon de 3,45 µm, soit une surface 10 fois plus faible que celle de la cellule. Cette condition implique par ailleurs que deux retours de fluorescence ne peuvent être réalisés sur une même cellule.
En présence de domaines il est également essentiel de vérifier les tailles relatives de la zone d’observation (R) et des domaines (r).
- Quand R > r alors les équations développées ci-dessus s’appliquent
- Quand R < r alors la fraction mobile ne varie plus plus linéairement selon l’inverse du rayon d’observation, mais selon :
² ² ² c R c M = − (Eq. 13)
Où c est le rayon de la cellule et R le rayon d’observation. Dans les tailles de zones d’observation utilisée ici, ce deuxième cas se traduit par une relative stabilisation de la
fraction mobile lorsque r est proche de R, c'est-à-dire l’obtention d’un plateau aux petits rayons, sur le graphique : M en fonction de 1/R.
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→ Erreur sur les paramètres
Les paramètres Dexp et M sont calculés par le programme et donnés avec un intervalle de confiance de 95%. L’erreur sur la taille des domaines dépend de l’alignement de M en fonction de 1/R, et est estimée par utilisation d’une régression linéaire dans PRISM. L’erreur sur le Dréel recalculé à partir de Dexp selon l’équation (12) prend en compte l’erreur faite sur le Dexp et sur la taille des domaines :
∆ + ∆ = ∆ Pente Pente D D Dréel Dréel 2 exp exp (Eq. 14)
Dans le cas où il n’y a pas de domaines, les fractions mobiles et le coefficient de diffusion sont stables en fonction du rayon d’observation. Les valeurs citées seront donc les moyennes avec l’écart type comme barre d’erreurs.
Il faut noter que l’erreur faite sur la mesure des fractions mobiles est plus faible que celle sur le coefficient de diffusion expérimental car la fraction mobile est obtenue à partir d’un plus grand nombre de points (plateau du retour de fluorescence).
L’analyse des fichiers regroupés permet de diminuer les erreurs sur chaque paramètre. Néanmoins, afin d’appréhender les variations liées aux cellules, chaque expérience est réalisée en parallèle d’un témoin. Ceci permet de comparer directement les résultats et de distinguer des variations fines entre la condition testée et le témoin.