Conclusion, résultats complémentaires et perspectives de l'étude

- Dans ce premier article, nous montrons, pour la première fois, qu'il est possible de cultiver des cellules de LF en 3D. La méthode développée permet de produire des agrégats qui présentent une rigidité comparable à celle des sphéroïdes, et qui peuvent être suivis sur le long terme.

La première conséquence que nous observons est la dérégulation du transcriptome quand les cellules de LF sont cultivées en 3D, caractéristiques déjà évoquées dans les modèles in vivo (xénogreffes) et in vitro (sphéroïdes) de cancers solides (§III-C-2). De manière surprenante, presque 1/3 des gènes sont régulés de manière différentielle quand les cellules de LF sont en 3D. Parmi ces 7000 gènes dérégulés, 612 le sont d'un facteur supérieur ou égal à x2 ou /2. L'utilisation du logiciel Autocompare nous a permis de mettre en évidence que 4 familles de fonctions étaient significativement enrichies dans les échantillons de MALC:

- la réponse à l'hypoxie

- la cascade de signalisation I kappa B - NF kappa B - la régulation du cycle cellulaire

- la régulation négative de l'apoptose

Le fil conducteur de ce travail est un recoupement entre les gènes qui sont enrichis dans les MALC, et ceux qui sont enrichis dans les échantillons de FL: pour les familles fonctionnelles auxquelles nous nous sommes intéressé, il est très intéressant de voir que la signature moléculaire caractéristique des MALC est toujours plus proche de celle des LF que celle des cellules cultivées en suspension. L'identification de ces familles et cette homologie vis-à-vis des échantillons de patients nous a poussé à mesurer les conséquences fonctionnelles des dérégulations de transcriptome dans les cellules de MALC.

Nous mettons en évidence que la culture 3D induit des phénomènes d'hypoxie, démontrés par l'incorporation d'une sonde, le pimonidazole, qui forme des adduits avec les protéines intracellulaires uniquement quand les cellules sont en manque d'oxygène (264). Au niveau moléculaire, cette hypoxie se traduit par une augmentation de l'expression de la protéine

HIF1α, ainsi qu'une augmentation de la sécrétion de VEGF par les cellules. De manière intéressante, l'expression de cette protéine est aussi détectée dans les coupes de ganglions lymphomateux, à des niveaux d'expression variables, dans 60% des cas. De plus, l' augmentation de la concentration de VEGF est aussi observée dans le sérum des patients atteints de LF, comparativement aux donneurs sains (80). Néanmoins, le parallèle avec la clinique ne peut être établi pour ce qui est du statut hypoxique des tissus lymphoïdes malins. En effet, même si plusieurs traceurs, couplés à des molécules radiomarquées, sont disponibles pour détecter l'hypoxie par des techniques d'imagerie de tomographie par émission de positons (TEP, ou PET-scan), aucune de ces molécules n'a reçu d'autorisation de mise sur le marché en France à ce jour.

Nous prouvons que la voie pro-survie NF-KB est activée dans les MALC comparativement aux cellules en suspension, via l'augmentation de la phosphorylation de p65 (Ser536), la translocation nucléaire accrue de p65, et la surexpression de la molécule ICAM-1. Bien que cette voie soit généralement considéré comme déterminante dans le LBDGC, aucune étude à ce jour n'a montré son implication dans le LF. Des investigations plus poussées mériteraient d'être menées dans ce domaine, toujours afin d'en améliorer la thérapeutique.

Enfin, nous démontrons que la prolifération est fortement impactée par ce mode de culture. Un ralentissement dans la progression dans le cycle cellulaire a été démontré par des analyses d'incorporation de BrdU - Iodure de propidium. Les données obtenues dans ces analyses nous ont fait penser que ce ralentissement de la prolifération était dû à un blocage à la transition G1-S dans le cycle cellulaire. Nous nous sommes alors intéressé au statut de CDC25A, phosphatase impliqué dans la progression dans le cycle. Des expériences de Western Blot et de RT-qPCR nous ont permis de montrer que CDC25A est régulé négativement dans les MALC, aussi bien au niveau transcriptionnel que protéique (figure 25). Nous avons donc pensé que c'était cette protéine qui était responsable du blocage dans le cycle. Mais des expériences supplémentaires ont privilégié une autre hypothèse. En effet, en utilisant des techniques d'analyse du cycle cellulaire "à haute résolution", décrites dans les années 90 (265) nous avons montré que les cellules de MALC entrent progressivement en quiescence. En effet, elles perdent l'expression du marqueur Ki-67, sans qu'il y ait d'augmentation du score nécrotique (figure 4 de l'article). Cette observation est intéressante, dans le sens où ce phénotype est très semblable à celui observé dans les échantillons de patients. Cette sortie de cycle corrèle à une augmentation de l'expression de 2 protéines connues pour stopper la

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 F o ld ( C t) β

progression dans le cycle cellulaire et favoriser l'entrée en quiescence : p27-Kip1 et p21-Cip1 (figure 4 de l'article).

La dernière étape de ce travail a été de caractériser la fraction quiescente, viable, isolée à partir des MALC. Ceci s'est avéré être plus compliqué qu'attendu, et de nombreuses mises au point ont été nécessaires pour y parvenir. Toutefois, nous avons pu montrer que les cellules quiescentes isolées à partir des MALC sont plus résistantes aux anthracyclines et aux agents alkylants que les cellules cyclantes. A première vue, cette caractéristique de cellules quiescentes est plutôt attendue. Toutefois, les résultats présentés dans l'article sont obtenus 4 jours après le traitement (soit 4 jours après le tri), et, sur le même panel, nous montrons que les cellules quiescentes non traitées, 4 jours après la remise en culture, ont retrouvé des capacités de prolifération identiques à des cellules normales, puisqu'elles atteignent la densité de 2 millions par millilitre. Cette observation laisse penser que ces cellules perdent leur caractère quiescent, mais conservent une capacité de résistance aux médicaments anti- cancéreux résiduelle vis-à-vis des agents ciblant les cellules en prolifération, et ce de manière durable dans le temps. On pourrait, en extrapolant toutefois, penser que ce type de phénomène est responsable de la persistance de la maladie.

Figure 25: Régulation négative de cdc25a dans les MALC. La phosphatase CDC25A est sous- exprimée dans les MALC comparativement aux cellules en suspension, aux niveaux transcriptionnel et protéique. A. Niveau d'expression du transcrit codant pour CDC25A, dans les cellules en suspension et dans les MALC, révélé par RT-qPCR. B. Expression protéique de cdc25a en 2D et dans les MALC, analysée par WB.

Nous avons également caractérisé le transcriptome de ces cellules quiescentes, comparativement à leurs analogues "cyclantes". Dans l'article, nous avons présenté certains gènes cibles qui étaient dérégulés, et que nous avions sélectionnés en fonction des thématiques développées précédemment. Toutefois, il est intéressant de noter que plusieurs gènes de la famille "réponse à l'hypoxie" sont sur-régulés dans les échantillons quiescents (VEGF, HIG2,..), ce qui nous conforte dans l'hypothèse que l'hypoxie contribue au caractère quiescent des cellules de LF. Il pourrait être intéressant d'approfondir l'étude de la signature spécifique de cette sous-population quiescente, voire même de la comparer aux échantillons issus de biopsies de LF, pour voir si elle s'en rapproche plus encore que le profil de la population cellulaire entière de MALC.

Pour conclure, ce travail démontre que l'organisation 3D est un paramètre déterminant pour la biologie des cellules de LF. Le caractère quiescent, très spécifique du LF, et pourtant inexistant dans les lignées cellulaires en suspension, est reproduit dans ce contexte. De plus, un rapprochement du profil moléculaire est observé entre les cellules de MALC et les échantillons de LF, ce qui témoigne de la relevance de ce modèle pour l'étude de la pathologie lymphomateuse. Ces modifications phénotypiques induites par la culture à haute densité se produisent via l'adaptation des cellules à des conditions de stress très importantes. L'homologie de ces caractéristiques avec la "vraie vie" suggère que le paramètre structural ne doit surtout pas être négligé dans les études menées sur le LF.

4. Etude complémentaire : Accumulation & Régulation de la matrice