Analyse des clusters putatifs du métabolisme secondaire

3.3.1. Les clusters putatifs de type NIS (NRPS independant siderophores)

Parmi les dix clusters orphelins identifiés, deux sont annotés comme pouvant produire un métabolite de type sidérophore. En effet, les clusters N°13 et 18 sont détectés comme contenant un gène de NIS synthétase par antiSMASH 2.0. Ces deux clusters, N°13 et 18 (Tableau 2), très conservés chez de nombreuses espèces de Streptomyces, contiennent des gènes possédant un degré significatif d’identité de séquence avec les produits de gènes de biosynthèse du sidérophore rhizobactine (Figure 3A). Le cluster de gènes de la rhizobactine, identifié chez Sinorhizobium meliloti, a été décrit comme possédant une partie biosynthèse, rhbABCDEF, une partie régulation, rhrA, et une partie transport rhtA (Lynch et al., 2001). Les produits des gènes orf06 et orf08 du cluster 13 possèdent respectivement 38% et 35% d’identité de séquence avec RhbB et RhbD. RhbB et RhbD interviennent vraisemblablement dans la décarboxylation de l’acide L-2,4-diaminobutyrique et de l’acétylation du N-hydroxy- 1-aminopropane, deux précurseurs de la rhizobactine. ORF07 possède 39 et 25% d’identité de séquence avec les protéines RhbC et RhbF. Ces deux enzymes seraient successivement impliquées dans l’ajout de molécules de citrate sur les précurseurs de la rhizobactine. Ce cluster contient également deux gènes potentiellement liés à la biosynthèse (phosphohydrolase ORF01 et metalloprotéase ORF02), ainsi qu’un gène codant une protéine liant l’ATP (ORF03), potentiellement impliquée dans des mécanismes de régulation. Enfin, on note la présence de deux gènes de fonction inconnue (orf04 et orf05).

Le cluster 18 contient des gènes dont les produits sont homologues aux protéines RhbF et RhbC (respectivement protéines 6 et 7 avec 25 et 29% d’identité). Ce cluster putatif contient également 5 autres gènes de biosynthèse, 2 gènes liés à la régulation et 4 gènes de fonction inconnue (Tableau 3).

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Tableau 3 : Annotation des gènes du cluster putatif NIS-like N°18.

Jusqu’à présent, les synthétases de NIS décrites sont impliquées dans la biosynthèse de sidérophores. C’est le cas notamment de DesD, une enzyme de biosynthèse de la desferrioxamine (Barona-Gomez et al., 2004). Cependant, il ne semble pas que les deux clusters 13 et 18 dirigent la biosynthèse de sidérophores. Des expériences menées sur une souche de S. coelicolor (espèce possédant des homologues des clusters 13 et 18), incapable de produire les sidérophores desferrioxamine et coelichéline, ont révélé une incapacité à pousser sur milieu carencé en fer (Barona-Gomez et al., 2006). Cela suggère donc que les métabolites produits par les clusters 13 et 18 n’auraient pas de fonction sidérophore (Si les gènes sont bien exprimés…). D’autre part, aucune séquence consensus de type "Fur-box", impliquée dans la régulation de la transcription des gènes de biosynthèse de sidérophores, n’a pu être identifiée en amont des gènes des deux clusters. De même, ces clusters ne semblent pas posséder de gènes susceptibles d’être impliqués dans la reconnaissance de ferrisidérophores et dans leur transport.

Deux mutants d’inactivation des homologues rhbC (OSC418 pour le cluster 13 et OSC419 pour le cluster 18, Garénaux et Nezbedova, non publié) ont été testés pour leurs activités antibactériennes qui ne diffèrent pas de la souche témoin OSC4. Ces clusters ne semblent donc pas non plus impliqués dans la biosynthèse des molécules antibiotiques A1 et A2. Toutefois, la disparition de pics en HPLC a été observée chez le mutant OSC419 (culture de 5 jours en milieu HT), signifiant que les gènes du cluster sont exprimés et permettent la synthèse de métabolites dont la nature et la fonction restent à déterminer (Figure 3B).

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Figure 2 : A) représentation des clusters putatifs NIS N°13 et 18 ainsi que du cluster rhizobactine. Les traits noirs symbolisent les relations d’homologie entre les gènes des clusters 13 et 18 et celui de la rhizobactine. B) Chromatogrammes HPLC de surnageants de cultures des souches OSC4 et OSC419 (gradient H2O/CH3CN

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3.3.2 Cluster putatif de biosynthèse de lipopeptide

Le cluster N°15, adjacent au cluster de biosynthèse de la spiramycine pourrait être impliqué dans la synthèse d’un lipopeptide de type Calcium Dependent Antibiotic (CDA), produit par S. coelicolor. En effet, ce cluster, que nous avons nommé cll (cda-like lipopeptide) (Tableau 4), possède trois gènes codant des protéines de type NRPS dont l’organisation en modules et domaines est présenté Figure 4. Les 13 domaines d’adénylation (A1 à A13) sont respectivement prédits comme pouvant activer les acides aminés [Gly-Gly-Asp-Gly-Thr], [Tyr-Ile-Gly-Thr-Thr-3h4mPhe] et [HPG-Thr] A priori, ces éléments ne pourraient pas permettre la synthèse d’un motif DXDG, site putatif de fixation du calcium chez des molécules de la même famille : Calcium Dependent Antibiotic (Grunewald et al., 2004) ; A54145 (Miao et al., 2006). Outre les gènes codant les NRPS, le cluster contient également des gènes nécessaires à la synthèse de la chaîne d’acide gras (cll05-08), ainsi que les gènes nécessaires à la synthèse des acides aminés hydroxyphénylglicine (HPG) et 3-hydroxy-4- méthyl-phénylalanine (3h4mPhe) (cll13, 15, 16, 17 et 18). Enfin, ce cluster contient plusieurs gènes impliqués dans le transport (cll01, 02, 10, 11, 23 et 25) et dans la régulation (cll12, 14, 21, 22 et 24) de la biosynthèse, dont un système à deux composants histidine kinase (cll22) et récepteur (cll21), souvent retrouvé dans les clusters de biosynthèse de lipopeptides (Figure 4).

Plusieurs molécules de cette famille possèdent des activités antibiotiques. C’est le cas de la daptomycine (Miao et al., 2005), de la friulimicine (Muller et al., 2006) ou encore des laspartomycines (Wang et al., 2011). Un mutant, OSC408, pour lequel un gène de NRPS a été inactivé a été construit au laboratoire (Garénaux et Nezbedova, non publié). Des tests d’activité antibiotiques réalisés sur ce mutant n’ont pas révélé de perte d’une des deux activités antibiotiques A1 et A2 par rapport à la souche « sauvage » OSC4. Par ailleurs, la souche OSC4 ne possède pas d’activité antibiotique contre Micrococcus luteus dans les conditions où l’activité de CDA est observée chez S. coelicolor. Ces observations suggèrent que, si le cluster cll est exprimé, son produit n’a pas de propriété antibiotique, du moins contre Micrococcus luteus.

Bien que des clusters de gènes du même type soient fréquents au sein du genre Streptomyces, le cluster cll n’est pas conservé chez beaucoup d’espèces (dont le génome est séquencé, du moins). On notera toutefois la présence d’un cluster très conservé chez S. violaceorubidus (pour lequel aucune étude n’a été réalisée à ce jour) où les gènes cll01 à cll24

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sont synténiques entre S. ambofaciens et S. violaceorubidus, avec entre 50 à 89% d’identité de séquence.

Figure 3 : A) Organisation des gènes du cluster cll. B) Représentation des modules et domaines des 3 NRPS du cluster cll . C : Condensation ; A : Adénylation ; PP : Peptidyl carrier Protein ; E : Epimérisation ; Te : Thioestérase. Les flèches indiquent les substrats activés par les domaines A.

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Tableau 4 : Annotation des gènes du cluster putatif cll.

3.3.3. Cluster putatif PKS de type I

Ce cluster putatif N°27 contient un gène de PKS de type I (SAMR0270) ainsi que plusieurs gènes d’éléments de PKS (SAMR0271, 275 et 276) (Figure 5 et Tableau 5). On note également la présence de deux (SAMR0264 et 266) et quatre (SAMR0262, 267, 277 et 279) gènes potentiellement impliqués dans des mécanismes de transport et de régulation. Ce cluster n’est pas retrouvé chez S. coelicolor. Il est entouré par deux groupes de transposases (SAMR0260-61 et SAMR0282-83-84), permettant de proposer des bornes pour ce cluster. Cette observation suggère également que cette région aurait pu être acquise par transfert horizontal.

Les gènes SAMR0270 à SAMR0276 sont présents chez S. ghanaensis et S. griseoaurantiacus. On retrouve également les gènes SAMR0270/72/73/74 chez plusieurs bactéries du genre Geobacter. D’autres gènes autour du bloc SAMR0270-76 pourraient être

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impliqués dans des mécanismes de modifications du squelette polycétide (méthyltransférase, déhydrogénase…).

Un mutant, OSC401, pour lequel un gène SAMR0270 a été inactivé a été construit. Des tests d’activité antibiotiques ont révélé que ce cluster n’était pas responsable de la synthèse d’une des deux molécules antibiotiques (A1/A2) inconnues.

Figure 4 : A) Organisation des gènes du cluster putatif N°27 de type PKS-I. B) Organisation des domaines de la PKS SAMR0270 (KS : cétosynthase, AT : Acétyltransférase, DH : Deshydratase, ER : Enoylréductase, KR : cétoréductase et PP : Acyl Carrier Protein).

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Tableau 5 : Annotation des gènes du cluster putatif N°27 de type PKS-I.

3.3.4. Clusters putatif de biosynthèse de peptides ribosomiques

De nombreux métabolites secondaires dérivent de peptides ribosomaux qui sont modifiés de façon post-traductionnelle par différentes enzymes avant d'acquérir leur activité. Ces peptides, appelés RiPPs (pour Ribosomally synthetized and Post-translationally modified Peptids) comprennent notamment les lanthipeptides et les peptides lasso (Yang and van der Donk, 2013).

Le cluster putatif N°26 contient plusieurs gènes pouvant être impliqués dans la synthèse d’un peptide ribosomique de type lanthipeptide. Trois gènes codent respectivement une synthétase de lanthionine (SAMR0344), une deshydratase de lantibiotique (SAMR0343) et un possible peptide precurseur (SAMR0342). Ces trois gènes sont conservés chez plusieurs espèces de Streptomyces, notamment S. coelicolor, S. lividans, S. bingchenggensis et S. griseoflavus. De manière intéressante, le groupe de gènes identifiés par antiSMASH 2.0. contient également un gène (SAMR0328) pouvant être impliqué dans la synthèse d’isoprenoïdes. Ce gène ne possède, cela dit, qu’un faible niveau d’identité avec les gènes les plus proches (26% au mieux) et pourrait donc posséder une fonction différente de celle proposée. Un mutant OSC413, interrompu pour le gène SAMR343 est disponible au

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laboratoire (Garénaux et Nezbedova, non publié). Des tests d’activité antibiotique réalisés n’ont pas permis de lier ce mutant à une perte des activités antibiotiques A1 ou A2.

Les clusters N°16 et 22 sont identifiés comme pouvant produire des molécules de type bactériocine (Figure 6). Les bactériocines sont de petits peptides synthétisés par voie ribosomique. Les peptides précurseurs sont souvent très courts et peu conservés entre eux. Ces gènes codant les peptides précurseurs sont souvent accompagnés d’autres gènes introduisant des modifications sur le squelette peptidique, et ce sont ces derniers qui sont détectés par les outils bioinformatiques (Velasquez and van der Donk, 2011). Le cluster N°16 est relativement peu conservé au sein du genre Streptomyces. Il n'est retrouvé que dans le génome de S. sviceus (6 gènes conservés, dont le gène de synthèse du peptide précurseur (64 aa)). De plus, l’identité des gènes liés aux modifications du squelette peptidique reste très hypothétique. Ces fonctions pourraient être assurées par le produit de l’orf02, présentant une fonction putative acétyltransférase, et/ou par le produit de l’orf06, contenant un domaine DadA (glycine/amino-acid dehydrogenase). Le cluster N°22, en revanche, possède un gène codant une protéase (orf05) et semble retrouvé chez de nombreux Streptomyces, notamment chez S.coelicolor, S. avermitilis, S. sviceus et S. chartreusis où les 6 gènes du cluster identifié sont retrouvés. Certains gènes sont même présents en plusieurs exemplaires chez certaines espèces. Le cluster N°22 comprend 3 gènes codant des transporteurs : deux appartenant à la famille des transporteurs ABC, l’autre à la famille des transporteurs RND. On trouve également un gène codant une protéase et une phosphatase, ainsi que le gène codant le peptide précurseur (71 aa).

Les clusters de type bactériocine n’ayant pas été identifiés par les outils de détection bioinformatique au début de notre étude, nous ne possédons pas de mutant inactivé pour des gènes de ces clusters chez la souche OSC4. Ces clusters pourraient donc être liés à la synthèse des métabolites antibiotiques responsables des activités A1 et A2. La construction de mutants de gènes de ces clusters constitue une des perspectives de ce travail.

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Figure 5 : Organisation des gènes des clusters putatifs N°16 et 22. Les clusters sont comparés à leur homologue le plus proche où les traits noirs indiquent les relations d’homologie entre les gènes.

3.3.5. Cluster de biosynthèse putatif de terpène

Un gène (SAMR0831) identifié comme codant une terpene cyclase a été localisé dans le cluster N°21. Ce cluster putatif est identifié par antiSMASH 2.0. comme comprenant les gènes SAMR0818 à SAMR0841 (Figure 7 et Tableau 6). On note, cela dit, une conservation des gènes SAMR0826 à SAMR0831 chez plusieurs espèces (S. viridochromogenes, S. chartreusis, S. flavogriseus), suggérant que ce cluster pourrait contenir un nombre de gènes plus restreint. Outre le gène de terpène cyclase, le cluster comprend plusieurs gènes pouvant être impliqués dans des modifications du squelette terpène, notamment des décarboxylases, dioxygénases, oxydoréductases, deshydrogénases et, de façon moins commune, une nitroréductase (SAMR0826). Ce cluster comporte également un gène de résistance aux tétracyclines de type TetM (SAMR0840), ce gène pourrait donc être impliqué dans un mécanisme de détoxification (ou de transport de façon plus générale). Ces gènes codent deux protéines liant l'ATP, un cytochrome P450, une protéine potentiellement impliquée dans la régulation et une protéine de fonction inconnue.

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Figure 6 : Organisation des gènes du cluster putatif N°21 de type terpène.

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3.3.6. Biosynthèse de butyrolactones

L’analyse réalisée a également permis la localisation trois gènes de biosynthèse de butyrolactones. Les clusters N°2 (présent dans les TIR, donc 2 fois dans le chromosome) et 9 contiennent chacun un gène de type afsA impliqué dans la synthèse de γ-butyrolactones. La protéine AfsA est responsable du transfert d’un groupement β-cétoacyl sur une molécule de dihydroxyacetone phosphate, une étape essentielle de la synthèse du facteur A chez S. griseus (Kato et al., 2007). Le facteur A agit à la fois sur le métabolisme secondaire et sur la morphologie de la bactérie. Les clusters N°2 et N°9 pourraient donc diriger la biosynthèse de molécules signal impliquées dans la régulation de plusieurs voies du métabolisme secondaire. Cela pourrait en particulier être le cas du cluster de biosynthèse de la kinamycine (SAML0158-0185) qui contient un gène (alpZ, SAML0185) codant un récepteur de γ- butyrolactone (Bunet et al., 2008).

Ces gènes sont retrouvés chez plusieurs espèces de Streptomyces mais ne semblent pas associés à un cluster à proprement parler (dans le sens où il n’y a souvent qu’un seul gène). Seule une épimerase/déhydratase NAD-dépendante semble conservée avec le gène afsA dans le cas du cluster N°9.

3.3.7. Recherche de clusters par similitude de séquence : bilan

Nous avons montré qu’il était possible, grâce à l’outil antiSMASH 2.0., d’identifier 26 clusters putatifs (ou non) du métabolisme secondaire chez S. ambofaciens ATCC23877. Identifiés par similitude de séquence avec des gènes typiques du métabolisme secondaire, dix de ces clusters ne sont toujours pas liés à la synthèse de métabolites caractérisés. Il reste donc chez cette espèce des clusters à analyser. Néanmoins, la construction systématique (à l’exception des clusters bactériocine) de mutants d’inactivation n’a pas permis de révéler de phénotype de perte des activités antibiotiques A1 et A2. Il y a donc, chez S. ambofaciens, des clusters originaux, qui ne sont pas identifiables par recherche de similitude avec les gènes connus du métabolisme secondaire. Le développement de nouvelles stratégies de recherche des clusters du métabolisme secondaire est donc nécessaire si l'on souhaite explorer ce métabolisme dans son intégralité. D’autre part, antiSMASH 2.0 étant basé sur la recherche de gènes en particulier, il ne permet pas de délimiter de façon précise les clusters. En effet, le cluster desferrioxamine, constitué de quatre gènes, est par exemple identifié dans un groupe de onze gènes.

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3.4. Comparaison des génomes de S. ambofaciens et S. coelicolor : recherche d’ilots