Étude pilote (séquençage Ion Proton™)

3.3.2.2.1. Analyse quantitative de l’expression des gènes

Afin de voir si les perturbations de l’épissage étaient observées dès les premiers stades de la maladie, nous avons fait une nouvelle analyse à partir d’échantillon provenant de sujets à des stades précoces. Six malades et 5 témoins appariés en sexe et en âge ont été séquencés, cette fois-ci avec le séquenceur Ion Proton. Les reads ont été alignés sur le génome Ensembl GRCh37 et leur nombre par échantillon est indiqué dans le tableau ci-dessous (tableau 16).

Sujets 3110149 3110138 3110150 3110147 3110025 Nombre de reads 67 401 669 74 339 599 74 339 599 65 826 035 76 005 259 Sujets 3310250 3310268 3310260 3310245 3310242 3310239 Nombre de reads 87 127 167 57 428 119 70 703 395 66 932 786 78 715 727 77 051 227

Tableau 16: Nombre de reads par sujet, alignés sur le génome humainEnsembl GRCh37

A : Parkinsoniens sporadiques (stade précoce); B : Sujets contrôles

L’analyse des données a été effectuée selon le même procédé que celui employé lors de l’étude de faisabilité. Nous avons ainsi observé la variation d’expression de 437 gènes (p<0.05) associés aux processus cellulaires indiqués ci-dessous (Tableau 17).

A

162

Processus biologiques FDR q-value

Transduction du signal 1,81E-10

Développement des organismes multicellulaires 4,57E-10 Régulation des processus métaboliques cellulaires 8,65E-06

Régulation des processus métaboliques 8,81E-06

Régulation négative des processus biologiques 3,78E-05 Régulation des processus métaboliques des acides nucléiques et nucléobase

nucleoside nucleotide ^4,10E-05

Régulation négative des processus cellulaires 6,25E-05

Régulation de l’expression génique 9,86E-05

Transcription 1,14E-04

Processus métaboliques des acides nucléiques et nucléobase nucléoside 1,64E-04 Transcription de promoteurs à ARN polymerase II 2,32E-04 Cascade de signalisation intracellulaire 2,66E-04 Régulation de la transcription ADN dépendante 9,62E-04

Processus métaboliques des biopolymères 1,01E-03

Processus de biosynthèse des ARNs 1,55E-03

Transcription ADN dépendante 1,55E-03

Processus du métabolisme des ARNs 2,75E-03

Établissement de la localisation 3,82E-03

Tableau 17: Processus biologiques liés aux gènes dérégulés chez les parkinsoniens à stades précoces (Analyse GSEA ; FDR<0,05)

De façon intéressante, nous avons retrouvé des perturbations de gènes liés au métabolisme de ARNs qui suggérent que des altérations de ces mécanismes surviennent dès les premiers stades de la maladie.

Nous avons donc croisé la liste de gènes différentiellement exprimés entre les malades et les témoins à la liste des 4305 annotations de gènes liés à l’épissage. Les variations quantitatives de l’épissage chez ces patients aux premiers stades de la maladie impliquent les variations d’expression de douze gènes (Tableau 18).

163

Gènes Description Ratio (M/T) p-value

RBMS3 RNA Binding Motif, Single Stranded Interacting Protein 3

-4,78 2,75E-03

PPIL3 Peptidylprolyl Isomerase (Cyclophilin)-Like 3

-2,12 3,00E-04

KHDRBS2 KH Domain Containing, RNA Binding, Signal Transduction Associated 2

-2,01 3,81E-02

RPL9 Ribosomal Protein L9 1,33 4,49E-02

CCDC94 Coiled-Coil Domain Containing 94 1,36 3,74E-02

RPL41 Ribosomal Protein L41 1,37 4,24E-02

SF3B4 Splicing Factor 3b, Subunit 4, 49kDa 1,44 3,90E-02

RPL28 Ribosomal Protein L28 1,70 4,60E-03

RPL23AP7 Ribosomal Protein L23a Pseudogene 7 1,86 2,95E-02 RBFOX3 RNA Binding Protein, Fox-1 Homolog

(C. Elegans) 3

1,96 2,65E-02

LGALS2 Lectin, Galactoside-Binding, Soluble, 2 1,52 9,60E-03 U3 U3 Small Nucleolar Ribonucleoprotein -1,63 2,20E-03

Tableau 18: Douzes facteurs liés à l’épissage dérégulés chez les parkinsoniens (Test de Fisher exact ; p<0,05).

Le ratio M/T représente le rapport des niveaux d’expression du gène considéré dans le groupe des malades par rapport à celui du groupe des témoins

Ces gènes diffèrent de ceux mis en évidence par l’étude pilote. Toutefois, il est important de noter la variation d’expression d’U3, un constituant majeur de la machinerie d’épissage. Il est donc possible que des perturbations au sein même de la machinerie effectrice de l’épissage soit à l’origine d’un grand nombre de modifications de ce processus dans la cellule.

3.3.2.2.2. Analyse quantitative de l’expression des transcrits

Les transcrits différentiellement exprimés ont été analysés et correspondent à 357 gènes (p<0,05). Comme pour les gènes, le nombre de transcrits identifiés est nettement plus faible que ceux identifiés lors de l’étude de faisabilité (1438 gènes et 1306 gènes à transcrits différentiellement exprimés dans l’étude de faisabilité contre 437 gènes dérégulés et 357 gènes à transcrits différentiellement exprimés dans l’étude pilote, paragraphe 3.3.2.2.1.). Contrairement aux précédentes analyses où le premier processus identifié était la « transduction du signal », l’analyse des processus biologiques des transcrits différentiellement exprimés chez les sujets à des stades

164 précoces de la maladie, a montré que le premier processus biologique atteint était le système immunitaire (Tableau 19).

Processus biologiques Nombre de gènes ^FDR

q-value

Réponse immunitaire 12 1,09E-05

Développement des organismes multicellulaires 23 1,96E-05

Processus du système immunitaire 13 2,07E-05

Régulation négative des processus cellulaires 16 2,44E-04

Prolifération cellulaire 14 2,97E-04

Régulation négative des processus biologiques 16 2,97E-04

Transduction du signal 26 3,35E-04

Développement des structures anatomiques 19 7,16E-04

Cascade de signalisation intracellulaire 15 7,45E-04

Régulation de la proliferation cellulaire 10 1,04E-03

Régulation des processus métaboliques de la cellule 16 1,06E-03

Régulation des processus métaboliques 16 1,12E-03

Processus de biosynthèse cellulaire 10 1,12E-03

Réponse à l’hypoxie 4 1,12E-03

Développement cellulaire 13 1,76E-03

Processus métaboliques des biopolymères 24 2,12E-03

Régulation de la transcription des promoteurs à ARN polymérase II 9 2,30E-03 Transcription de promoteurs à ARN polymerase II 11 3,33E-03 Tableau 19: Top 18 des processus biologiques liés aux transcrits dérégulés (Analyse GSEA ; FDR<0,05)

Par ailleurs, les pertubations de la prolifération cellulaire, de la transduction du signal et de la réponse au stress identifiés précédemment, sont également retrouvées à des stades précoces de la maladie (Tableau 17).

Le croisement de la liste des transcrits dérégulés avec la liste des gènes liés à l’épissage montre que 12 gènes liés à l’épissage sont dérégulés entre les malades et les témoins (Tableau 20). Ces transcrits diffèrent également de ceux identifiés par la première analyse.

165

Gènes Description Ratio (M/T) p-value

CCDC94 Coiled-Coil Domain Containing 94 1,37 3,67E-02

EIF4G1 Eukaryotic Translation Initiation Factor 4 Gamma, 1

N.D 7,10E-03

KHDRBS2 KH Domain Containing, RNA Binding, Signal Transduction Associated 2

-2,24 4,70E-02

RPL23AP7 Ribosomal Protein L23a Pseudogene 7 2,42 1,20E-02

RPL28 Ribosomal Protein L28 1,81 4,04E-02

RPL28 Ribosomal Protein L28 2,25 4,24E-02

RPL9 Ribosomal Protein L9 2,01 2,68E-02

RPLP0 Ribosomal Protein, Large, P0 N.D 4,47E-02

RPS11 Ribosomal Protein S11 N.D 7,55E-03

VIM Vimentin N.D 4,40E-03

YBX1 Y Box Binding Protein 1 1,39 1,90E-02

DDX42 DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) Box Helicase 42 N.D 3,72E-02

U3 Small nucleolar RNA U3 8,06 4,46E-02

U3 Small nucleolar RNA U3 -1,62 2,20E-03

Tableau 20: Transcrits de gènes liés à l’épissage (Test de Fisher exact ; p<0,05)

N.D (non déterminé): les ratios d’expression n’ont pas pu être calculés car la valeur de FPKM dans l’un des deux groupes (malades ou témoins) est égale à 0

Bien que l’analyse des processus biologiques n’ait pas fait ressortir de perturbations en lien avec l’épissage, certains transcrits de gènes liés à ce processus sont différentiellement exprimés entre les malades et les témoins. Parmis ces transcrits, nous avons observé la variation d’expression de deux transcrits du gène U3 que l’analyse au niveau génique avait déjà révélé. Les variations des gènes et transcrits liés à l’épissage dans l’analyse de faisabilité nous ont révélé que ces variations quantitatives étaient associées à des changements de compositions en exons des transcrits. Nous avons donc testé si des modifications similaires pouvaient être observées dès les premiers stades de la maladie.

166

3.3.2.2.3. Analyse qualitative de l’épissage : création de nouvelles jonctions entre exons

De même que précédemment, nous nous sommes interrogés sur les conséquences des variations quantitatives de gènes et transcrits liés à l’épissage sur la création de nouvelle jonction. Après analyse des données fournies par cuffcompare (3.3.1.6.2.), nous avons observé la création de 28 transcrits à class code J dérégulés entre les malades et les témoins (p<0,05), soit 28 transcrits potentiellement nouveaux. A noter que la majorité de ces transcrits potentiellement nouveaux correspondent à des gènes impliqués dans l’immunité (Tableau 21) qui semble être perturbée dès les premiers stades de la maladie (Tableau 17).

Gènes Description Ratio (M/T) p-value

AL161772.1 N.A 1,93 1,50E-04

B3GNT7 UDP-GlcNAc:BetaGal Beta-1,3-N-Acetylglucosaminyltransferase 7

-1,86 4,50E-04

IGKV1-12 Immunoglobulin Kappa Variable 1-12 2,463 6,00E-04

FCRL2 Fc Receptor-Like 2 2,17 2,75E-03

VIM Vimentin N.D 4,40E-03

APOBEC3A Apolipoprotein B MRNA Editing Enzyme, Catalytic Polypeptide-Like 3A

-1,58 6,20E-03

CLC Charcot-Leyden Crystal Galectin 1,83 6,75E-03

LGALS2 Lectin, Galactoside-Binding, Soluble, 2 -1,52 9,60E-03

RBKS Ribokinase -2,19 9,70E-03

IGKV1-13 Immunoglobulin Kappa Variable 1-13 (Gene/Pseudogene)

2,49 1,11E-02

IGLC7 Immunoglobulin Lambda Constant 7 1,80 1,98E-02

RP11-106J23.1 N.A 6,50 2,41E-02

PDPR Pyruvate Dehydrogenase Phosphatase Regulatory Subunit

1,41 2,57E-02

CRIP2 Cysteine-Rich Protein 2 2,52 2,69E-02

UTP20 UTP20, Small Subunit (SSU) Processome Component, Homolog (Yeast)

1,74 2,76E-02

RN7SL197P RNA, 7SL, Cytoplasmic 197, Pseudogene -1,47 3,00E-02 DUS1L Dihydrouridine Synthase 1-Like (S. Cerevisiae) 23,48 4,08E-02 CCNB1IP1 Cyclin B1 Interacting Protein 1, E3 Ubiquitin Protein N.D 4,14E-02

167 Ligase

IGKV1-6 Immunoglobulin Kappa Variable 1-6 1,73 4,19E-02

BHLHE40 Basic Helix-Loop-Helix Family, Member E40 -1,54 4,21E-02

GAB2 GRB2-Associated Binding Protein 2 -60,18 4,34E-02

IGHV3-52 Immunoglobulin Heavy Variable 3-52 (Pseudogene) -3,67 4,48E-02

TBC1D27 TBC1 Domain Family, Member 27 1,69 4,58E-02

FCRL5 Fc Receptor-Like 5 2,42 4,77E-02

FTSJ3 FtsJ Homolog 3 (E. Coli) N.D 4,78E-02

DCAF11 DDB1 And CUL4 Associated Factor 11 N.D 4,88E-02

Tableau 21: Vingt-huit transcrits à jonctions nouvelles, dérégulés entre les malades et les témoins (Test de Fisher exact ; p<0,05)

N.A (non assigné) : aucune description n’est fournie pour ce gène dans NCBI. N.D (non déterminé): les ratios d’expression n’ont pas pu être calculés car la valeur de FPKM dans l’un des deux groupes (malades ou témoins) est égale à 0

Dans le document Intérêt du transcriptome de cellules mononucléées périphériques sanguines dans l’étude des mécanismes moléculaires de la maladie de Parkinson (Page 179-185)