αB-crystallin régule la mono-ubiquitination de Smad4 via TIF1γ

La localisation cellulaire de Smad4 est régulée par sa mono-ubiquitiniation. En effet, dans le noyau, la E3-ubiquitine ligase TIF1γ permet la fixation d’un résidu ubiquitine sur la protéine Smad4 la séparant ainsi de Smad2 et Smad3 et favorisant son export nucléaire.

Une interaction entre αB-crystallin et TIF1γ en présence de rTGF-β1 (Figure 61) a été démontrée par co-immunoprécipitation. Cette interaction était spécifique à TIF1γ puisque la deubiquitinase de Smad4, FAM/USP9x, n’interagissait pas avec αB-crystallin (Figure 61).

Figure 61 : αB-crystallin interagit avec la E3-ubiquitine ligase TIF1γ

Immunoprécipitation (IP) de TIF1γ (panneau supérieur) ou FAM/USP9x (panneau inférieur) dans les cellules A549 traitées avec de rTGF-β1 (12h) suivie par une immunodétection d’αB-crystallin. Contrôle Ig: un anticorps non-relevant a été utilisé. Input: extraits de cellules non immunoprecipités.

De plus, Le traitement avec le rTGF-β1 inhibait la mono-ubiquitination de Smad4, donc inhibait son export nucléaire dans les cellules A549 exprimant αB-crystallin. Au contraire, la mono-ubiquitination de Smad4 était conservée, favorisant son export nucléaire après stimulation au rTGF-β1 dans les cellules déplétées en αB-crystallin (Figure 62). Ce résultat est en accord avec nos précédents résultats montrant que l’inhibition d’αB-crystallin augmentait l'export nucléaire de Smad. Par conséquent, nous émettons l'hypothèse selon laquelle αB-crystallin interagirait avec TIF1γ et bloquerait le transfert de l'ubiquitine sur Smad4. Scramble αB- crystallin SiRNA Ig rTGF-β1 IP Ubiquitin αB SiR NA TGF-β1 Input WB : αB- crystallin Sramble αB- crystallin SiRNA Sra mbl e αB SiR NA Sra mbl e WB : Smad4 WB : Ubiquitin

Figure 62 : La mono-ubiquitination de Smad4 est conservée en cas d’inhibition d’αB-crystallin

IP des protéines ubiquitinées dans les cellules A549 transfectées avec un siRNA spécifique d’αB-crystallin ou un siRNA scramble (contrôle) suivie par une immunodétection de Smad4. Contrôle Ig: un anticorps non-relevant a été utilisé. Input: extraits de cellules non immunoprecipités

En outre, la surexpression d’αB-crystallin dans les cellules A549 était associée à une diminution de l’expression de TIF1γ au niveau protéique mais pas au niveau de l'ARN (Figure 63A). Par conséquent, l'interaction entre Smad4 et TIF1γ dans le noyau était réduite dans le cadre d'une surexpression d’αB-crystallin (Figure 63B).

Figure 63 : La surexpression αB-crystallin induit la diminution de la protéine TIF1γ

A) Les expressions d’αB-crystallin et TIF1γ étaient analysées par western blot et rt-PCR, dans les cellules A549 transfectées avec un vecteur αB-crystallin ou un vecteur vide. HSC70 servait de contrôle de charge.

B) IP de Smad4 dans les cellules A549 traitées avec un vecteur codant αB-crystallin ou un vecteur vide suivie par une immunodétection de TIF1γ. Contrôle Ig: un anticorps non-relevant a été utilisé. Input: extraits de cellules non immunoprecipités.

Cependant, la diminution de TIF1γ induite par la surexpression d’αB-crystallin n'était pas le résultat de sa dégradation par le protéasome, puisque le niveau de TIF1γ n’était pas restauré en présence d'inhibiteurs du protéasome comme le MG132 (Figure 64).

Figure 64 : La diminution de TIF1γ induite par αB-crystallin n’implique pas le protéasome.

Les expressions d’αB-crystallin et TIF1γ étaient analysées par western blot et rt-PCR dans les cellules A549 transfectées avec soit un vecteur αB-crystallin ou un vecteur vide et traitées ou non par le MG132, inhibiteur du protéasome. HSC70 servait de contrôle de charge.

Contrairement à l'effet observé après la surexpression d’αB-crystallin, son inhibition dans les cellules A549 augmentait le taux de protéine TIF-1γ (Figure 65A). En outre, in vivo l'absence d’αB-crystallin chez les souris KO conduisait à une surexpression de TIF-1γ dans des conditions fibrotiques (Figure 65B).

Figure 65 : L’inhibition d’αB-crystallin induit une surexpression de TIF1γ in vitro et in vivo

A) Les expressions d’αB-crystallin et TIF1γ dans les cellules A549 transfectées avec un siRNA spécifique d’αB- crystallin ou un siRNA scramble (contrôle) et traitées avec du rTGF-β1 pendant 24 heures étaient analysées par western blot. HSC70 seravit de contrôle de charge.

B) L’expression de TIF1γ était analysée par western blot sur des extraits protéiques de poumons de souris WT et KO traitées par la bléomycine ou du NaCl (J21). HSC70 servait de contrôle de charge.

Nous avons ensuite recherché la localisation de Smad4 par immunofluorescence sur des coupes de poumons de souris WT et KO ayant reçu de la bléomycine. Dans les poumons des souris WT qui présentaient une fibrose pulmonaire sévère, Smad4 était principalement présente dans les noyaux. Au contraire, dans les poumons de souris KO où la fibrose était fortement réduite, Smad4 se trouvait surtout au niveau du cytoplasme (Figure 66).

Ces résultats démontrent qu’en l'absence d’αB-crystallin, TIF-1γ est stabilisé, ce qui favorise la mono-ubiquitination de Smad4 et permet son export nucléaire inhibant ainsi l'activité pro- fibrotique de Smad4.

Figure 66 : In vivo Smad4 est exclue du noyau chez les souris KO pour αB-crystallin traitées à la bléomycine

La localisation nucléaire et cytoplasmique de Smad4 était confirmée par immunofluorescence sur des coupes de poumons de souris WT et KO traitées par la bléomycine (J21). Des images représentatives sont présentées (n = 5).

Nous proposons donc un modèle d’action d’αB-crystallin résumé dans ce schéma explicatif (Figure 67) :

Figure 67 : Mécanisme d'action hypothétique d’αB-crystallin sur la voie du TGF-β1 Smad4- dépendante.

Après stimulation au TGF-β1, l'interaction entre αB-crystallin et TIF1γ entraîne la baisse du taux de la protéine TIF1γ et ainsi inhibe la mono-ubiquitination de Smad4. En conséquence, Smad4 reste séquestrée dans le noyau où son activité pro-fibrotique est fonctionnelle. En revanche, en l'absence d’αB-crystallin, la mono- ubiquitination de Smad4 par TIF1γ et donc son export nucléaire sont favorisés.

Dans cette première partie, nous montrons qu’αB-crystallin joue un rôle crucial dans la voie du TGF-β1 Smad-dépendante. En effet, αB-crystallin est capable d’interferer avec le complexe TIF1γ/Smad4 afin d’empêcher la monobiquitination de Smad4 par TIF1γ et son export nucléaire. Ainsi, dans le poumon fibreux, où αB-crystallin est surexpreimée probablement durant la phase d’inflammation précédant la fibrose, Smad4 reste séquestrée dans le noyau des cellules épithéliales et des fibroblastes, permettant une activation constante de la voie du TGF-β1 dans ces cellules et favorisant la fibrogenèse. En condition de fibrose, l’absence d’αB-crystallin protége les souris KO de la fibrose en favorisant l’export nucléaire de Smad4 et inhibant ainsi la voie du TGF-β1. Ainsi le phénomène d’EMT des cellules épithéliales et leur transformation, ainsi que celle des fibroblastes, en myofibroblastes est limitée chez les souris déficientes pour αB-crystallin qui présentent donc une accumulation de collagène diminuée par rapport aux souris sauvages après induction de fibrose par la bléomycine, l’AdTGF-β1 et l’AdIL-β. L’inhibition d’αB-crystallin apparaît ainsi comme une nouvelle stratégie thérapeutique potentielle pour lutter contre les maladies fibrosantes.

Rôle de la petite protéine de stress αB-crystallin

sur la fibrose pleurale

La deuxième partie de cette thèse n’a pas encore été soumise pour publication.

Le but de ce travail était de montrer l’implication d’αB-crystallin dans la fibrose pleuro- pulmonaire. La FPI débute aux bases et à la périphérie des poumons dans les régions sous- pleurales.

Nous avons utilisé deux modèles de fibrose pleurale chez la souris par injection intra-pleurale d’adénovirus codant pour le TGF-β1 ou de bléomycine combinée à des particules de carbone. (11). Chez les souris WT, cette fibrose ne se limitait pas à la plèvre et une accumulation de collagène a pu être confirmée dans la région sous-pleurale comme cela peut être observé dans la FPI. Les souris KO étaient protégées de la fibrose pleurale induite par les adénovirus codant pour le TGF-β1 ou la bléomycine combinée à des particules de carbone. Dans ces modèles in vivo, les cellules mésothéliales subissaient une EMT et envahissaient la parenchyme pulmonaire chez les souris WT mais pas chez les souris KO.

Par notre travail nous démontrons qu’αB-crystallin, dans les cellules mésothéliales pleurales comme dans les cellules épithéliales et les fibroblastes, favorisait la localisation nucléaire de Smad4, activant ainsi la voie du TGF-β1 et l’EMT des cellules de la plèvre. Les souris déficientes pour αB-crystallin étaient protégées de la fibrose pleurales in vitro et in vivo. AB- crystallin inhibait l’EMT des cellules pleurales les empêchant ainsi de migrer au sein du parenchyme pulmonaire comme observé lors de la FPI chez l’homme.

L’inhibition d’αB-crystallin pourrait être une stratègie thérapeutique interessante pour lutter contre la fibrose pleurale mais également contre l’initiation et la progression de la FPI chez l’homme.

Ce travail est présenté dans les annexes à la page 222 sous la forme que nous espérons soumettre à l’European Respiratory Journal ou l’American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology.

I- Méthodes

Les méthodes utilisées pour cette partie de notre projet de thèse sont majoritairement identiques à la partie précédente. Dans ce paragraphe, nous détaillerons seulement les méthodes d’injection et d’induction de fibrose qui diffèrent de la partie précédente.