Chapitre 2 : Étude du transcriptome de cellules mononucléées périphériques sanguines

L’augmentation du nombre de triplets CAG au sein du gène ATXN2 a longtemps été définie comme responsable de l’ataxie spinocérébelleuse de type 2 (patients SCA2c). Cependant elles sont également liées à la MP (patients SCA2p) et responsables d’un risque augmenté de développer la sclérose latérale amyotrophIque (SLA), une maladie connue pour être associée à des perturbations de l’épissage. Physiologiquement compris entre 13 et 31, le nombre de répétitions oscille entre 27 et 33 chez les patients SCA2p et ceux atteints de SLA et augmente jusqu’à atteindre au maximum 200 répétitions chez les patients SCA2c. Alors que leur taille et leur structure ont été étudiées et diffèrent entre les SCA2c et les SCA2p, le mécanisme par lequel ces mutations conduisent à des phénotypes différents n’a pas encore été élucidé.

ATXN2 code la protéine ataxine-2, principalement connue pour son rôle dans le métabolisme

des ARNs. L’une des premières fonctions qui lui a été attribuée est un rôle dans l’épissage des ARNs du fait de son interaction avec les facteurs d’épissage RBM9, RBPMS, TDP-43 et FUS et parce qu’elle possède en N-terminal un domaine Lsm/Lsm-AD caractéristique de ces facteurs. Elle possède également un domaine PAM2 en C-terminal qui lui permet d’interagir avec la protéine PABPC1 (polyA Binding Protein Cytoplasmic 1), une protéine impliquée dans la dégradation des ARNs par le nonsense-mediated decay (NMD), les granules de stress et la traduction. D’autres fonctions notamment dans le métabolisme calcique et lipidique lui ont été attribuées mais ont été rarement évoquées. Pour tenter de comprendre pourquoi les sujets SCA2c et SCA2p présentent des phénotypes différents, nous avons émis l’hypothèse que les différences au niveau des répétitions de triplets pouvaient soit altérer la même fonction de l’ataxine-2 mais dans des sens différents (activation d’un côté, inhibition de l’autre par exemple) ou au contraire agir au niveau de fonctions différentes de la protéine. Etant donné le rôle de l’ataxine-2 dans le métabolisme des ARNs et notre intérêt pour l’épissage, nos résultats sont orientés vers l’analyse de ce métabolisme, ce qui n’exclue pas la possibilité que d’autres fonctions de l’ataxine-2 méritent notre attention.

Ainsi, afin d’apporter des éléments de réponse concernant les mécanismes perturbés en réponse à des mutations de l’ATXN2, nous avons effectué une analyse du transcriptome de cellules mononucléées périphériques sanguines de 7 sujets SCA2p, 6 sujets SCA2c, 7 parkinsoniens sporadiques sans mutation et 13 sujets témoins. Par l’utilisation de puces d’expression, nous avons observé les profils d’expression de chaque groupe de sujets et identifié les variations d’expression de gènes entre les malades et les témoins. De façon similaire à l’analyse présentée dans le chapitre 1, l’étude des voies canoniques a été effectuée à l’aide du logiciel IPA®. En complément de cet outil,

99 nous avons utilisé les logiciels GSEA (http://www.broadinstitute.org/gsea/index.jsp) et Toppgene (https://toppgene.cchmc.org/) qui nous ont respectivement permis d’identifier les processus biologiques dans lesquels ces gènes étaient impliqués et de déterminer dans quel aspect du métabolisme des ARNs ces gènes intervenaient. Récemment Yokoshi et al. ont montré que l’ataxine-2 interagissait avec la région 3’non traduite des ARNm pour réguler leur stabilité et ont cherché à savoir si ce rôle était lié à son interaction avec PABPC1. Ainsi, en éliminant ou non le domaine PAM2 de l’ataxine-2, ils ont observé que certains ARNm se fixaient à l’ataxine-2 de manière spécifiquement dépendante de son interaction avec PABPC1 alors que d’autres ne se fixaient qu’en absence de la liaison avec ce partenaire. Nous avons donc soumis à Webgelstat (http://bioinfo.vanderbilt.edu/webgestalt/) les listes de gènes appartenant aux 2 catégories de cibles de l’ataxine-2 identifiées par Yokoshi et al. (dépendantes ou non de la liaison avec PABPC1) pour identifier les voies KEGG (interactions moléculaires) associées. Ces voies ont ensuite été comparées à nos données d’analyse de voie IPA afin d’évaluer si les variations d’expression génique observées sur nos puces d’expression pouvaient être dépendante de PABPC1. Enfin, nous avons recherché la variation d’expression de gènes d’intérêt identifiés d’après nos données, dans des données de puces d’expression obtenues à partir d’échantillons de SNpc de parkinsoniens versus des témoins.

Notre analyse des voies et processus biologiques liés aux gènes différentiellement exprimés entre les malades et les témoins a mis en évidence aussi bien des modifications spécifiques à chaque groupe que des dérèglements communs. Elle a mis en évidence des voies communes entre les entre les parkinsoniens sporadiques et les patients SCA2p telles que la voie de signalisation de l’infiltration leucocytaire, les voies de survie cellulaire, l’inflammation et du cytosquelette, en accord avec leurs similitudes phénotypiques. Les variations d’expression des gènes ALAS2, HBD, HDM et SELENBP1 déjà identifiées chez les patients parkinsoniens au cours d’une de nos précédentes études sont également retrouvées chez les patients parkinsoniens sporadiques et les patients SCA2p de cette analyse. De façon intéressante, nous avons observé des changements d’expression de gènes de la voie de signalisation de la SLA chez l’ensemble des parkinsoniens mais pas chez les sujets SCA2c. Connaissant l’importance des perturbations du métabolisme des ARNs dans la SLA, nous avons supposé que l’identification de cette voie pouvait évoquer un lien entre le métabolisme des ARNs et la MP. Cette modification de la voie de la SLA est également présent dans l’analyse des voies KEGG des gènes ciblés par l’ataxine-2, uniquement lorsque celle-ci peut interagit avec PABPC1. PABPC1 permettant de discriminer entre les ARNm cibles de l’ataxine-2, il se pourrait que des mécanismes dépendants de cette protéine permettent de séparer les parkinsoniens (SCA2p et sporadiques) des SCA2c.

100 Étant donné le rôle de PABCP1 dans le métabolisme des ARNs, nous avons recherché si des perturbations de ce métabolisme étaient présentes chez les différents groupes de malades. L’analyse par GSEA des processus biologiques impactés par les variations d’expression génique a confirmé l’existence de dérèglements du métabolisme des ARNs chez les patients SCA2c, les patients SCA2p et les parkinsoniens sporadiques, soutenant l’hypothèse que les différentes mutations de l’ataxine-2 joue sur son rôle dans le métabolisme des ARNs mais de façon différente. L’analyse détaillée des différents aspects du métabolisme des ARNs effectuée via Toppgene a permis de révéler que les processus du métabolisme des ARNs perturbés dans les différents groupes de malades impliquait préférentiellement des aspects en lien avec la queue polyA des ARNm aussi bien chez les sujets SCA2c, les sujets SCA2p et les sporadiques. De façon intéressante, la comparaison des gènes du métabolisme des ARNs dérégulés dans chaque groupe, a montré une plus grande similitude entre les gènes dérégulés chez les parkinsoniens SCA2p et les cas sporadiques par rapport aux autres comparaisons (SCA2c versus sporadiques et SCA2c versus SCA2p). Ces résultats suggéraient que bien que le métabolisme des ARNs soit perturbé chez l’ensemble des malades les gènes impliqués dans ces perturbations seraient spécifiques du phénotype.

Nous avons donc sélectionné des gènes liés au métabolisme des ARNs dont l’expression varie uniquement chez les parkinsoniens (SCA2p et sporadiques) ou uniquement chez les SCA2c afin de tester si les modifications du métabolisme des ARNs impliquant ces gènes, étaient spécifiques d’un phénotype donné. La sous-expression des gènes hnRNPA3, hnRNPUL1 et MBNL1 observée uniquement dans les données de puces de sujets SCA2c a été confirmée par RT-qPCR avec une diminution significative (p<0,05) de 35%, 21% et 40% respectivement. La sous-expression de MBNL1 a également été observée dans les données de RT-qPCR de sporadiques versus témoins bien qu’elle n’ait pas été observée sur les données de puces correspondantes à ces sujets. Le gène PABPC4, un paralogue de PABCP1, est quant à lui significativement dérégulés chez les parkinsoniens sporadiques à la fois sur les données de puces et dans les résultats de RT-qPCR. En montrant des variations quantitatives spécifiques des sujets SCA2p et des SCA2c, ces résultats étayent l’hypothèse que les mutations de l’ATXN2 induisent des modifications des mêmes processus mais de façon différente et le fait que les gènes dérégulés chez les malades SCA2p se retrouvent dérégulés de la même manière chez les cas sporadiques suggèrent que ces perturbations puissent être liées à l’émergence d’un phénotype parkinsonien. Du fait de son rôle dans la MP, nous avons également quantifié l’expression de SNCA chez les cas sporadiques, les patients SCA2p et les SCA2c ce qui a révélé une sous-expression qui tend à être significative chez les sujets SCA2p et les sporadiques corrobant la diminution observée sur les puces de ces mêmes sujets.

101 L’ensemble de ces données suggèrent que des perturbations du métabolisme des ARNs sont communes à l’ensemble des sujets étudiés mais que celles-ci impliqueraient des gènes spécifiques selon le phénotype des malades. De façon intéressante, nous avons observé la variation d’expression de PABPC4 et de SNCA chez les parkinsoniens sporadiques. Sachant que PABPC4 est un paralogue de

PABCP1 appartenant à la famille des protéines PABPs (polyA Binding Protein) et qu’il code une

protéine impliquée dans la dégradation des ARNs, nous pouvons émettre l’hypothèse que des perturbations des mécanismes de dégradation pourraient être à l’origne de la diminution de l’expression de SNCA et qu’ils pourraient être liés à la physiopathologie de la MP. Des études supplémentaires pour investiguer le rôle de protéines PABPs sont nécessaires pour évaluer la pertinence de cette hypothèse.

Article 2: RNA binding disturbances as a continuum from Spinocerebellar ataxia type 2 to