Ce système de correction du front d’onde a été développé pour imager en profondeur des neurones d’une souris. Une première configuration possible pour ce montage est de corriger la diffusion induite par le crâne intact pour imager les neurones des couches superficielles du cerveau [153]. Deuxièmement, la diffusion induite par le cerveau lui-même peut être corrigée pour améliorer en profondeur les images de fluorescence réalisées et ultimement améliorer la profondeur d’imagerie.
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6.3.1 Crâne de souris ex vivo
Un crâne collecté après la chirurgie d’une souris (ls = 55µm [153] et L~300 µm) a été placé au-dessus d’un échantillon de grains de pollen. Le focus formé après propagation à travers le crâne est fortement détérioré, voir figure 8.A et l’image de fluorescence formée est fortement aberrée mais un grain de pollen en forme de losange reste devinable. Une optimisation du front d’onde, réalisée en 30s, permet d’obtenir un focus avec un gain de focalisation de 13. Le signal non linéaire émis par le focus a donc été multiplié par 170 mais la fluorescence de fond reste importante.
La taille d’effet mémoire au niveau de l’échantillon est de l’ordre de 15 µm est ici plus petite que l’objet à imager. Elle est cependant plus grande que la taille moyenne d’un neurone d’une souris (10 µm) ouvrant la perspective d’une imagerie neuronale à travers un crâne intact (à l’échelle d’un corps cellulaire individuel). Une caractérisation plus précise de l’effet mémoire à travers un crâne de souris sera nécessaire dans le futur.
Figure 8. Optimisation à travers un crâne de souris ex-vivo. A. et B. Respectivement les focus imagés en transmission avant et après correction du front d’onde. C. et D. respectivement les
images de fluorescence obtenues avant et après correction du front d’onde. E. Profils de fluorescence obtenus avant et après optimisation selon la ligne rouge tracée sur la figure D. Le
gain sur la fluorescence au point où l’optimisation a lieu est proche de 100%. Néanmoins l’étendue de l’effet mémoire est plus petite que l’objet fluorescent à imager. L’insert est le
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6.3.2 Souris In vivo
Pour finir, nous avons installé des souris anesthésiées sous le microscope non linéaire. Deux lignées de souris transgéniques ont été utilisées, l’une exprimant tdTomato dans les neurones inhibiteurs Paravalbumine (PV-tdTomato), l’autre exprimant l’EGFP dans tous les neurones inhibiteurs (GAD65-EGFP). Les deux souris présentent un marquage clairsemé limitant la fluorescence émise hors focus, car les neurones inhibiteurs représentent environ 10% des neurones du cortex. Nous avons ensuite utilisé notre système de correction du front d’onde jusqu’à une profondeur de 500 µm. Les images de fluorescence obtenues pour trois profondeurs avant et après correction sont présentées sur la figure 8. La correction est obtenue en optimisant la fluorescence non linéaire au centre du neurone. A faible profondeur (130 et 300 µm) l’optimisation est rapide (respectivement 200 et 300 ms) car le système corrige, a priori, principalement des aberrations. Le gain sur l’image de fluorescence est donc relativement faible de 10 à 20%. A plus grande profondeur, la correction commence à corriger la diffusion, l’optimisation prend alors plusieurs secondes (5s) mais le gain sur la fluorescence est plus important : il est ici de 60%.
Une borne supérieure du champ de vue de la correction peut être estimée à partir de la figure 9.C3. Le neurone présent en haut du champ de vue (voir figure 9.C1 et C2) voit son intensité diminuer après optimisation. Il est à la limite de l’effet mémoire du système qui est alors de l’ordre de 40 µm. Si besoin, une étude plus poussée de l’étendue de l’effet mémoire pourra être menée avec notre système.
137 Figure 9. Correction du front d’onde à plusieurs profondeurs chez des souris anesthésiées in vivo. A1, B1 et C2 sont respectivement les images de fluorescence obtenues à 130, 300 et 500
µm avant correction du front d’onde. A2, B2 et C2 sont les images équivalentes obtenues après correction du front d’onde. A3, B3 et C3 sont les profils d’intensités obtenus selon
les lignes en pointillés rouges.
La correction de la diffusion au-delà de 500 µm a été rendue difficile en raison du photo-blanchiment des fluorophores présents. Le fluorophore ciblé photo-blanchit avant la fin de l’optimisation. Le focus n’est finalement jamais optimisé et, au contraire, est détérioré.
La décorrélation du speckle, à ces profondeurs, n’a pas semblé impacter le processus d’optimisation. Néanmoins des mesures poussées n’ont pas encore été réalisées pour conclure correctement sur ce point. Le mouvement individuel d’un neurone est parfois un frein à
138 l’optimisation (dû à la respiration ou au battement cardiaque). Si le neurone se déplace en dehors du focus, le signal de fluorescence est perdu et l’optimisation échoue. Cet effet semble plus marqué pour des neurones en profondeur.
6.3.3 Conclusion
Pour conclure, nous avons corrigé partiellement un mélange d’aberrations et de diffusions induites par des échantillons biologiques ex vivo et in vivo. Ex vivo, nous avons corrigé la diffusion induite par un crâne de souris. Le champ de vue de la correction appliquée est plus grand qu’un neurone et la diffusion induite par un crâne de souris semble stable dans le temps. Il est donc envisageable d’imager un neurone de suivre l’activité neuronale à travers le crâne avec un meilleur rapport signal sur bruit avec ce système, en utilisant des marqueurs calciques du type GCamp6. In vivo, nous avons corrigé partiellement de la diffusion et des aberrations induites par le cortex d’une souris jusqu’à 500 µm de profondeur. A ces profondeurs l’effet mémoire semble encore large (~40 µm) et la décorrélation temporelle du speckle semble lente. Des mesures complémentaires seront nécessaires pour confirmer ces observations.
La stratégie d’optimisation utilisée n’est pas forcement la plus adaptée. Les différentes optimisations ont été réalisées sur des objets fluorescents étendus : les neurones. Pour accélérer la convergence et donc réduire le photo-blanchiment, il serait préférable d’optimiser sur des objets fluorescents plus petits comme des dendrites. L’optimisation devra alors être plus rapide que le temps mis par l’objet pour sortir du focus.
Les autres systèmes de correction du front d’onde décrits dans la littérature [151,152] obtiennent des gains sur la fluorescence totale similaire au notre (de l’ordre de plusieurs dizaines de pourcents) sur les corps cellulaires des neurones en profondeur. Ils ont, de plus, montré que des gains beaucoup plus importants peuvent être obtenus sur des objets fluorescents de petites tailles (comme des dendrites). J. Park et al [153] ont obtenu des gains de 6 à travers un crâne sur une dendrite.
In vivo, le gain obtenu spécifiquement par le focus n’est pas mesurable avec nos techniques (on ne peut pas mettre une caméra à l’intérieur d’une souris). Aucune image du focus n’est accessible, il est donc difficile de comprendre par quoi est émise la fluorescence (par le focus ou le speckle environnant). Seul le F-SHARP [103] développé par I.
139 Papadopoulos et al est actuellement capable d’imager la forme du focus en profondeur et donc est capable d’estimer le gain de focalisation obtenu sur le focus d’excitation.