Caractérisation de LFY chez la levure

a) Milieux de culture

Les levures poussent comme les bactéries en milieu liquide ou solide, mais à 30°C, et en général pendant 2 jours. La sélection se fait ici en fonction de leur capacité à croître sur un milieu appauvrie : le vecteur qu’elles reçoivent leur permet en général de produire un acide aminé, du tryptophane par exemple, dont la présence n’est donc plus nécessaire dans le milieu de culture.

Milieu complet YPD: 1% [m/v] yeast extract, 2% [m/v] peptone, 2% [m/v] difco bacto agar, 2% [m/v] glucose filtré SM (milieu minimum): 0.17% [m/v] YNB, 0.5% [m/v] NH4SO4, poudra AA (fonction de la prototrophie), 2% [m/v]

glucose ou galacotse filtré + optionnel: 2% agar pour obtenir un milieu solide.

Remarque : dans les cas présentés ici le milieu minimum est UTH- (sans uracile, tryptophane et histidine). On

rajoute alors 0,70g/L de poudre UTH- (BIO 101 Systems, Q-BIOgene).

b) Transformation des levures

Le protocole de transformation des levures est accessible sur le site

http://www.umanitoba.ca/faculties/medicine/units/biochem/gietz/trafo.html (Gietz et al., 1995).

Les levures sont mises en culture dans 2mL de milieu SM jusqu’à saturation. 20µL sont ensuite transférés dans 25mL de milieu SM. A DO600 égale à 1, les levures sont centrifugées pendant 5min à 3000g puis

ressuspendues dans 50mL de milieu préchauffé SM (ou YPD). A DO600 égale à 0,6-0,7, les levures sont de

nouveau centrifugées puis ressuspendues dans 15mL d’eau stérile. 3mL sont répartis dans 5 tubes eppendorf à raison de 2X1,5mL par tube, avec deux centrifugations à 6000rpm. Sont rajoutés successivement au culot de levures 480µL de PEG 3500 (polyethylène glycol) 50%, 72µL d’acétate de lithium 1M pH7.5, 50µL d’ADN simple brin, et 100µL d’eau stérile contenant entre 50ng et 5µg de plasmide. Le culot est ensuite vortexé vigoureusement jusqu’à son entière dissolution,puis incubé 30min à 30°C. Les levures subissent finalement un choc thermique de 15min à 42°C avant d’être centrifugées, ressuspendues dans 500µL d’eau stérile, et incubées sur boîte SM+agar pendant 2 à 4 jours.

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c) Protocole de mesure de l’activité ββββ-galactosidase

-Analyse qualitative

Les colonies de levures sont repiquées d’une boîte maîtresse (milieu sélectif SM-UTH- _{dans notre cas)}

SM 2% glucose sur une boîte SM 2% galactose. Après 48h minimum à 30°C, les levures sont transférées sur une membrane de nitrocellulose, ce qui conduit à un aspect non homogène des colonies de levures (Exp.1, Fig.48C). La membrane de nitrocellulose peut éventuellement être placée directement sur la boîte SM 2% galactose afin de repiquer les levures directement sur la membrane (Exp.2, Fig.48C).

Le tout est mis à sécher sur papier buvard, trempé 5min dans l’azote liquide, séché sur papier buvard et trempé à deux nouvelles reprises dans l’azote liquide selon ce même protocole de façon à lyser les cellules.

La membrane est ensuite transférée à 37°C sur papier buvard imbibé de tampon Z (60mM Na2HPO4,12H2O; 40mM NaH2PO4, 2H2O; 10mM KCl, 1mM MgSO4, 7H2O), β-mercaptoéthanol 50mM et 5-

67 bromo-4chloro-3-indolyl b-D-galactopyranoside (X Gal) à 1mg/mL, en environnement clos (dans une boîte de pétri par exemple) jusqu’à observation d’une coloration bleue, manifestation de l’hydrolyse du substrat X-Gal par la β-galactosidase.

-Analyse quantitative

Une colonie isolée est repiquée dans 2mL de milieu sélectif (SM UTH- _{dans notre cas) 2% glucose}

pendant 15h minimum. 5µL de culture saturée sont inoculés dans 3mL de milieu sélectif SM 2% galactose, puis le tout est incubé sous agitation continue sur la nuit à 30°C jusqu’à une DO600 de 0,2 à 0,6. 1mL de cette culture

est prélevé et mis à centrifuger à 3000g pendant 5min. Le culot de levure est ressuspendu à deux reprises dans 1mL de milieu sélectif 2% galactose. Le tout est incubé sous agitation continue pendant 6h à 30°C. Les levures sont ensuite centrifugées à 3000g pendant 5min et ressuspendues dans 0,40mL de tampon Z froid (décrit dans le paragraphe précédent). Après une nouvelle centrifugation à 6000g pendant 5min à 4°C, le culot est ressuspendu dans 0,35mL de tampon Z froid. Les levures sont alors perméabilisées par ajout de 16µL de chloroforme + 16µL de SDS 0,1%, vortexées vigoureusement, et incubées 30min à 30°C. 232µL de la phase aqueuse sont transférés dans un tube eppendorf auquel sont ajoutés 40µL d’ONPG à 4mg/mL (stocké dans du KPO4 0,1M pH7.0). La DO595 est mesurée, puis l’activité lacZ de catalyse de l’ONPG (incolore) en ONP (jaune) +

galactose est suivie par mesure de la DO420 en cinétique sur 1h.

L’activité β-galactosidase est alors estimée en ‘Miller units’ à partir du calcul suivant: Miller Units=1000 x DO420/((volume de cellules) x temps de réaction en min x DO595)

Soit Miller Units=1000X pente initiale de la réaction/(volume de cellule X DO595) 7. Caractérisation de LFY chez les plantes

a) Stérilisation des graines

Les graines sont exposées 3min dans 70%EtOH + 0,05%SDS, 1min dans 95% EtOH, puis mises à sécher sur du papier buvard stérile sous hotte.

b) Conditions de culture des plantes

Les graines d’A. thaliana sont mises à stratifier 2 jours à 4°C puis transférées en salle de culture photopériode jours longs (25°C, 16h de lumière, 8h d’obscurité) sur support autoclavé 50% vermiculite exfoliée, 50% terreau.

Les graines de Nicotiana benthamiana sont soumises au même traitement sans période de stratification préalable.

c) Expression transitoire en feuilles de tabac N.benthamiana

Les plasmides sont introduits par électroporation dans des agrobactéries (Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90) puis étalées sur boîte LB sélective à 28°C. A partir d’une colonie isolée repiquée dans 5mL de milieu LB + antibiotiques, 1mL de culture saturée est transféré dans 4 mL de milieu inducteur pH 5,6 (50,78 mM MES, 0,5% [v/v] glucose, 1,734 mM NaH2PO4, 0,2 mM acétosyringone, 5% de mix 20X-AB [373,9 mM NH4Cl,

24,34 mM MgSO4, 40,23 mM KCl, 1,36 mM CaCl2, 0,18 mM FeSO4.7H20]) et mis à pousser à 28°C pendant 6 h

jusqu’à une DO600 comprise entre 0,6 et 1 (Lavy et al., 2002). Les agrobactéries sont infiltrées sur des jeunes

feuilles de tabacs âgés de 4 à 7 semaines par pression sur l’épiderme inférieur à l’aide d’une seringue.

d) Transformation stable d’A. thaliana par A. tumefaciens

Milieux de culture

YEP: 1%[m/v] yeast extract, 1% [m/v] bactopeptone, 0.5% [m/v] NaCl, pH7.0

1/2MS: 1% [m/v] saccharose, 0.22% [m/v] MS (Murashige et Skoog), 0.05% [m/v] MES, 1% [m/v] agarose pour obtenir un milieu solide

Protocole de transformation

Les plasmides sont introduits par électroporation dans des agrobactéries (A. tumefaciens C58C1 pMP90) puis étalées sur boîte LB sélective à 28°C. Une colonie isolée est repiquée dans 5mL de milieu LB + antibiotiques, puis transférée à saturation dans 200mL YEP + antobiotiques. A DO600 comprise entre 0,8 et 1, la

culture est centrifugée 10min à 4000rpm et à température ambiante puis le culot est ressuspendu dans 300mL de milieu 1/2MS auxquels est rajouté 150µL de Silweet L-77. Les inflorescences d’A. thaliana ayant effectué leur montaison 1 à 2 semaines auparavant (tiges mesurant entre 10 et 20cm) sont trempées pendant 1 à 2min dans le mélange d’agrobactéries+1/2MS+Silweet L-77. Les plantes sont ensuite incubées sous cloche pendant un à

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deux jours. Approximativement 3 semaines plus tard (lorsque les premières siliques arrivent à déhiscence), les graines sont récoltées quotidiennement.

e) Microscopie confocale

Les feuilles de tabac infiltrées sont visualisées 4 ou 5 jours après infiltration. La zone infiltrée est montée dans l’eau, et observée au microscope confocal inversé TCS-SP2 (Leica Microsystem) à l’objectif à immersion X20 ou X40. La GFP et la YFP (protéine fluorescente jaune) sont excitées à 488 nm et l’émission est mesurée entre 500 et 555 nm. mRFP1 est excitée à 543 nm et la lumière d’émission est récupérée dans l’intervalle [575 nm: 635 nm].

f) Extraction de l’ADN génomique (ADNg) des plantes d’A. thaliana

L’équivalent de 0,5mm X 0,5mm de matériel végétal de préférence jeune (jeunes feuilles ou zones méristématiques) est écrasé à température ambiante pendant 15 sec à l’aide d’un pilon adapté aux tubes eppendorf 1,5mL . 200µL de tampon d’extraction (200mM Tris-HCl pH7.5; 250mM NaCl; 25mM EDTA; 0,5%SDS) sont ajoutés puis le mélange est vortexé 5sec. Après centrifugation à 10000g pendant 1min, 150µL de surnageant sont transférés dans un tube eppendorf neuf. 150µL d’isopropanol sont rajoutés et le tout est laissé à -20°C pendant 2min. Après centrifugation à 10000g pendant 5min, le culot est lavé (optionnel) avec 100µL d’EtOH 70% et centrifugé à 10000g pendant 5min. Finalement, le culot est séché au speed vacuum puis dissout dans 50µL de TE 1X.

g) Génotypage des plantes lfy-12

L’ADNg des plantes à tester est amplifié par PCR à partir des oligonucléotides oLFY1 (5’AAGCAGCCGTCTGCGGTGTCAGCAGCTGTT) et oLFY2 (5’CTGTCAATTTCCCAGCAAGACAC).

Mélange: 1.25µL dNTP 10mM, 2.5µL Tampon PCR MgCl2 10X, 0.5µL oLFY1 20mM, 0.5µL oLFY2 20mM, 5µL

d’extrait d’ADNg, 15.05µL eau distillée, 0.2µL Q-bio taq polymerase (MP Biomedicals, Qiagen) Programme: 94°C 4min, (94°C 30 sec, 57°C 30 sec, 72°C 30 sec) X 35 cycles

Les produits PCR sont ensuite digérés 3h à 60°C.

Mélange: 15µL de produit PCR, 2µL eau distillée, 2µL Tampon W (NEBuffer New England BioLabs), 1µL BstAPI (New England BioLabs)

Enfin, le génotype des plantes est obtenu par visualisation sur gel d’acrylamide TAE 0,5X, 3% agarose: la taille des fragments de restriction attendue est 370pb pour l’allèle lfy-12, 345pb pour l’allèle LFY.

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