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→ Algorithmes de Simson et Saxton
Dans le cas de confinement transitoire au cours de la trajectoire, le MSDδt totale ne correspond ni à une diffusion confinée ni à une diffusion aléatoire (Dietrich, 2002; Sheets, 1997). Il est donc particulièrement intéressant de pouvoir détecter des zones de confinements intermittents par une autre méthode. Sur la base des travaux de Saxton (Saxton, 1993) Simson (Simson, 1995) a développé une méthode de détection des zones de confinement transitoire.
A partir de trajectoires aléatoires simulées, Saxton a calculé la probabilité ψ qu’une particule reste dans un domaine de rayon R’, pendant un temps t pour un coefficient de diffusion D donné : '² 5117 . 2 2048 . 0 log R Dt − = Ψ (Eq. 21). 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 0 2 4 6 8 10 Delta t (s) M S D ( µ m ²)
Figure 29 : MSDδt simulées pour les différents types de diffusion simple. Noire : aléatoire, MSDδt = 4Dt, avec D = 0,01 µm²/s
Rouge : dirigée, MSDδt = 4Dt + v²t², avec D = 0,01 µm²/s, v = 0,1 µm/s
Verte : confinée, MSDδt = (L²/3)*(1-e(-12D*t/L²), avec D = 0,08 µm²/s, L = 0,8 µm Bleu : confinée avec diffusion à longue distance, MSDδt = (L²/3)*(1-exp(-12Dmicro*t/L²) + 4*DMACRO*t, avec Dmicro = 0,08 µm²/s, L = 0,8 µm, DMACRO = 0,01 µm²/s
Afin de pouvoir utiliser cet algorithme pour l’étude de trajectoires expérimentales, Simson et coll. ont divisé la trajectoire totale en segments plus courts. D est évalué aux temps courts à partir de la MSDδt de la trajectoire entière, et R’ correspond à la plus grande distance séparant l’origine du segment des autres points du segment (fig. 30).
L’équation 21 est alors appliquée aux segments de la trajectoire ce qui permet de lui attribuer une valeur ψ en chaque point. Cette probabilité est transformée en un index de probabilité de confinement I (appelée L dans la publication de Simson et coll., 1995.). Lorsque ψ est inférieur à 0,1 c'est-à-dire lorsque la molécule a plus de 90% de chance d’être confinée alors on lui attribue un I d’autant plus grand que la valeur de ψ est faible. Au contraire si ψ est supérieur à 0,1 c'est-à-dire si la molécule a moins de 10% de chance d’être confinée, alors I est égal à zéro :
Quand 1 , 0 1 , 0 > Ψ ≤ Ψ alors 0 1 log = − Ψ − = I I
Ceci permet de simplifier la lisibilité du graphe I en fonction du temps, puisque les zones aléatoires ont des valeurs de I faibles, alors que les zones confinées présentent des pics de valeurs. Néanmoins une trajectoire aléatoire peut parfois mimer un confinement, c’est pourquoi il est nécessaire de déterminer une valeur seuil Ic au dessus de laquelle les valeurs de I ont seulement 1,5% de probabilité d’être considérées confinées alors qu’elles sont aléatoires. Ce seuil est calculé à partir de trajectoires aléatoires simulées, et dépend de la taille des segments considérés et de l’intervalle entre les points.
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→ Modification de l’algorithme
Ce programme a été implémenté dans l’équipe par Laurent Le Guyader. Des modifications importantes ont ensuite été apportées de manière à limiter les artefacts induits. Figure 30 : Test de confinement effectué sur un court segment de la trajectoire analysée. Le rayon R’ de la région testée est défini par la plus grande distance séparant un point et l’origine du segment. D’après (Simson, 1995).
Ces travaux ont abouti à la formulation d’un nouvel index de confinement par Nicolas Destainville (Laboratoire de Physique théorique, UMR 5152 UPS/CNRS).
La première étape a consisté à adapter l’algorithme au matériel utilisé dans l’équipe. Les valeurs de seuil Ic ont été recalculées pour des tailles de segments glissants de 1 à 12 secondes, avec notre fréquence et notre durée d’enregistrement des trajectoires (25Hz, 120 secondes au lieu de 3 Hz sur 90 secondes). De manière à prendre en compte les variations du coefficient de diffusion au cours du temps, le D1-2 utilisé est désormais calculé « à la volée » à partir des MSD de segments glissants (S) de 4 secondes.
De plus, afin de minimiser l’influence de quelques points très extérieurs à la trajectoire, la valeur R’ de l’équation 21 qui correspond, dans la méthode de Simson à la distance séparant l’origine des autres points du segment, est remplacée par la variance des distances des points du segment considéré (∆R’²). Le nouvel index de confinement Λ, utilisé dans ce travail, est donc le suivant (Meilhac, 2006):
2 2 1 ' R S D ∆ = Λ − , (Eq. 22)
où S est le segment glissant utilisé pour l’analyse des trajectoires. La valeur seuil Λc est calculée égale à 4 (Meilhac, 2006) :
Λ > 4 → confiné Λ < 4 → aléatoire
Les trajectoires expérimentales sont analysées par segments glissants de taille fixée (S), avec un pas δt égal à l’intervalle de temps entre deux points. Pour chaque S, un point donné rentre donc en compte dans plusieurs calculs, et la valeur de Λ finale correspond à leur moyenne (fig. 31). Les points qui ne sont pas pris en compte dans un nombre suffisant de segments, c’est-à-dire les points de début et de fin de trajectoire, ne sont pas reportés sur le profil de probabilité. Les index de confinement Λ ne sont donc indiqués que pour les points compris entre S et (N-S), où N est le nombre total de points de la trajectoire (fig. 31).
Enfin le profil Λ en fonction du temps est tracé pour chaque valeur de S choisie. Pour qu’une partie de la trajectoire soit considérée comme confinée il est nécessaire que les valeurs de Λ soient supérieures au seuil Λc, durant un temps au moins égal à la durée du segment considéré. Ceci permet en plus de déterminer approximativement la durée du confinement (fig. 32).
Figure 31 : Schéma représentant l’analyse de la trajectoire par segment glissant. Le segment de taille fixée glisse d’un pas δt, ainsi les premiers points de la trajectoire sont pris en compte un nombre de fois moindre que ceux situés plus en amont. Seules les valeurs comprises entre S et (N-S) sont prises en compte.
S δt Nombre de S pris en compte Nombre de S pris en compte
Figure 32 : Profil de probabilité de confinement obtenu pour une trajectoire simulée présentant deux confinements : le premier de 6 secondes, le second de 10 secondes. Résultat obtenu avec le programme Trapping Finder utilisant l’équation 22 pour définir l’index de confinement Λ (figure extraite du rapport de stage de Laurent Le Guyader). Le trait représente la valeur seuil Λc.
0 2 4 6 8 10 12 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 S = 4s S = 6s S = 8s S = 10s S = 12s Ic Temps (s) In d ex d e co n fi n em en t
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→ Détection des sauts entre domaines
A partir du profil de probabilité, une analyse plus fine a été menée par Nicolas Destainville et Nicolas Meilhac grâce à des simulations de trajectoires présentant des confinements (Meilhac, 2006). Cette analyse est nécessaire dans le cas d’un confinement présent tout le long de la trajectoire, et dont la MSDδt est décrite par un confinement avec une diffusion à longue distance. Le but est de déterminer l’existence de sauts entre des domaines voisins au cours du temps. De tels sauts sont notamment décrits dans le modèle de confinement par le cytosquelette (Kusumi, 1993 ; Suzuki, 2005).
Seules les trajectoires où les deux D calculés à partir de l’ajustement de la MSDδt par l’équation 20 respectant le rapport ci-dessous peuvent être traitées :
20 ≥ macro micro D D (Eq. 23)
Les sauts sont détectés lorsque le profil de probabilité de confinement passe en dessous d’une valeur seuil pendant un temps supérieur à un temps critique.
Le choix de la valeur seuil et du temps critique sont donc essentiels pour l’efficacité de détection des sauts. Ils peuvent également engendrer des fausses détections. Ainsi, plus le temps critique est court, plus les fluctuations du profil peuvent induire de fausses détections. Ces deux critères ont donc été choisis pour optimiser la détection afin de trouver un maximum de vrais sauts et un minimum de faux sauts.
La valeur seuil est égale à la moyenne des Λ obtenus sur une durée donnée (20 secondes) multipliée par 0,7. Le temps critique est choisi égal à S/3 (Meilhac, 2006). Cette analyse des trajectoires expérimentales obtenues dans ce travail a été réalisée par Nicolas Destainville.
Même si nous ne les avons pas utilisés dans ce travail il faut signaler l’existence d’autres outils d’analyses des trajectoires. Par exemple un index de corrélation de vitesse (speed correlation index) qui a récemment été développé par Bouzigues et Dahan permet de détecter des périodes de diffusion dirigée au sein de périodes aléatoires (Bouzigues, 2007). Une autre méthode permettant de discriminer des variations transitoires entre les différents modes simples de diffusion, au cours du temps, a été mise au point dans une autre équipe (Huet, 2006b).
2.4.3 – Résolutions spatiale et temporelle
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→ Limites de résolution
La résolution temporelle est fixée par la méthode d’enregistrement, c’est-à-dire la caméra, soit 25 images par seconde dans notre cas. Lors de précédentes études réalisées dans l’équipe, la résolution spatiale a été mesurée de l’ordre de 15 nm pour chaque axe x et y, pour des trajectoires de 2 minutes (Daumas, 2003b). Bien que la chaîne de mesure du SPT n’ait pas changé depuis, le traitement des images a été modifié. Ces valeurs de résolution spatiale ont été conservées pour les séquences d’images qui ont été « post-traitées », la résolution spatiale a été de nouveau mesurée pour les séquences d’images traitées en temps réel.
Elle a été vérifiée par la prise de trajectoires de colloïdes immobilisés dans un gel d’acrylamide. Les écart-types des coordonnées obtenus à partir de 30 colloïdes immobiles par les deux méthodes de détection en temps réel sont indiqués dans le tableau 7 ci-dessous, pour des durées de 5 et 120 secondes.
Ainsi des colloïdes immobilisés ont un déplacement apparent d’environ 15 nm sur chaque axe en 2 minutes d’enregistrement, ce qui constitue notre résolution spatiale. Cette valeur est proche quelle que soit la méthode de détection, et est du même ordre que celle obtenue précédemment. On peut noter que la détection par convolution semble plus résolutive sur des temps courts par rapport à la détection du centre de masse.
De plus il est possible à partir de la MSDδt de ces trajectoires de déterminer le D1-2 minimal accessible. En moyenne, les trajectoires obtenues avec la méthode de détection du centre de masse ont un D1-2 de 7,1.10-5 ± 1,0.10-4 µm²/s. Celles obtenues avec la méthode de Tableau 7 : Ecart-types en x et en y obtenus à partir de 30 trajectoires de colloïdes immobiles, par les deux méthodes de détection en temps réel. Toutes les valeurs sont données en nm.
Centre de masse Convolution
Ecart type (x) 15,2 15,6
Ecart type (y) 14,2 15,5
Moyenne (x,y) 14,7 15,6
Ecart type (x) 6,2 3,0
Ecart type (y) 6,3 2,7
Moyenne (x,y) 6,2 2,8
120 secondes