I‐ Effet du transfert du microbiote issu de souris obèses et minces sur le métabolisme des souris
C. Analyses du métabolisme glucidique des souris receveuses
C. Analyses du métabolisme glucidique des souris receveuses
La mesure de la glycémie à jeun est la méthode de référence communément utilisée pour diagnostiquer le diabète de type 2 et pour investiguer l’homéostasie glucidique. Trois semaines après le deuxième gavage, nous avons mesuré une glycémie à jeun significativement plus faible chez le groupe de souris Conv + OM(HFD) comparativement au groupe de souris Conv + PBS (Fig. 26, A). A l’inverse, la glycémie des souris Conv + LM n’a pas été modifiée comparativement aux souris contrôles Conv + PBS (Fig. 26, A). Comme nous l’avons vu dans l’introduction, la glycémie est le reflet de l’équilibre entre l’entrée et la sortie du glucose du sang. Afin de mesurer, la capacité des souris transplantées à utiliser le glucose sanguin, nous avons effectué un test de tolérance oral au glucose (Fig. 26, B). L’hyperglycémie induite par le gavage de glucose a été gérée de manière équivalente chez toutes les souris et aucune intolérance au glucose n’a été observée. Nous avons alors voulu déterminer le flux entrant du glucose dans le sang. Lors du jeûne, l’absorption intestinale de glucose est nulle et l’entrée du glucose dans le sang est principalement assurée par le foie. Nous avons donc mesuré les stocks de glycogène hépatique chez les souris transplantées et nous n’avons pas mis en évidence des différences significatives (Fig. 26, C). Cependant, nous avons observé une conversion du pyruvate en glucose significativement plus faible entre les souris Conv + OM(HFD) et les souris Conv + PBS traduisant une baisse probable de la néoglucogenèse hépatique (Fig. 26, D). Le glucagon étant l’hormone majoritairement impliquée dans l’induction de la néoglucogenèse hépatique, nous avons mesuré l’état d’activation de la PKA dans le foie, une kinase activée dans la voie de signalisation en aval du récepteur au glucagon. L’état de phosphorylation des substrats de la PKA n’a pas été modifié entre les 3 groupes de souris suggérant une absence de modifications dans la voie de signalisation du glucagon (Fig. 26, E). Par ailleurs, aucune modification d’expression des enzymes clefs de la néoglucogenèse hépatique PEPCK et G6Pase n’a été observée que ce soit par microarray (résultats non présentés), par PCR (résultats non présentés) ou par western blot (Fig. 26, F). Néanmoins, nous avons mesuré une diminution significative de l’activité de la PEPCK dans le foie des souris Conv + OM(HFD) comparativement au groupe de souris non transplantées (Fig. 26, G). L’activité de la G6Pase n’a pas été modifiée chez les 2 groupes de souris transplantées (Fig. 26, H). D’autre part, l’analyse métabolomique du plasma a permis de mettre en évidence une augmentation de la concentration de lactate et de pyruvate dans le sang des souris Conv + OM(HFD) (Fig. 27 A‐C). L’augmentation des précurseurs néoglucogéniques dans le sang des souris Conv + OM(HFD) peut traduire une diminution de leur conversion en glucose par le foie.L’ensemble des résultats détaillés en figure 26 et 27 suggère que le transfert d’un microbiote OM(HFD) chez des souris conventionnelles induit une baisse de la glycémie à jeun probablement due à une baisse de la néoglucogenèse hépatique chez les souris transplantées. Ces résultats n’ont pas été retrouvés chez les souris ayant reçu un microbiote issu de souris minces (groupe Conv + LM).
104 β‐actine Substrats de la PKA β‐actine PEPCK β‐actine GP6ase
Figure 26:
Impact du transfert de microbiote sur le métabolisme hépatique des souris receveuses.
Deux groupes de 6 souris mâles ont reçu par gavage le microbiote caecal de souris minces nourries avec un régime normal (groupe Conv + LM en rouge) ou le microbiote caecal de souris obèses/diabétiques nourries avec un régime hyperlipidique (groupe Conv + OM(HFD) en vert). Le groupe de 6 souris contrôles a reçu du PBS anaérobie par gavage (groupe Conv + PBS en bleu). L’ensemble des analyses présentées sur la figure a été effectué après 6 heures de jeûne. (A) Glycémie. (B) Test de Tolérance Oral au Glucose (OGTT). (C) Contenu hépatique en glycogène. (D) Test de Tolérance Intra‐Péritonéal au Pyruvate (IPPTT). (E) Analyse western blot de la phosphorylation des substrats de la PKA sur un extrait protéique de foie. L’intensité des bandes a été quantifiée et normalisée sur la β‐actine (témoin de chargement du gel). (F) Quantification par western blot de la quantité de PEPCK et de G6Pase normalisée sur la quantité de β‐actine. Activités enzymatiques de (G) la PEPCK et de (H) la G6Pase. Les résultats ont été exprimés en valeurs moyennes ± l’écart standard à la moyenne (S.E.M). *p<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001, (A) Test t de student, (D) two‐way ANOVA et post‐test de Sidak, les groupes traités ont été comparés au groupe contrôle Conv + PBS, (G) one‐ way ANOVA et post‐test de Dunnett, les groupes traités ont été comparés au groupe contrôle Conv + PBS.
105 Figure 27: Analyses métabolomiques du plasma des souris receveuses. Deux groupes de 6 souris mâles ont reçu par gavage le microbiote caecal de souris minces nourries avec un régime normal (groupe Conv + LM en rouge) ou le microbiote caecal de souris obèses/diabétiques nourries avec un régime hyperlipidique (groupe Conv + OM(HFD) en vert). Le groupe de 6 souris contrôles a reçu du PBS anaérobie par gavage (groupe Conv + PBS en bleu). Trois semaines après le transfert caecal 50 µL de plasma de chaque souris ont été regroupés et le métabolome a été analysé sur le mélange de plasma. (A) Analyse du métabolome plasmatique 3 semaines après le transfert de microbiote (B) lactate plasmatique et (C) pyruvate plasmatique.
Dans l’optique de mieux comprendre les modifications du métabolisme hépatique des souris receveuses nous avons effectué une analyse d’expression génique par microarray sur le
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foie. Cette analyse a permis de mettre en évidence l’ensemble des gènes différentiellement exprimés entre les groupes de souris Conv + OM(HFD) et Conv + PBS et entre les groupes Conv + LM et Conv + PBS. Quels que soit les groupes, parmi la totalité des gènes significativement modulés, aucun n’a été identifié comme étant directement impliqué dans la néoglucogenèse hépatique. Ces résultats suggèrent que la diminution des marqueurs de la néoglucogenèse hépatique observés en Figure 25 n’est pas due à des modifications d’expression génique des gènes impliqués dans cette voie. Au vue de ces résultats, nous avons procédé à une analyse sans apriori des données du microarray. Nous avons utilisé le logiciel STRING afin de déterminer toutes les associations fonctionnelles existantes entre l’ensemble des gènes significativement modulé entre les groupes de souris Conv + OM(HFD) et Conv + PBS et entre les groupes Conv + LM et Conv + PBS. Cette analyse, nous a permis de mettre en évidence une diminution significative de l’expression des enzymes impliquées dans la lipogenèse de novo entre le groupes de souris Conv + OM(HFD) et Conv + PBS (Fig. 28, A, B). Au contraire, l’analyse STRING des gènes significativement modulés entre les groupes Conv + LM et Conv + PBS n’a pas révélé de voies métaboliques modulées (résultats non présentés).
Figure 28: Analyses du transcriptome hépatique des souris receveuses.
Un groupe de 6 souris mâles a reçu le microbiote caecal de souris obèses/diabétiques nourries avec un régime hyperlipidique (groupe Conv + OM(HFD)). Le groupe de 6 souris contrôles a reçu du PBS anaérobie par gavage (groupe Conv + PBS). Les souris ont été sacrifiées 3 semaines après le transfert de microbiote après 6 heures de jeûne et l’expression des gènes hépatiques a été analysée par microarray. L’ensemble des gènes significativement modulés entre le groupe Conv + OM(HFD) et Conv + PBS ont été analysés par le logiciel STRING. (A) Réseau de gènes interconnectés et impliqués dans le métabolisme hépatique identifiés par STRING. (B) Schéma de la lipogenèse de
novo chez les souris Conv+ OM(HFD). Les analyses statistiques ont été effectuées en comparant l’expression relative
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