Correction du front d’onde sur un objet fluorescent étendu

L’utilisation d’un objet fluorescent étendu par rapport à la taille d’un grain de speckle complique le processus d’optimisation. Plusieurs grains de speckle vont exciter de la fluorescence non linéaire simultanément. Ils vont rentrer en compétition pendant l’optimisation du front d’onde. Si un grain très brillant (ou un focus) existe initialement, le système de correction du front d’onde va focaliser dessus. Sinon, après un certain temps d’optimisation, l’un des grains de speckle va gagner la compétition et le système focalisera dessus.

De plus, la variation de la fluorescence pendant l’optimisation d’un mode sera plus faible car elle sera alors la moyenne des variations de fluorescence émise par chaque grain de speckle avec des maximas différents. Finalement, le rapport amplitude de modulation sur bruit sera plus faible, nécessitant alors l’intégration sur plus d’impulsions laser.

129 Deux couches de parafilm ont été déposées au-dessus de grains de pollens. Le focus formé est ici fortement déformé (figure 5.A) et présente 5-6 lobes intenses. L’image de fluorescence formée avant correction (figure 5.C) est donc fortement aberrée. L’optimisation du front d’onde a ici pris 5 s pour converger avec le set des modes imposant des tilts locaux avec un taux d’optimisation par mode de 50 Hz. Un focus a été formé (figure 5.B) d’intensité 2 fois plus élevée que les lobes présents avant correction.

L’image de fluorescence ensuite générée (figure 5.D) est bien résolue autour du point où la correction a eu lieu (croix rouge sur la figure 5.C). L’interstice entre deux lobes de ce grain de pollen apparait. Néanmoins, l’aire de l’effet mémoire est plus petite que la taille du grain de pollen. Ici, la partie basse du pollen est moins bien imagée qu’avant, le masque de phase appliqué corrige bien la diffusion dans la gamme d’effet mémoire mais, au contraire, détériore encore plus le focus en dehors.

Figure 5. Optimisation sur un échantillon fluorescent étendu à travers un milieu diffusant (L/l_s~2.4). A. et B. Respectivement les focus imagés en transmission avant et après correction

du front d’onde. Le focus initial est formé de cinq pics intenses, un focus unique trois fois plus intense est obtenu après optimisation C. et D. respectivement les images de fluorescence

obtenues avant et après correction du front d’onde. La croix rouge indique la position où l’optimisation a eu lieu. E. Evolution de la fluorescence non linéaire pendant l’optimisation.

La correction du front d’onde est plus longue que précédemment à converger car plusieurs grains de speckle sont en compétition. F. Profils de fluorescence obtenus avant et après optimisation selon la ligne rouge tracée sur la figure D. Le gain sur la fluorescence au point où l’optimisation à lieu est proche de 60%. Le gain sur la fluorescence reste faible en raison

130 Ici le gain en fluorescence non linéaire n’est que de 60% alors que nous nous attendrions à un gain de 400% (le carré du gain obtenu au focus). Un modèle simple peut expliquer ce résultat. Avant correction, la fluorescence non linéaire est générée par le grain de speckle qui va être optimisé mais aussi par l’ensemble des autres grains de speckle qui illumine l’objet fluorescent. Ces derniers génèrent alors un signal de fond. Seul un des grains voit son intensité être augmentée alors que les autres conservent leur intensité d’origine. Finalement le gain réel en fluorescence totale définie comme le rapport en la fluorescence émise après optimisation Fopt sur la fluorescence émise avant optimisation Fref peut être écrit comme :

𝐹_𝑜𝑝𝑡

𝐹_𝑟𝑒𝑓= ^𝑆𝑜𝑝𝑡+𝐵

𝑆_𝑟𝑒𝑓+𝐵 (6.2)

Avec Sref et Sopt les fluorescences émises par le grain de speckle, respectivement, avant et après correction et B la fluorescence de fond émise par les autres grains de speckle. Ce modèle est entièrement valable en régime de diffusion multiple où une expérience de façonnage de front d’onde ne modifie pas l’énergie du speckle environnant le focus formé. Ce n’est pas entièrement le cas pour des régimes moins diffusants comme ici mais il permet néanmoins de bien comprendre le faible gain non linéaire obtenu.

Dans notre situation, nous avons multiplié par 2 l’intensité d’un grain de speckle ce qui a résulté à un gain en fluorescence non linéaire totale de 160%. Selon l’équation 6.2, cela revient à avoir un background de fluorescence généré par 4 grains de speckle. C’est raisonnable au vu de l’image de speckle mesurée avant optimisation.

Nous retrouvons, d’une certaine manière, la limite fondamentale de l’imagerie en profondeur en microscopie à deux photons présentée au chapitre 1. Le signal d’intérêt est noyé au milieu d’une fluorescence non linéaire émise hors focus. En général, la fluorescence de fond est émise en surface résultant à un signal parasite constant sur l’ensemble des images de fluorescence. Ici le signal de fond est généré par le halo de speckle entourant le focus, le signal de fond résultant ne sera pas constant sur l’ensemble de l’image formée par balayage du focus. Il dépend alors de la taille du halo de speckle (donc de la profondeur), de la taille des objets fluorescents et de leur distribution (marquage fluorescent clairsemé ou dense).

Néanmoins, après l’optimisation, le signal de fluorescence est beaucoup plus spécifique ! Il provient préférentiellement du focus. Dans notre situation, le rapport signal

131 deux photons sur bruit a été multiplié par 4. Il peut être néanmoins difficile de l’estimer à partir de l’image de fluorescence seule car le background n’est pas constant sur l’ensemble de l’image.