As serpentes da família Elapidae são mais encontradas na Ásia, África e Austrália, onde se destacam os gêneros Naja, Bungarus e Oxyuranus. No Brasil, são popularmente conhecidas como “cobras corais” e agrupadas em três gêneros: Micrurus, Leptomicrurus e
Micruroides (MELGAREJO, 2003).
O gênero Micrurus reúne 57 espécies e mais de 120 subespécies (ALAPE-GIRON et al., 1994; BARROS et al., 1994; AIRD, DA SILVA JR, 1991), e apresenta ampla dispersão geográfica, ocorrendo nos Estados Unidos, México, na Mata Atlântica, do Nordeste ao Sudeste do Brasil, e no Cerrado, além de outros países da América do Sul (GIRAUDO, SCROCCHI, 2002; CAMPBELL, LAMAR, 2004).
Micrurus lemniscatus (Figura 9) apresenta um porte maior quando comparado às outras cobras corais, podendo chegar a 1,5 metros de comprimento. O focinho é rombudo e preto, com uma faixa internasal branca.
No Brasil são registradas quatro subespécies: M. l. lemniscatus, M. l. carvalhoi, M. l.
diutius, M. l. helleri (MELGAREJO, 2003). Habitam em áreas florestadas e abertas,
geralmente em locais com bastante umidade, e também ambientes antropizados (CAMPBELL, LAMAR, 2004). Alimentam-se de presas com corpo alongado, como serpentes, anfisbenídeos e peixes (SAZIMA, ABE, 1991) e observa-se tanto atividade diurna quanto noturna, principalmente durante a estação chuvosa, novembro-fevereiro (MARTINS, OLIVEIRA, 1998).
Figura 9. Micrurus lemniscatus. Apresenta pescoço curto, pouco pronunciado, adaptado a escavação, cabeça oval, recoberta por grandes placas simétricas, dentição proteróglifa, sem fosseta loreal, olhos pequenos e pretos com pupilas elípticas verticais e geralmente
localizadas em uma faixa preta na cabeça. (Fonte:
<http://www.flickr.com/photos/nclarkii/3903579203/sizes/z/in/photostream/>, acesso em 11 de agosto de 2011)
1.4 VENENOS ELAPÍDEOS
Até o ano de 2012, foram reconhecidas 386 espécies de serpentes no país (BÉRNILS, COSTA, 2012) de forma que o Brasil continua a ocupar a segunda colocação na relação de países com maior riqueza de espécies de répteis; ficando atrás apenas da Austrália.
Os acidentes causados por serpentes peçonhentas representam significativo problema de saúde pública, especialmente em países tropicais, pela frequência com que ocorrem e pela mortalidade que ocasionam (PINHO et al., 2004). No Brasil foram registrados, em 2010, 29.635 acidentes por serpentes, dentre os quais 85% foram ocasionados por serpentes peçonhentas. A incidência registrada foi de 15,5 acidentes / 100.000 habitantes e a taxa de letalidade foi de 0,5% (PORTAL DO MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2013).
A porcentagem de acidentes atribuída ao gênero Bothrops, Crotalus e Lachesis é 90,5%, 7,7% e 1,4%, respectivamente, enquanto acidentes causados por Micrurus representam 0,4% dos acidentes ofídicos (OLIVEIRA et al., 2009). Entretanto, apesar do baixo índice de acidentes causados por esse gênero, o envenenamento pode ser considerado extremamente grave (AIRD; SILVA JR, 1991).
O efeito provocado pelo envenenamento produzido pelas serpentes da família Elapidae, a qual engloba o gênero Micrurus, são muito variados e complexos. As manifestações clínicas predominantes estão relacionadas às ações neurotóxicas e miotóxicas do veneno sobre a junção neuromuscular, causando bloqueio da transmissão nervosa periférica (WEIS, 1971). Os sintomas observados no paciente acometido por esse tipo de envenenamento aparecem em torno de 30 a 60 minutos após o acidente e estão relacionados à paralisia dos nervos cranianos, ptose palpebral, distúrbios visuais, paralisia facial, dificuldade na fala e na deglutição, salivação, hemorragia interna, incontinência urinaria e coagulopatia. A morte geralmente é devida a uma paralisia respiratória de origem periférica (VITAL BRAZIL, 1990; KARALLIEDDE, 1995; PHUI YEE et al., 2004).
Estudos realizados com gênero Micrurus, permitiram identificar que os venenos possuem dois mecanismos de ação neurotóxica, elucidados do ponto de vista bioquímico e farmacológico apenas para poucas espécies (CECCHINI et al., 2005). São reconhecidas neurotoxinas com ações pré-sinápticas e pós-sinápticas. As neurotoxinas pré-sinápticas
compreendem principalmente as α-neurotoxinas que são caracterizadas por sua atividade de PLA2 interferindo na liberação de ACh na fenda sináptica. As neurotoxinas pós-sinápticas compreendem as α-neurotoxinas, que podem ser caracterizadas como proteínas com estrutura
three fingers (3FTx) desprovidas de ação enzimática e que atuam interagindo com receptores
colinérgicos. Neurotoxinas pós-sinápticas foram isoladas do veneno de Micrurus
surinamensis e Micrurus frontalis e atuam competindo com a ACh nos nRACh das
membranas pós-sináptica da junção neuromuscular dos nervos motores (ação semelhante ao curare) (SILVA JR.; BUCARETCHI, 2003). A peçonha de M. corallinus apresenta atividades pré e pós-sináptica, enquanto a peçonha de M. lemniscatus possuem apenas neurotoxinas pós- sinápticas (VITAL BRAZIL, 1987; CECCHINI et al., 2005).
Porém, há descrição sobre mecanismos de ação do veneno para apenas algumas espécies de Micrurus, uma vez que os estudos são limitados devido às dificuldades na correta identificação das espécies, na extração do veneno e na manutenção dos animais em cativeiro (TANAKA et al., 2010; CISCOTTO et al., 2011). Assim, estratégias proteômicas e transcriptômicas têm sido utilizadas na tentativa de elucidar sua composição. A análise do transcriptoma da glândula e do veneno da Micrurus altirostris e da Micrurus Corallinus indicou a presença de 3FTx e de PLA2 como proteínas predominantes na composição do veneno em relação a ambas as espécies (LEAO et al., 2009; CORRÊA-NETTO, 2011).
Venenos de serpentes são compostos por uma grande variedade de proteínas, peptídeos e outras moléculas orgânicas e inorgânicas, com diversas atividades biológicas as quais compreendem uma estratégia evolutiva que promove a imobilização, morte, e digestão de presas, servindo como um mecanismo de defesa contra predadores (KOCHVA; OVADIA, 1983; MEBS, 1999).
1.5 TOXINAS MUSCARÍNICAS
As toxinas dos venenos podem ser agrupadas em superfamílias com atividade enzimática e não enzimática. Algumas das bem caracterizadas superfamílias de proteínas do veneno de serpentes elapídicas incluem toxinas 3FTxs, PLA2, L-amino oxidases, lectinas, serinoproteases, metaloproteases e nucleotidases (FERNANDÉZ et al., 2011). Dentro de uma mesma família pode-se observar uma grande similaridade em termos estruturais (estrutura primária e terciária), podendo haver, entretanto, divergências nos aspectos farmacológicos (KINI; DOLEY, 2010).
Dentre as 3FTxs, estão as neurotoxinas que irão interferir na neurotransmissão colinérgica, conhecidas como toxinas muscarínicas (CLARKE et al., 1985; HARVEY, 2001; HARVEY et al., 2002). Estes polipeptídios não enzimáticas de 60 a 74 resíduos de aminoácidos, 4-5 pontes dissulfeto, com estrutura muito conservada e massa molecular de 6 a 8 kDa (CHANGEUX, 1990; KARLSSON, et al., 2000; KINI, 2002) são o alvo deste trabalho.
Oito toxinas muscarínicas foram isoladas do veneno, D. anguscticeps e três a partir do veneno da mamba preta, D. polylepis, por diferentes técnicas (ADEM el al., 1988; JOLKKONEN et al., 1994; VANDERMEERS et al., 1995; JOLKKONEN et al., 1995; MAX et al., 1993). As toxinas da mamba verde são chamados de MT-l, 2, ... MT-7 de acordo a ordem em que foram descobertos ou m1-toxina, que se refere à seletividade da toxina pelo subtipo de mRACh. As toxinas das mambas pretas foram denominadas MTα, e (JOLKKONEN et al.,1995), as quais indicam também a ordem da descoberta. Nove toxinas foram sequenciadas por métodos químicos, e a sequência de duas toxinas da serpente D.
polylepis também foram deduzidas a partir da sequência de nucleotídeos da biblioteca de
cDNA (DUCANCCEL et al., 1991; ADEM; KARLSSON, 1997; KARLSSON, 2000). Todas as sequências apresentaram grande homologia (Figura 10). A mamba verde ocidental,
Dendroaspis viridis, também possui toxinas semelhantes, mas nenhuma foi caracterizada em
Figura 10. Caracterização de algumas das toxinas de mambas australianas já descritas. (A)- Afinidade das toxinas de D. anguscticeps, D. polylepis e antagonistas muscarínicos pirenzepina e himbacina (M1 e M2, respectivamente) a receptores muscarínicos de acetilcolina (mRACh) humanos clonados e expressos em células de ovário de hamster chinês. Quanto menor o valor de Ki, maior a afinidade da toxina pelo subtipo de receptor. OS valores muito altos de Ki para MT-2 indicam que a toxina provavelmente foi inativada por hidrólise. MT- também foi parcialmente inativada. (B)- Homologia na sequência das toxinas. Os aminoácidos invariantes são marcados com dois pontos. (Fonte: ADEM, KARLSSON, 1997)
As primeiras duas toxinas muscarínicas (MT-1 e MT-2) foram isoladas do veneno da serpente australiana mamba verde, Dendroaspis angusticeps, da família Elapidae. Adem e colaboradores (1988) e Jerusalinsky e colaboradores (1992) mostraram que as toxinas tem alta afinidade por mRACh M1 de membranas de sinaptossomas do córtex de ratos. Em 1994 a MT-1 foi caracterizada por Jolkkonen o qual verificou sua atividade contrátil, quando testada em íleo de cobaia. MT-1 e MT-2 comportam-se como agonistas muscarínicos na tarefa de esquiva inibitória em ratos, e como agonistas relativamente seletivos dos mRACh M1 em canais deferentes de coelho (HARVEY, 2002).
Devido à grande seletividade das neurotoxinas presente nos venenos de algumas serpentes australianas, diversos estudos têm avaliado o perfil farmacológico de outros venenos frente aos subtipos de receptores muscarínicos. Técnicas de eletroforese, imunoquímica e cromatografia, utilizando venenos de Micrurus, tem mostrado a presença de componentes com perfil semelhante ao de outras toxinas elapídicas (CECCHINI et al., 2005) que já tiveram sua atividade muscarínica comprovada.
Estudos proteômicos do veneno de Micrurus nigrocinctus, através de sequenciamento e alinhamento dos peptídeos a bancos de dados identificaram homologia de 4 amostras a três toxinas muscarínicas de Dendroaspis angusticeps, mt-7 e uma toxina de Naja kaouthia proteina-2 (FERNANDÉZ et al., 2011).
Ciscotto e colaboradores demonstraram, em 2011, a distribuição de massas moleculares em função da frequência de ocorrência, nos venenos de Micrurus lemniscatus, sendo 6-8 kDa a massa mais recorrente (Figura 11).
Em 2011, a primeira toxina muscarínica do veneno da serpente Micrurus lemniscatus, MT-Mlα (7,048 kDa), foi isolada e apresentou atividade antagonista nos receptores muscarínicos no hipocampo de ratos com uma CI50 33,1 nM. A nova toxina muscarínica também teve os primeiros 12 resíduos de aminoácidos da sequência N-terminal determinados. Essa caracterização mostrou alta homologia com as proteínas 3FTxs que atuam nos receptores colinérgicos (SILVA et al., 2011).
Figura 11. Distribuição da massa molecular em função da frequência de ocorrência nos
venenos das serpentes. A faixa de massas mais abundantes correspondente às three fingers
2 JUSTIFICATIVA
Desde 1971, quando foi isolado do veneno de Bothrops jararaca o peptídeo que culminou no desenvolvimento do anti-hipertensivo captopril, os venenos de serpentes têm sido considerados fontes ricas em compostos bioativos potencialmente úteis (JIMÉNEZ, MUNÕZ, 2009). Atualmente, seu uso como agente terapêutico é baseado na medicina popular, contudo, estudos recentes têm fornecido a fundamentação científica para tal uso.
As toxinas muscarínicas apresentam-se como ferramentas úteis para o estudo das funções fisiológicas e proporcionam um ponto de partida para a análise da relação estrutura- atividade de diferentes subtipos de receptores muscarínicos. A identificação e caracterização de agonistas e/ou antagonistas muscarínicos isolados do veneno de serpentes (ADEM et al., 1988; JERUSALINSKY et al., 1992; JOLKKONEN et al., 1994; HARVEY, 2002) também pode ter grande potencial no esclarecimento e na farmacoterapia de patologias relacionadas à disfunção desses receptores, como doença de Alzheimer, Parkinson, esquizofrenia, dependência de drogas e outras (LANGMEAD, WATSON, REAVILL, 2008; VENTURA et al., 2010; SCARR, 2012)
Com base na constatação de que venenos de serpentes do gênero Micrurus são ricos em toxinas muscarínicas (CISCOTTO et al., 2011) e estas apresentam seletividade à subtipos de mRACh (SILVA et al., 2011), expõe-se a valiosa oportunidade na pesquisa de moléculas farmacologicamente ativas e na compreensão dos mecanismos de ação das toxinas. Para investigar a hipótese de uma atividade muscarínica no veneno de Micrurus lemniscatus avaliamos seus efeitos in vitro em modelos de banho de órgão isolado utilizando músculo liso longitudinal do íleo de cobaia, técnica bem estabelecida e largamente utilizada.
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Investigar a atividade muscarínica do veneno bruto, bem como de suas respectivas frações semi-purificadas e de uma toxina isolada, da serpente Micrurus lemniscatus, utilizando segmentos de músculo liso longitudinal do íleo de cobaia.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Padronizar a técnica de banho de órgão, com segmentos de músculo liso longitudinal do íleo de cobaia no Laboratório de Venenos e Toxinas Animais do Departamento de Bioquímica e Imunologia da Universidade Federal de Minas Gerais;
- Investigar uma provável atividade do veneno bruto de Micrurus lemniscatus sob a resposta muscarínica em segmentos de músculo liso longitudinal do íleo de cobaia;
- Selecionar algumas frações semi-purificadas do veneno de Micrurus lemniscatus e investigar sua possível atividade muscarínica em segmentos de músculo liso longitudinal do íleo cobaia;
- Avaliar o potencial de uma ou mais toxinas isoladas para investigar sua possível atividade muscarínica em segmentos de músculo liso longitudinal do íleo cobaia.
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 MATERIAL
4.1.1 Animais experimentais
Os cobaias (Cavia porcellus), machos, com peso entre 300 e 500g, foram fornecidos pela Agronema Agricultura Sustentável (Belo Horizonte, Brasil) e acondicionados em uma sala do Departamento de Bioquímica e Imunologia no bloco F2 do Instituto de Ciências Biológicas (UFMG - Belo Horizonte). Os cobaias foram mantidos em caixas de plástico 120 x 60 x 60 cm em grupos de 4 animais, com forragem de maravalha, controle adequado de luz (6:00 às 18:00 horas), temperatura (22 a 24 ºC) e higiene por um período de 7 dias, para ambientação; com total acesso à água, à ração e capim (com finalidade de suprir a vitamina C aos animais).
Doze horas antes da realização dos experimentos (adaptado de DANIEL el al., 2001), os cobaias foram submetidas à restrição alimentar com livre acesso à água. O jejum é necessário para que o intestino mantenha-se o mais vazio possível, de forma a minimizar as manipulações durante a lavagem intraluminal e consequentes lesões ao tecido de interesse, assim como diminuir a motilidade espontânea ocasionada pela presença do bolo fecal, o que dificultaria a estabilidade da preparação.
Todos os protocolos experimentais foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade Federal de Minas Gerais (Processo nº CETEA 367/2012) (Anexo A).
4.1.2 Obtenção do veneno bruto, frações semi-purificadas e toxina isolada
O pool de veneno, liofilizado, das serpentes da espécie Micrurus lemniscatus foi gentilmente cedido pela Fundação Ezequiel Dias (FUNED, Belo Horizonte, Brasil), fracionado por técnicas de HPLC e as massas moleculares determinadas por espectrometria de massas, sendo ambas as técnicas realizadas pela doutoranda Micheline Donato (Anexo B).
4.1.3 Reagentes e drogas
A maioria dos reagentes utilizados foi de grau analítico. Lista de reagentes:
Ácido clorídrico (HCl) : Quimex
Albumina de soro bovino: Sigma-Aldrich Bicarbonato de sódio (NaHCO3): Vetec Carbonato de sódio (Na2CO3): Quimex
Cloreto de cálcio bi-hidratado (CaCl2.2H2O): Isofar Cloreto de magnésio (MgCl2): Merck
Cloreto de potássio (KCl): Reagen Quimibrás Cloreto de sódio (NaCl): Isofar
D-glicose: Sigma-Aldrich
Dimetilsufóxido (DMSO): Sigma-Aldrich Fosfato diácido de potássio (KH2PO4): Reagen Hidróxido de sódio (NaOH): Vetec
Reagente de Folin: Laborclin Sulfato de cobre (CuSO4): Merck
Sulfato de magnésio hepta-hidratado (MgSO4.7H2O): Vetec Tartarato de sódio e potássio anidro: J.T.Baker
Lista de drogas:
1,1-Dimetil-4-difenilacetoxipiperidinio iodado (4-DAMP): Sigma-Aldrich Atropina: Sigma-Aldrich
Cloridrato de carbamilcolina (Carbacol - CCh): Sigma-Aldrich Metoctramina hidratada: Sigma-Aldrich
4.1.4 Soluções
Foi utilizada como solução nutritiva o Krebs-Ringer-Henseleit (KRH) (Tabela 3) aerado com mistura carbogênica (95% de O2 e 5% de CO2), pH 7,4 ajustado com HCl 6 N. Além da solução de uso, preparada apenas no dia do experimento, foram produzidas soluções estoques 20x mais concentradas que as de uso. Todas as soluções foram armazenadas à 4º C.
Tabela 3. Concentração dos reagentes na solução de Krebs-Ringer-Henseleit (KRH)
Reagente Solução de uso Soluções 20x
Concentração (mM) NaCl 118,4 A KCl 4,7 KH2PO4 1,2 B MgSO4.7H2O 1,2 C NaHCO3 25 D CaCl2.2H2O 2,5 E D-glicose 11,1 *
*Não foram preparadas soluções de D-glicose. O reagente era adicionado somente na solução de uso, assim evitando o desenvolvimento de fungos.
4.1.5 Equipamentos
AD Instruments - Power lab 8/30, modelo ML 870 Balança Analítica SHIMADZU, modelo AY220
Balança Semi-Analítica SHIMADZU, série BL-320H Banho Maria Dubnoff Microprocessado, modelo Q226M2 Micro Aspirador Nevoni, modelo 5005
Muscle Strip Myograph System, modelo 820Ms Thermo Scientific Varioskan Flash Multimode Reader