Au contraire du résultat obtenu par FRAPrv, des différences significatives sont observées entre les résultats de l’analyse en SPT à 22°C et à 37°C. A 37°C, les trajectoires de 99 colloïdes ont été enregistrées, 7 trajectoires ont été rejetées principalement à cause du déplacement de la cellule pendant le temps d’observation. Les résultats présentés ici correspondent donc à l’analyse de 92 trajectoires.
On remarque une modification des proportions de chaque type de diffusion. La proportion de trajectoires présentant une diffusion dirigée augmente de façon importante : de 40 à 66 %, au détriment des diffusions confinées, dont le taux chute de 50 à 8 % (fig. 60).
La quantité de récepteurs présentant une diffusion aléatoire reste relativement stable (6 et 10 %). Enfin on peut remarquer également un plus grand nombre de colloïdes dont la diffusion est trop lente pour être détectée et qui sont donc considérés immobiles (de 4 à
Figure 60 : Proportion des quatre types de diffusion observés à 37°C, pour un total de 92 trajectoires (bleu). Les résultats obtenus à 22°C (figure 52) sont représentés en noir hachuré. La moyenne correspondante des D1-2 (µm²/s) est indiquée en échelle logarithmique10. Les limites de résolution pour les coefficients de diffusion en FRAPrv et SPT sont indiquées par les traits gris.
L o g 1 0 D 1 -2 P o u rc en ta g e FRAP D1-2 37°C ♦ Histogrammes % 37°C D1-2 22°C ♦ Histogrammes % 22°C SPT 0 10 20 30 40 50 60 70
Immobile Dirigée Confinée Aléatoire
-6 -4 -2 0
16 %). Cette augmentation est en partie liée à la résolution de l’appareillage qui est plus faible à 37°C qu’à 22°C (cf. chapitre II ; §2.4.3). De plus il est probable qu’il y ait plus de récepteurs immobilisés au niveau de la membrane, en lien avec les processus d’internalisation plus efficaces à température physiologique qu’à température ambiante.
Des modifications sont également visibles au niveau des coefficients de diffusion de chaque mode de diffusion. Les coefficients de diffusion des trajectoires dirigées sont toujours plus lents que ceux des autres types de diffusion. Néanmoins cette différence est moins marquée à 37 qu’à 22°C, puisqu’on observe un ralentissement des récepteurs présentant une diffusion autre que dirigée à 37°C (tableau 12). Ce résultat est contraire à celui qu’on pouvait attendre en considérant l’agitation thermique qui devrait entraîner une accélération de la diffusion des récepteurs à 37°C.
Ainsi les récepteurs ayant une trajectoire confinée ou aléatoire ont un coefficient de diffusion (D1-2 et Dmicro) plus grand à 22°C qu’à 37°C. Les récepteurs présentant des trajectoires confinées ralentissent d’un facteur 8 environ, celles aléatoires d’un facteur 3. Au contraire, le coefficient de diffusion des trajectoires dirigées est identique (D1-2), ou plus rapide (Dmicro) à 37°C qu’à 22°C. Cette accélération est relativement faible, mais remarquable au vu des résultats des autres modes de diffusion. Enfin les vitesses de ces trajectoires doublent entre 22 et 37°C : de 8,3.10-3 à 1,5.10-2 µm/s.
Les récepteurs dont la diffusion est dirigée sont donc plus rapides à température physiologique qu’à température ambiante, tant au niveau du coefficient de diffusion qu’au niveau de leur vitesse. Au contraire, les récepteurs présentant un autre mode de diffusion sont ralentis à 37°C par rapport à 22°C.
Tableau 12: Comparaison des proportions et des moyennes des coefficients de diffusion de chaque mode de diffusion à 22 (98 trajectoires) et 37°C (92 trajectoires).
22°C 37°C 22°C 37°C 22°C 37°C Immobile 4 16 - - - -Dirigée 40 66 (2,8 ± 3,4).10-4 (2,8± 3,1).10-4 (1,7± 1,5).10-4 (4,3± 4,3).10-4 Confinée 50 8 (1,1± 1,4).10-2 (1,1± 0,7).10-3 (1,9± 4,0).10-2 (2,8 ± 5,4).10-3 Aléatoire 6 10 (8,8± 9,9).10-3 (3,5± 4,2).10-3 (7,0 ± 7,1).10-3 (1,9 ± 1,7).10-3 Proportion (%) D1-2 (µm²/s) Dmicro (µm²/s) ≈ > > < > >
Seules 7 trajectoires sur 92 présentent une diffusion confinée. A cette diffusion confinée est toujours associée une diffusion aléatoire à longue distance. De plus, le coefficient de diffusion à longue distance DMACRO est également plus lent à 37°C qu’à 22°C (respectivement 2,0.10-4 et 4,7.10-4 µm²/s). Les rayons des domaines sont tous inférieurs à 90 nm, on ne retrouve pas de confinements de taille moyenne (100 à 250 nm) ou grande (450 à 650 nm). Le faible nombre de trajectoires présentant ce type de diffusion ne permet malheureusement pas d’analyser le lien entre le D1-2 et la taille des domaines, afin de confirmer ou d’infirmer la loi D~L². De même, la détection des sauts sur ces trajectoires n’a pas pu être faite. On peut néanmoins remarquer que le coefficient de diffusion varie bien dans le même sens que la taille des domaines (diminution des deux à 37°C par rapport à 22°C).
Les résultats obtenus en SPT montrent une modification importante liée au changement de température, tant au niveau des proportions de chaque type de diffusion, qu’au niveau des coefficients de diffusion associés. Les récepteurs ayant une diffusion dirigée semblent accélérer à 37°C (D et v), au contraire de ceux qui sont confinés, ou qui présentent une diffusion aléatoire (diminution de Dmicro et DMACRO).
L’accélération des récepteurs présentant des trajectoires dirigées est cohérente avec la vision que ce type de diffusion correspond à des molécules interagissant avec les filaments d’actine, eux-mêmes plus actifs à 37°C. Il est donc probable que ce soit effectivement le cas du récepteur µ*. Il reste à vérifier cette hypothèse en étudiant les effets d’une déstabilisation du cytosquelette sous-membranaire d’actine sur les trajectoires dirigées. De plus il faudra déterminer si cette interaction est directe ou est réalisée par l’intermédiaire d’autres protéines, par exemple la filamine (Onoprishvili, 2003).
On peut supposer que le ralentissement des récepteurs ayant un autre type de diffusion est dû à un encombrement plus grand de la membrane à 37°C. En effet, il est probable que le trafic des protéines (montée à la membrane et également endocytose constitutive) soit plus efficace à température physiologique qu’à 22°C. Dans ce cas, le nombre de protéines présentes à la membrane, ou dans l’environnement sous membranaire proche, est plus grand et peut causer une gêne stérique au déplacement des constituants membranaires. De même si on considère que le cytosquelette est plus actif à 37°C qu’à 22°C, son influence sur la diffusion est probablement plus importante à cette température. Dans les deux cas il s’agit d’un encombrement plus important de l’environnement proche du récepteur qui ralentit sa diffusion.
Des résultats obtenus par FRAP sur les récepteurs à la vasopressine ne vont pas dans le même sens que nos observations. En effet, le coefficient de diffusion des récepteurs V1 (Jans, 1990) et V2 (Jans, 1989) augmentent avec la température. Néanmoins nos résultats sont comparables avec ceux observés précédemment pour le récepteur T7-hMOR exprimé dans des NRK (Daumas, 2003a). En effet une accélération des récepteurs présentant une diffusion dirigée, et un ralentissement des récepteurs confinés, ont été observés à 37°C par rapport à 22°C. De même la taille des domaines est plus petite à 37°C qu’à 22°C (Daumas, 2003a). Une autre étude a montré que l’augmentation de la température de 25°C à 37°C entraîne un ralentissement de deux protéines transmembranaires, observées en FCS. De plus dans cette même étude, l’influence du cytosquelette sur la diffusion des protéines membranaires est moindre à 25°C qu’à 37°C, ce qui est cohérent avec les résultats présentés ici (Wawrezinieck, 2006).
Ces résultats indiquent que le rôle de la température sur la diffusion des constituants membranaires est probablement plus complexe que supposé, et ne se réduit pas à une augmentation de l’agitation thermique. De plus il est possible que l’influence de la température soit différente en fonction de la protéine étudiée. Enfin la technique utilisée joue également un rôle dans la détection ou non, de ces perturbations qui peuvent être faibles. Ceci est notamment visible dans notre cas où l’accélération de certains récepteurs vient compenser le ralentissement des autres, ce qui entraîne une absence de changement significatif du coefficient de diffusion moyen mesuré par FRAPrv entre 37°C et 22 C.