Analyse des PCB par chromatographie en phase gazeuse couplée à un détecteur à

4.1.1. Protocole expérimental

Seize congénères de PCB ont été analysés, il s’agit des composés : CB28, 52, 101, 105, 110, 118, 128, 132, 138, 149, 153, 156, 170, 180, 187, et 194. Parmi ces congénères de PCB qui constituent ceux systématiquement suivis au laboratoire (DCN-BE-CO, Ifremer Brest), on retrouve les 7 composés marqueurs de contamination par les PCB auxquels ont été ajoutés deux composés de type dioxine-like (CB105 et 156). D’autres congénères ont été mesurés parce qu’ils peuvent apporter des éléments d’information sur le comportement des PCB dans l’environnement marin littoral (CB110, 132 et 149 composés partiellement biotransformés par certains organismes vivants ; CB170, 187, et 194, composés persistants).

La figure 24 résume par un schéma les différentes étapes du protocole pour la détermination et la quantification de ces composés.

Échantillon lyophilisé et broyé Extraction au Soxtex (hexane-acétone) Purification acide sulfurique concentré

Purification sur colonne de Florisil (Pentane)

Fraction PCB dans isooctane

Analyse GC-ECD

Analyse des PCB par GC-ECD

Détermination de la quantité de matière extractible Échantillon lyophilisé et broyé Extraction au Soxtex (hexane-acétone) Purification acide sulfurique concentré

Purification sur colonne de Florisil (Pentane)

Fraction PCB dans isooctane

Analyse GC-ECD

Analyse des PCB par GC-ECD

Détermination de la quantité de matière extractible

Figure 24 : Protocole d’analyse des PCB par GC-ECD

Extraction des contaminants

L’extraction des composés hydrophobes a été réalisée à l’aide d’un appareil Soxtec, selon une méthode dérivée de la méthode Soxhlet (cf Chapitre 3, paragraphe 4.2). Il permet l’extraction en continu de six échantillons, préalablement lyophilisés, par un mélange de solvants à chaud (hexane/acétone = 40 :10, v/v) dans des cartouches en cellulose. L’extraction est réalisée sur une prise d’essais de 0,5 à 2,5 g de poids sec selon le matériel à analyser et comprend deux étapes :

- une étape d’extraction pendant laquelle les cartouches de cellulose contenant le lyophilisat sont plongées dans le mélange de solvant en ébullition pendant deux heures,

- une étape de rinçage à reflux pendant une heure.

L’extrait organique ainsi obtenu est évaporé à sec, puis pesé de manière à déterminer la quantité de matière extractible à l’« hexane-acétone », et finalement repris dans 5 ml

Purification des extraits

L’étape de purification a pour but d’éliminer tout le matériel co-extrait autres que les contaminants recherchés, celui-ci pouvant interférer lors de l’analyse instrumentale finale (contamination des colonnes chromatographiques, problèmes de co-élution avec les contaminants organiques étudiés, saturation du détecteur). Deux étapes successives de purification ont été utilisées pour l’analyse des PCB :

1/ Elimination du matériel co-extrait par hydrolyse à l’acide sulfurique concentré : Cette méthode est adaptée et efficace dans le cas de composés chimiquement stables tels que les PCB (Kannan et al., 1993, Wells et Echarri 1994). Pour cela, 2 ml de H2SO4 concentré sont ajoutés à l’extrait. Après agitation au vortex, l’émulsion obtenue est laissée à décanter pendant au minimum 12 heures à l’abri de la lumière. Le surnageant organique (S1) contenant les composés hydrophobes (PCB) est récupéré. Une seconde extraction du culot (phase aqueuse) est réalisée par 3 ml d’hexane. Après agitation au vortex, l’émulsion est centrifugée pendant 1 heure à 3000 tr.min^-1, le surnageant récupéré (S2) est combiné avec l’extrait précédent (S1). Cet extrait est ensuite évaporé à sec, puis repris par 500 µl d’hexane.

2/ Purification par chromatographie d’adsorption sur colonne : Cette étape permet d’éliminer les composés polaires restants, et les traces d’eau. La purification est réalisée sur des colonnes de Florisil (co-précipité de Magnésie et de Silice: 16% MgO + 84% SiO2 ; Taille 60/100 mesh soit 0,15/0,25 cm). Des colonnes chromatographiques en verre (hauteur 16 cm ; diamètre 3 mm) contenant 2,35 g de Florisil, activé à 400°C pendant une nuit puis désactivé par 3% d’eau, sont ensuite lavées avec 25 ml de pentane. Sur chaque colonne, on dépose 500 µl d’échantillon élué avec 20 ml de pentane. Le solvant est récupéré dans un ballon puis évaporé à sec sous jet d’azote. L’extrait purifié est repris dans 500 µl d’une solution contenant de l’isooctane ainsi qu’un étalon interne, le tétrachloronaphtalène (TCN), puis transvasé dans un flacon de 2 ml adapté au passeur automatique d’échantillons du chromatographe.

Analyse des PCB par chromatographie en phase gazeuse

La quantification des PCB dans un échantillon a été réalisée par chromatographie en phase gazeuse couplée à un détecteur à capture d’électrons (GC-ECD). Les caractéristiques et conditions opératoires du chromatographe sont présentées dans le tableau 18.

Tableau 18 : Caractéristiques et conditions opératoires du chromatographe.

HP 5890

Colonne Colonne capillaire Varian CP-SIL 19 CB en silice fondue de 50 m de longueur, 0,25 mm de diamètre interne et 0,2 µm d’épaisseur de film

Gaz Vecteur Hydrogène à 1,21 bar, vitesse linéaire 35 cm.s^-1

Injecteur « on column » à 78°C Programmation de température 2 min à 75°C 30°C.min^-1 jusqu’à 180°C 2,5°C.min^-1 jusqu’à 280°C 30°C.min^-1 jusqu’à 300°C

Détecteur ECD, source ⁶³Ni à 330°C

4.1.2. Validation et qualification du protocole

Dans ce paragraphe, sont présentés les différents contrôles qui permettent de garantir la qualité des mesures.

Blanc :

Parallèlement à l’analyse des échantillons réels, des blancs analytiques ont été systématiquement mesurés tous les 12 échantillons. L’ensemble de ces vérifications n’a pas mis en évidence de problème de contamination au cours du protocole susceptible d’entacher la mesure des contaminants recherchés.

Justesse :

La fiabilité de l’étape de purification a été validée à l’aide d’un échantillon certifié d’huile de foie de morue (CRM349 ; Bureau Communautaire de Référence Commission Européenne). Les concentrations en PCB obtenues ont été comparées aux valeurs certifiées (Tableau 19). Les taux de récupération varient entre 77 et 115%, excepté pour le composé CB105 probablement dû à un problème de co-élution avec un autre composé lors de l’analyse. Le protocole utilisé lors de cette étude permet donc l’obtention de résultats en accord avec les valeurs de référence certifiées et les données complémentaires publiées (Schantz et al., 1993).

Tableau 19 : Comparaison des concentrations mesurées et certifiées, et taux de récupération des PCB dans le CRM349. (ET = écart-type ; CV = coefficient de variation ; Taux de récupération = moyenne expérimentale / valeur certifiée × 100).

Valeurs certifiées ^{ET CV} Moyenne expérimentale (n=6) ET CV ^{Taux de} récupération (ng.g^-1) (ng.g^-1) (%) (ng.g^-1) (ng.g^-1) (%) (%) CB28 68 7 10,3 54,6 10,1 18,5 80,3 CB52 149 20 13,4 116,0 16,4 14,2 77,8 CB101 370 17 4,6 300,5 13,5 4,5 81,2 CB110 175^a 157,6 18,9 12,0 87,6 CB149 ₂₈₄a 55 19,4 228,0 12,5 6,0 80,3 CB118 454 31 6,8 412,9 15,5 3,8 91,0 CB153 938 49 5,2 990,7 66,5 6,7 105,6 CB132 65,5 11,2 17,1 CB105 51^a 109,3 21,2 19,4 218,6 CB138 765^a 74 9,7 881,9 52,5 6,0 115,3 CB187 ₂₇₆a 14 5,1 222,9 12,5 5,6 80,8 CB128 104^a 9 8,7 90,2 8,0 8,8 86,8 CB156 40^a 39,0 6,3 16,2 97,6 CB180 280 22 7,9 243,5 13,3 5,5 87,0 CB170 149^a 15 10,1 137,8 11,2 8,1 92,5 CB194 26,7 3,1 11,5

a Concentrations non certifiées

Précision :

La répétabilité de la méthode a été testée en dosant les PCB dans 6 réplicats (prises d’essais de 1g) d’un échantillon d’araignée prélevé en Mer d’Iroise. Les résultats obtenus montrent une reproductibilité satisfaisante de la méthode pour l’ensemble des congénères (tableau 20), les coefficients de variation oscillant entre 4 et 13%. Le congénère CB28 était systématiquement en-dessous de la limite de détection (0,3 pg.µl^-1).

Tableau 20 : Test de reproductibilité sur un échantillon d’hépatopancréas d’araignée de Mer d’Iroise (n=6). (ET = écart-type ; CV = coefficient de variation).

Ech1 Ech2 Ech3 Ech4 Ech5 Ech6 Moyenne ET CV

(ng.g^-1) (ng.g^-1) (ng.g^-1) (ng.g^-1) (ng.g^-1) (ng.g^-1) (ng.g^-1) (ng.g^-1) (%) CB52 5,1 5,1 4,6 4,1 4,3 5,0 4,7 0,4 9 CB101 0,4 0,3 0,5 0,4 0,3 0,4 0,4 0,0 13 CB110 0,3 0,2 0,3 0,2 0,2 0,2 0,2 0,0 13 CB149 0,9 0,9 0,8 0,8 0,8 1,0 0,9 0,1 7 CB118 5,4 4,9 5,4 4,5 5,6 6,0 5,3 0,5 10 CB153 30,2 31,4 31,7 29,0 31,1 32,0 30,9 1,1 4 CB132 0,8 0,6 0,8 0,8 0,7 0,8 0,7 0,1 10 CB105 1,8 1,3 1,6 1,6 1,6 1,7 1,6 0,2 11 CB138 10,5 10,0 9,8 8,8 10,2 11,5 10,1 0,9 9 CB187 6,0 6,0 5,8 5,8 5,9 6,5 6,0 0,3 4 CB128 0,9 1,1 1,0 0,8 0,9 1,0 0,9 0,1 9 CB156 1,1 1,2 1,1 1,0 1,1 1,2 1,1 0,1 6 CB180 8,1 8,5 8,2 7,5 8,2 9,1 8,3 0,5 6 CB170 3,9 4,4 4,6 4,5 4,1 4,9 4,4 0,4 8 CB194 2,3 2,6 2,5 2,9 2,3 2,7 2,5 0,2 9

4.2. Analyse des dioxines, PCB et PBDE par chromatographie en phase