Analyse qualitative du métabolisme oxydatif par CMF

3.1. Les sondes métaboliques : H₂DCF-DA et DHE

Principe

La sonde H

2

DCF-DA (2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate), composé non fluorescent

lipophile, traverse la membrane plasmique des cellules et se retrouve au niveau des régions

lipidiques hydrophobes. Les estérases cellulaires hydrolysent les groupements acétates,

dans la cellule contrairement au composé parent, à cause de sa polarité. Une fois piégée dans

la cellule après la désacétylation, la sonde H

₂

DCF non fluorescente s’oxyde en présence

d’espèces réactives de l’oxygène (ERO) et de peroxydases ou Fe2+ ou cytochrome c, pour

former le DCF qui est fluorescent. Aussi l’intensité de fluorescence est directement

proportionnelle à la quantité d’ERO présents dans la cellule (Tsuchiya M

,

1994 ; LeBel CP

,

1992 ; Rothe G

,

1990). Le composé non fluorescent a l’avantage d’être perméable aux

membranes cellulaires, la fluorescence est donc détectée à l’intérieur de la cellule dans les

différents compartiments cellulaires (cytosol, espace intermembranaire mitochondrial…)

(Karlsson M

,

2010) (Figure 40). Plusieurs données indiquent que cette oxydation est le fait

préférentiellement du peroxyde d’hydrogène (H

2

O

2

), en conséquence, le niveau d’H

2

O

2

d’une

cellule spécifique peut être déterminé.

Suivant le même principe, la sonde DHE (Dihydroéthidium) non fluorescente, pénètre

facilement dans les cellules, et est ensuite oxydée en présence d’ O

2

- en BET, un agent

intercalant de l’ADN (Stowe DF

,

2009).

Figure 40. Principe de la sonde H

₂

DCF-DA

L’association du multimarquage des sous-populations lymphocytaires T parmi les LTCD4+

(décrit dans « Analyse conditionnée multiparamétrique ») avec le marquage par des sondes

métaboliques va permettre la mesure qualitative (en fonction de la sonde utilisée) et

quantitative (via la MFI) des ERO pour chacune d’entre elles. A l’instar du multimarquage

membranaire avec 5 couleurs, la principale difficulté de cette technique réside dans le

contrôle de la fuite de fluorescence des sondes oxydées dans les PMT voisins. L’utilisation de

faibles concentrations de la sonde à une basse température a permis de mettre au point ce

protocole 6 couleurs, permettant l’analyse des ERO dans des lymphocytes (Kwon J

,

2003 ;

Devadas S

,

2002).

Matériel et mode opératoire

Les LTCD4+ triés magnétiquement et mis au repos pendant la nuit, sont mis en suspension

dans du milieu complet comportant 2,5%SVF, dans des tubes de 5ml à fond rond (Falcon).

Une pré-incubation des cellules (1.10

⁶

cellules/ml) avec 0,25 μM de sonde H

2

DCF-DA (Life

technologies, C3168) ou 1µM de DHE (Life technologies), est réalisée pendant 30 min dans

du milieu complet comportant 2,5% SVF à 4°C. Les traitements pharmacologiques avec la

NAC (1h30 d’incubation) ou avec le FCCP (30min d’incubation) sont faits juste avant la

phase d’incubation avec la sonde. Les expériences sont réalisées en prenant soin d’exposer le

moins possible la sonde métabolique à la lumière.

L’agression oxydante aigüe est induite soit par l’addition de 250µM THBP (contrôle positif)

soit par l’addition de 10% de CFC, pendant 30min à 37°C, dans des cellules préalablement

incubées avec 0,25µM de la sonde H

₂

DCF-DA ou 1µM de DHE. Cette étape est critique, les

cellules doivent être bien homogénéisées ; ceci permet d’obtenir un marquage homogène des

LTCD4+ avec les différentes sondes. Puis le milieu pro-oxydant est retiré, et les cellules sont

lavées deux fois avec du PBS froid. Les cellules sont finalement reprises dans 100 μL de PBS

et marquées avec les 5 différents anticorps pour l’identification des sous-populations

lymphocytaires T (décrit dans la partie « Préparation des suspensions cellulaires »).

Concernant les expériences d’analyse de l’effet d’une agression oxydante prolongée, le

marquage des cellules avec les sondes est pratiqué à J0 et 72h selon le même mode opératoire

que précédemment décrit, excepté en ce qui concerne les concentrations de CFC (Cf.

agression oxydante chronique). La vérification de l’absence de toxicité des oxydants (THBP,

CFC) est évaluée à chaque fois par CMF via l’analyse des paramètres FSC/SSC, au moment

de la lecture de fluorescence émise par la sonde utilisée. La fluorescence émise par les sondes

est lue immédiatement au CMF après une absorption de la lumière à 488 nm (laser1), celle de

DCF dans le PMT1 (ou FL-1), et celle du BET dans le PMT4 (ou FL-4). Le traitement des

résultats dans ce projet est fait au moyen du logiciel d’analyse FLOW JOW (BD Biosciences).

De plus, l’analyse des résultats en CMF permet d’extraire des données de statistiques comme

le pourcentage que représente une sous-population cellulaire donnée au sein de la population

mère analysée. Les intensités de fluorescence (MFI) émises par les sondes par une population

particulière, permettent une évaluation quantitative de son taux d’ERO., L’augmentation du

% d’oxydation d’une sonde après une agression oxydante aigüe ou chronique peut être

calculée par cette formule :

% OXYDATION =

[MFI (condition d’agression)- MFI (condition non stimulée)]

_____________________________

MFI (condition non stimulée)

Les problèmes de variation dans le marquage ou de dé-estérification de la sonde sont évalués,

par l’utilisation d’une forme oxydée de la sonde, la Carboxy-DCFDA (Life technologies) à

0,25µM (Harlin H

,

2007 ; Mougiakakos D

,

2009).

3.2. Mesure d’ERO des populations de TCD4+ par CMF

Nous avons utilisé la stratégie de tri des populations lymphocytaires T (décrite dans

« Analyse conditionnée multiparamétrique) en la combinant à l’analyse du marquage par des

sondes métaboliques.

Un histogramme mono-paramétrique conditionné sur chacune des sous-populations

lymphocytaires T est sélectionné en abscisse sur l’une des sondes. Un pic uniforme (ou

plusieurs selon les marquages) de distribution gaussienne, indique le niveau de fluorescence

d’une population pour la sonde utilisée. Puis les histogrammes spécifiques de chaque

population sont superposés (« overlay ») afin de comparer les pics de fluorescence entre eux

et donc les niveaux d’ERO via les valeurs de MFI (Figure 41).

CD4+

Treg totaux

Tconv totaux

Tconv totaux

naïf mémoire

Tconv mémoire

Th17

Non Th17

Treg totaux ^{Tconv naïfs}

Non Th17 _Th17

N

o

m

b

re

rela

tif de

cellu

les

DCF

DCF

N

o

m

b

re

rela

tif de

cellu

les

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