Analyse qualitative de l’épissage : création de nouvelles jonctions entre exons

Une nouvelle fois, nos données ont révélé des variations quantitatives de l’expression de facteurs liés à l’épissage. Ceci nous a encouragés à poursuivre dans l’idée que des variations au niveau des jonctions entre exons existaient chez les parkinsoniens. Grâce aux données provenant de Bioscope™, nous avons pu déterminer le nombre de jonctions connues et le nombre de jonctions potentiellement nouvelles détectées dans chaque échantillon. A partir de ces données, nous avons calculé par échantillon, le rapport EA/T correspondant à l’ensemble des épissages alternatifs détectés dans un échantillon (jonctions connues et putatives, EA) par rapport à l’ensemble des jonctions présentes dans le génome de référence (T). Nous avons aussi comptabilisé le nombre de jonctions putatives (P) dans chaque échantillon et calculé le rapport P/T correspondant au rapport des jonctions putatives et de l’ensemble des jonctions présentes dans le gènome. Ces rapports nous ont permis de faire une estimation des différences qu’il pouvait y avoir au niveau des jonctions entre exons entre les malades et les témoins. La moyenne des ratios EA/T des malades par rapport à celles des ratios des témoins montre une tendance à l’augmentation chez les malades (figure 32A). Ceci implique que le nombre d’événements d’épissage réalisés et détectés chez les malades est plus grand que chez les témoins. De façon similaire, la moyenne des ratios P/T des malades est sensiblement plus grande que celle des ratios des témoins suggérant que les variations qualitatives conduisant à la génèse de nouvelles jonctions sont présentes en plus grand nombre chez les malades que chez les témoins (figure 32B).

157 Figure 32 : Moyennes des ratios EA/T et P/T chez les témoins et chez les malades

À gauche: Moyennes des ratios EA/T chez les témoins et les parkinsoniens ; à droite : Moyennes des ratios P/T chez les témoins et les parkinsoniens

Afin de valider la création de nouvelles jonctions entre exons chez les parkinsoniens, nous nous sommes intéréssé à ces jonctions putatives. Bioscope™ fournit des informations sur les différentes jonctions entre exons présentes dans un échantillon auxquelles il attribue une JCV qui témoigne de la confiance que l’on peut accorder en l’existence de la jonction identifiée. Aucun critère n’étant définis pour déterminer quel seuil de JCV (confiance accordée à la jonction identifiée) choisir pour avoir le maximum de confiance en l’existence de ces jonctions, nous avons choisi de considérer l’ensemble des jonctions et de valider l’existence de jonctions d’intérêt par RT-PCR.

Trois mille deux cent seize gènes à jonctions nouvelles ont été identifiés (sans sélection sur la JCV) et croisés avec la liste des 4305 facteurs liés à l’épissage que nous avons générée. Ces jonctions nouvelles sont retrouvées dans 181 gènes de la liste des gènes liés à l’épissage. Nous avons à nouveau retrouvé des variations au niveau de gènes auxquels nous nous étions intéressés auparavant comme le gène ATXN2, PABPC1, et PABPC4. Ayant observé des variations d’expression du

gène et de transcrit d’A2BP1 (facteur jouant sur l’épissage d’ATXN2), il est possible que ces variations

soient à l’origine des modifications de jonctions entre exons de l’ATXN2 bien que cela mérite d’être

vérifié.

Afin de confirmer l’existence de ces jonctions nouvelles, nous en avons sélectionnées certaines d’entre elles à différentes JCV (Tableau 14) que nous avons validées par RT-PCR lorsque la synthèse d’amorces à cheval sur la nouvelle jonction a été possible (Figure 33)

158 Tableau 14: Jonctions nouvelles validées par RT-PCR

Ces jonctions nouvelles correspondent à des épissages de type cassette-exon (paragraphe 1.1.5.1.) avec exclusion de l’exon 16 de RBM5, 10 de CCLN1 et 4 de RPS9. D’après les données Bioscope ces nouvelles jonctions semblent n’être présentes que chez certains sujets car la nouvelle jonction de RBM5 a été détectée uniquement chez la patiente P59/04, celle de CCLN1 uniquement chez les patientes P227/01 et P59/04 et celle de RPS9 n’a été détectée que chez la patiente P227/01.

Figure 33 : Amplicons de RT-PCR après dépôt sur gel d’agarose

Les fragments de séquence contenant la nouvelle jonction identifiée dans le(s) transcrit(s) de RBM5 (A), CCLN1 (B) et RPS9 (C) ont été obtenus après amplification par PCR des ADNc provenant des 3 malades et des 3 témoins de l’analyse de RNAseq n°1. 1 : 3310199 ; 2 : P299/01 ; 3 : P59/04 ; 4 : P227/01 ; 5 : 3310167 ; 6 : 3310199 ; + : Témoin positif ; - : Témoin négatif (H2O) ; MM : marqueur de poids moléculaire

Les résultats de RT-PCR confirment l’existence de ces nouvelles jonctions qui sont étonnement retrouvées chez l’ensemble des sujets. Cependant, les différences d’intensité du signal sur le gel d’agarose suggèrent une différence d’expression de(s) transcrit(s) possédant ces nouvelles jonctions ; ceci sous-réserve que le dépôt sur gel eu été uniforme. Pour tester cette hypothèse, nous avons

Gènes Jonctions nouvelles ^{Sujets possédant la}

nouvelle jonction ^JCV

RBM5 Exons 15-17 P299/01 35,21

CCLN1 Exons 9-11 P227/01 et P59/04 100 et 100

159 effectué des RT-qPCR qui ont révélé une augmentation significative de(s) transcrit(s) de RBM5

possédant la nouvelle jonction ainsi que pour ceux de CCLN1 (figure 34).

Figure 34 : Quantification par RT-qPCR des transcrits de RBM5 et CCNL1

Ces quantifications ont été effectuées sur les ADNc provenant d’un groupe de sujets sélectionnés pour effectuer les validations.*p<0,05 ; **p<0,01 ; Mann et Whitney

La quantification par RT-qPCR de RPS9 n’a pas été faite car les amorces sur la jonction nouvelle ne

remplissaient pas les critères d’utilisation en qPCR (courbe de fusion à pics multiples), ce d’autant que le gel d’agarose n’a pas montré de variations d’intensité notables (figure 31C). Ces résultats suggèrent que les jonctions nouvelles de RBM5 et CCLN1 ne sont pas des jonctions nouvellement

créées chez les parkinsoniens du fait d’un défaut de l’épissage puisqu’elles sont également présentes chez les témoins. Cependant les différences observées en RT-qPCR indiquent qu’il existe des variations de l’épissage de ces 2 gènes qui, chez les malades, accentuent la formation de ces jonctions par rapport à ce qui est observé chez les témoins. Il est toujours possible que, pour d’autres gènes, les variations qualitatives de l’épissage soit un phénomèse de tout ou rien c’est-à-dire conduisant à la création de jonction n’existant que chez un des deux groupes (malades ou témoins).

Afin de voir si les changements au niveau des jonctions entre exons peuvent être responsables de perturbations conduisant à la maladie, nous avons analysé les voies canoniques dans lesquelles étaient impliqués ces gènes à nouvelles jonctions. La liste des 3216 gènes à jonctions nouvelles a été soumise à IPA® ; les voies canoniques identifiées ont été comparées aux voies canoniques révélées par nos analyses antérieures (Tableau 15).

160 Voies canoniques Nouvelles jonctions p-value Sporadiques p-value G2019S LRRK2 p-value ATXN2 p-value Voie de signalisation EIF2 7,94E-13 3,72E-04 2,00E-15

Voie d’ubiquitination des protéines

1,58E-10 4,68E-02 3,39E-04

Voie de régulation d’eiF4 et p70S6K

2,40E-10 4,79E-02 6,31E-07 4,07E-02

Voie Rac 7,76E-09 3,39E-02 2,57E-02

Voie de signalisation PI3K/AKT

3,54E-06 3,80E-02 4,47E-03 1,26E-02

Activation RAR 3,80E-06 1,62E-02 2,82E-03 Super-voie des composés

inositol-phosphates

3,89E-06 2,04E-02 1,51E-02

Voie de signalisation CTLA4 dans les lymphocytes T

cytotoxiques

4,07E-06 1,26E-02 1,70E-02

Voie du cancer de la prostate

8,13E-06 2,51E-03 1,00E-02

Biosynthèse des 3-phosphoinositides

1,29E-05 7,76E-03 4,37E-02

Voie de signalisation des 14-3-3

4,68E-05 1,15E-02 1,41E-02 4,79E-02

Voie de signalisation de la leucémie myéloïde

chronique

1,07E-04 1,78E-02 2,51E-02

Signalisation des céramides

2,09E-03 6,92E-03 4,68E-02

Signalisation des acides docosahexaénoïques

2,75E-03 2,40E-02 4,79E-02 3,39E-02

Signalisation AMPK 3,80E-03 8,32E-05 3,89E-02 Troubles Mitochondriaux 1,48E-02 1,51E-02 1,86E-07

Tableau 15: Voies canoniques communes aux différentes analyses du transcriptome (Analyse IPA ; p<0,05)

Ces nouvelles jonctions sont retrouvées au sein de gènes représentant des voies de signalisation connues dans la physiopathologie de la maladie tels que la dégradation par le système ubiquitine-protéasome « Voie d’ubiquitination des protéines », les voies de survie cellulaire « Voie Rac», « Voie de signalisation PI3K/Akt», « Voie de signalisation des 14-3-3 », « Signalisation AMPK », l’immunité « Voie de signalisation CTLA4 dans les lymphocytes T cytotoxiques » ou encore la mitochondrie. Une fois de plus, nous avons retrouvé des voies communes à celles de nos précédentes analyses et notamment les voies de « régulation de eiF4 et p70S6K » et « signalisation PI3K/Akt » commune à l’ensemble des formes étudiées jusqu’à présent ainsi que la voie de « signalisation EIF2 » qui était la voie commune aux sujets sporadiques et aux parkinsoniens porteurs de la mutation G2019S de

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