III‐ Analyses taxonomiques et fonctionnelles du microbiote intestinal des souris receveuses
A. Comparaison du microbiote fécal avant et après le transfert pour chaque groupe de souris receveuses transfert pour chaque groupe de souris receveuses
Figure 32: Analyses histologiques de l’iléon des souris receveuses en coloration Hématoxyline/Eosine (HE).
Deux groupes de 6 souris mâles ont reçu par gavage le microbiote caecal de souris minces nourries avec un régime normal (groupe Conv + LM en rouge) ou le microbiote caecal de souris obèses/diabétiques nourries avec un régime hyperlipidique (groupe Conv + OM(HFD) en vert). Le groupe de 6 souris contrôles a reçu du PBS anaérobie par gavage (groupe Conv + PBS en bleu). Coupes histologiques représentatives de l’iléon des 3 groupes de souris receveuses colorées à l’hématoxyline/éosine.
III‐ Analyses taxonomiques et fonctionnelles du
microbiote intestinal des souris receveuses
Lors de ma thèse nous avons voulu déterminer si les modifications du métabolisme hépatique des souris transplantées étaient associées à des modifications du microbiote intestinal. Pour cela, nous avons procédé à 2 types de comparaison. Pour chaque groupe, nous avons comparé les bactéries intestinales présentes dans les fèces des souris receveuses avant et après le transfert de microbiote. Cette analyse nous a permis d’évaluer l’impact du transplant sur le microbiote des souris receveuses. Ensuite, nous avons également comparé le microbiote présent dans les 3 groupes de souris avant et après le transfert caecal afin d’apprécier les différences entre les groupes de souris au même instant.
A. Comparaison du microbiote fécal avant et après le
transfert pour chaque groupe de souris receveuses
Afin de mieux comprendre l’impact du transfert du microbiote intestinal de souris minces (LM) et de souris obèses/diabétiques nourries pendant 3 mois avec un régime hyperlipidique (OM(HFD)) sur la composition du microbiote intestinal des souris receveuses, nous avons comparé le microbiote présent dans les fèces avant et après le transfert caecal. Nous avons d’abord procédé à une analyse en coordonnées principales (PCoA) afin de répartir dans un espace à 2 dimensions chaque souris uniquement en fonction de leur microbiote. Chaque
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souris est représentée par un point sur la figure et plus le microbiote d’une souris est différent de celui d’une autre souris plus ces souris sont éloignées sur le graphique.
L’analyse en coordonnées principales du microbiote intestinal des souris non transplantées Conv + PBS a mis en évidence une séparation des souris entre les conditions basale et Trans NC. Ces résultats laissent penser que malgré l’absence de transfert de microbiote dans ce groupe, le microbiote présent avant et après le gavage au PBS réduit comporte des différences (Fig. 33, A). Ces résultats sont retrouvés chez les groupes de souris Conv + LM et Conv + OM(HFD) (Fig. 33, B, C). Afin de quantifier les variations de microbiote pour chaque souris nous avons calculé pour chaque espèce bactérienne la variation d’abondance entre avant (condition basale) et après le transfert caecal (condition Trans NC) et nous avons fait la somme de toutes ces variations. Ce calcul nous a permis de mettre en évidence que le microbiote des souris transplantées avec le microbiote LM ou OM(HFD) variait significativement plus que le microbiote des souris non transplantées (Fig. 33, D). De manière générale, nous pouvons conclure que le microbiote des souris Conv + PBS semble varier au cours du temps malgré l’absence de transfert de microbiote. Néanmoins, la variation dans la composition du microbiote des souris receveuses apparaît comme significativement plus importante lorsque les souris reçoivent le microbiote des souris donneuses.
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Figure 33: Analyse des modifications du microbiote fécal prélevé avant et après le transfert de microbiote pour les trois groupes de souris Conv + PBS, Conv + LM et Conv +OM(HFD) lors du protocole #1.
Deux groupes de 6 souris mâles ont reçu par gavage le microbiote caecal de souris minces nourries avec un régime normal (groupe Conv + LM) ou le microbiote caecal de souris obèses/diabétiques nourries avec un régime hyperlipidique (groupe Conv + OM(HFD)). Le groupe de 6 souris contrôles a reçu du PBS anaérobie par gavage (groupe Conv + PBS). L’ensemble des résultats présentés sur la figure a été généré à partir des données obtenues par pyroséquençage du microbiote fécal prélevé en condition basale (avant le transfert caecal) et Trans NC (3 semaines après le transfert caecal). (A) Analyse en coordonnées principales (PCoA) du profil du microbiote intestinal des souris Conv + PBS avant et après le transfert de microbiote. L’analyse en coordonnées principales permet d’apprécier ici la distribution spatiale des différentes souris sur un graphique à 2 dimensions. Chaque point de couleur rouge ou vert représente une souris. Chaque souris apparaît 2 fois sur le graphique (un point rouge pour la condition basale (B) et un point vert pour la condition 3 semaines après le transfert caecal (Trans NC). Plus les souris sont éloignées l’une de l’autre sur le graphique moins leur microbiote présente des similitudes. Le logiciel ne tient pas compte du groupe d’appartenance de la souris pour faire l’analyse, les couleurs et les cercles sont positionnés après l’analyse. (B) Analyse en coordonnées principales (PCoA) du profil du microbiote intestinal des souris Conv + LM avant et après le transfert de microbiote. (C) Analyse en coordonnées principales (PCoA) du profil du microbiote intestinal des souris Conv + OM(HFD) avant et après le transfert de microbiote. (D) Index relatif quantifiant le degré de variabilité du microbiote intestinal entre la condition basale et Trans NC pour les 3 groupes de souris. Les résultats ont été exprimés en valeurs moyennes ± l’écart standard à la moyenne (S.E.M). *p<0.05, ***p<0.001 au test one‐way ANOVA avec un post‐test de Dunnett. Les groupes traités ont été comparés au groupe Conv + PBS.
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Par la suite, nous nous somme focalisés sur les noms des espèces bactériennes significativement modifiées entre la condition basale et Trans NC pour les 3 groupes d’études. Pour les 3 groupes de souris plusieurs dizaines de groupes bactériens ont été identifiés comme significativement modifiés entre la condition basale et Trans NC (Fig. 34, 35 et 36). Ces résultats confirment la distribution spatiale des souris observée lors de l’analyse en coordonnées principales (Fig. 33, A‐C). En outre, parmi tous ces groupes bactériens modifiés, nous avons observé une augmentation significative du genre bactérien Allobaculum chez les souris Conv + OM(HFD) (Fig. 36, r). Figure 34: Groupes bactériens significativement différents entre le microbiote des souris Conv + PBS en condition basale et Trans NC lors du protocole #1. La représentation en Cladogramme a été générée à partir des données obtenues par pyroséquençage sur le logiciel LEfSe. Le rond jaune au centre du graphique représente le règne des bactéries. Ensuite ce graphique est constitué de 5 cercles excentriques successifs sur lesquels sont disposés des ronds. Chaque cercle représente un niveau de classification taxonomique (du centre vers l’extrémité : phylum, classe, ordre, famille et genre) et chaque rond représente soit un phylum, une classe, un ordre, une famille ou un genre différente en fonction du cercle sur lequel il se trouve. Par exemple, chaque rond disposé sur le cercle des phyla représente un phylum différent. Les ronds surlignés en vert correspondent à des groupes bactériens dont la proportion relative est significativement augmentée en condition Trans NC comparativement à la condition basale (B). Les ronds surlignés en rouge correspondent à des groupes bactériens dont la proportion relative est significativement augmentée en condition basale comparativement à la condition Trans NC. Les prélèvements en condition basale et Trans NC ont été effectués chez les mêmes souris du groupe Conv + PBS (n=6).
115 Figure 35: Groupes bactériens significativement différents entre le microbiote des souris Conv + LM en condition basale et Trans NC lors du protocole #1. La représentation en Cladogramme a été générée à partir des données obtenues par pyroséquençage sur le logiciel LEfSe. Le rond jaune au centre du graphique représente le règne des bactéries. Ensuite ce graphique est constitué de 5 cercles excentriques successifs sur lesquels sont disposés des ronds. Chaque cercle représente un niveau de classification taxonomique (du centre vers l’extrémité : phylum, classe, ordre, famille et genre) et chaque rond représente soit un phylum, une classe, un ordre, une famille ou un genre différente en fonction du cercle sur lequel il se trouve. Par exemple, chaque rond disposé sur le cercle des phyla représente un phylum différent. Les ronds surlignés en vert correspondent à des groupes bactériens dont la proportion relative est significativement augmentée en condition Trans NC comparativement à la condition basale (B). Les ronds surlignés en rouge correspondent à des groupes bactériens dont la proportion relative est significativement augmentée en condition basale comparativement à la condition Trans NC. Les prélèvements en condition basale et Trans NC ont été effectués chez les mêmes souris du groupe Conv + LM (n=6).
116 Figure 36: Groupes bactériens significativement différents entre le microbiote des souris Conv + OM(HFD) en condition basale et Trans NC lors du protocole #1. La représentation en Cladogramme a été générée à partir des données obtenues par pyroséquençage sur le logiciel LEfSe. Le rond jaune au centre du graphique représente le règne des bactéries. Ensuite ce graphique est constitué de 5 cercles excentriques successifs sur lesquels sont disposés des ronds. Chaque cercle représente un niveau de classification taxonomique (du centre vers l’extrémité : phylum, classe, ordre, famille et genre) et chaque rond représente soit un phylum, une classe, un ordre, une famille ou un genre différente en fonction du cercle sur lequel il se trouve. Par exemple, chaque rond disposé sur le cercle des phyla représente un phylum différent. Les ronds surlignés en vert correspondent à des groupes bactériens dont la proportion relative est significativement augmentée en condition Trans NC comparativement à la condition basale (B). Les ronds surlignés en rouge correspondent à des groupes bactériens dont la proportion relative est significativement augmentée en condition basale comparativement à la condition Trans NC. Les prélèvements en condition basale et Trans NC ont été effectués chez les mêmes souris du groupe Conv + OM(HFD) (n=6). Enfin, l’analyse PICRUSt des données de séquençage bactérien nous a permis de mettre en évidence les différentes voies métaboliques modifiées dans le microbiote des 3 groupes de souris. Nous avons pu mettre en évidence 3 fonctions significativement modifiées entre les conditions basale et Trans NC pour les groupes Conv + PBS et Conv + LM (Fig. 37, A‐B). Pour le groupe Conv + OM(HFD), 20 voies métaboliques ont été significativement modulées (Fig. 37, C), ce qui suggère que le transfert d’un microbiote des souris OM(HFD) a induit des modifications fonctionnelles du microbiote plus importantes que le transfert d’un microbiote issu de souris mince (LM).
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Figure 37 (A et B): Analyses prédictives des fonctions microbiennes significativement modifiées avant et après le transfert de microbiote chez les souris Conv +PBS et Conv + LM lors du protocole #1.
Deux groupes de 6 souris mâles ont reçu par gavage le microbiote caecal de souris minces nourries avec un régime normal (groupe Conv + LM) ou le microbiote caecal de souris obèses/diabétiques nourries avec un régime hyperlipidique (groupe Conv + OM(HFD)). Le groupe de 6 souris contrôles a reçu du PBS anaérobie par gavage (groupe Conv + PBS). L’ensemble des résultats présentés sur la figure a été généré à partir des données obtenues par le pyroséquençage du microbiote fécal prélevé en condition basale (avant le transfert caecal) et Trans NC (3 semaines après le transfert caecal). Une analyse prédictive des fonctions bactériennes potentiellement modifiées entre la condition basale (avant le transfert caecal) et Trans NC (après le transfert caecal) a été effectué par le logiciel PICRUSt. (A) Fonctions bactériennes significativement modulées chez le groupe Conv + PBS et représentation en analyse en composantes principales (PCA) de la distribution des souris dans l’espace, en fonction des modifications des voies métaboliques bactériennes obtenues par PICRUSt. (B) Représentations similaires des données PICRUSt pour le groupe Conv + LM.
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Figure 37 (C): Analyses prédictives des fonctions microbiennes significativement modifiées entre avant et après le transfert de microbiote chez le groupe Conv +OM(HFD) lors du protocole #1. (C) Fonctions bactériennes significativement modulées chez le groupe Conv + OM(HFD) entre des conditions basale et Trans NC et représentation en analyse en composantes principales (PCA) de la distribution des souris dans l’espace en fonction des modifications des voies métaboliques bactériennes obtenues par PICRUSt.
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