αB-crystallin régule l'expression du TGF-β1 et de ses gènes cibles in vivo et in vitro

vivo et in vitro.

Afin de comprendre pourquoi l’expression du TGF-β1 ainsi que la fibrose en résultant étaient limitées chez les souris αB-KO, nous avons étudié le rôle αB-crystallin sur la voie TGF-β1. Pour mettre en évidence spécifiquement un rôle potentiel d’αB-crystallin sur la voie du TGF-

β1 in vivo, notre modèle murin basé sur l'injection intratrachéale d'adénovirus codant pour le

gène TGF-β1 chez les souris KO et WT (AdTGF) a été utilisé.

Un test ELISA et une analyse par rt-PCR des ARN totaux de poumons ont montré que les souris WT et KO sont capables d’exprimer l’AdTGF de manière similaire. En effet, le taux d’expression du TGF-β1 humain exogène (venant des adénovirus) était identique chez les souris WT et KO au niveau protéique et ARN (Figure 49A-B). Cependant, l’absence d’αB- crystallin chez les souris KO perturbait l'expression de l'ARN du TGF-β1 endogènes ainsi que celle de PAI-1, une protéine régulée par la voie TGF-β1 (345, 346), Figure 49B). Il est intéressant de noter que l'expression d’αB-crystallin était significativement augmentée en présence de TGF-β1 chez les souris WT (Figure 49B).

En outre, in vivo, la surexpression transitoire du TGF-β1 induisait une forte augmentation de l'expression du procollagène chez les souris WT mais pas chez les souris KO pour αB- crystallin (Figure 49B).

Figure 49 : Les souris αB-KO présentent une voie de signalisation du TGF-β1 déficiente

A) Le TGF-β1 total a été mesuré par un test ELISA qui détecte à la fois le TGF-β1 humain et celui de rongeurs. Les mesures ont été effectuées sur les LBA de souris WT et KO, 7 jours après administration intratrachéale d’AdTGF ou d’AdDL. Moyenne ± SEM, ** p ≤ 0,01, n = 6/groupe.

B) Les niveaux d'ARN du TGF-β1 humain, TGF-β1 de souris, PAI-1, procollagen et αB-crystallin ont été analysés par PCR quantitative sur les tissus pulmonaires de souris WT et KO, 7 jours après administration intratrachéale d’AdTGF-β1 ou d’AdDL. Moyenne ± SEM, * p ≤ 0,05 et ** p ≤ 0,01, n = 6/groupe.

Nous avons ensuite étudié le rôle d’αB-crystallin sur les gènes cibles du TGF-β1 in vitro. Comme les cellules alvéolaires épithéliales hyperplasiques semblaient surexprimer fortement

αB-crystallin dans les poumons de patients atteints de FPI (Figure 38), nos expériences ont été

conduites sur des cellules épithéliales pulmonaires. Nous avons d'abord démontré dans les cellules A549, que le traitement au TGF-β1 recombinant (rTGF-β1) induisait une augmentation de l’expression d’αB-crystallin à 12 heures d'exposition (Figure 50).

Figure 50 : αB-crystallin est surexprimée par un traitement au rTGF-β1

Des cellules épithéliales pulmonaires humaines A549 ont été soit traitées avec du rTGF-β1 (10 ng/ml) soit laissées sans traitement. L’expression d’αB-crystallin a été analysée par Western blot. HSC70 a servi de contrôle de charge.

Grâce à l’inhibition d’αB-crystallin sur les cellules A549 par des SiRNA, nous avons constaté que l'inhibition de l'expression d’αB-crystallin diminuait considérablement l’expression des gènes PAI-1 (52 fois) et TGF-β1 (7 fois, Figure 51A), ce qui suggère un effet direct d’αB- crystallin sur la boucle d'auto-activation du TGF-β1. En outre, la capacité connue du TGF-β1 à inhiber l’E-cadhérine dans les cellules épithéliales (144) était contrée par l’inhibition d’αB- crystallin (figure 51A). De plus, la surexpression d’αB-crystallin dans les cellules A549 augmentait considérablement l’expression du TGF-β1 et de PAI-1 (Figure 51B). La surexpression d’αB-crystallin augmentait également l’expression d’α-SMA (Figure 51B), comme habituellement observé en présence de rTGF-β1 (144). Des résultats similaires ont également été trouvés au niveau protéique (Figure 51C).

Figure 51 : αB-crystallin régule l’expression des gènes cibles du TGF-β1 dans les cellules A549

A) Les expressions des gènes αB-crystallin, TGF-β1, E-cadhérine et PAI-1 ont été analysées par PCR quantitative après traitement au rTGF-β1 des cellules A549 transfectées avec soit un siRNA scramble (contrôle) soit un siRNA spécifique pour αB-crystallin (24h, 10 ng/ml) . Moyenne ± SEM, * p ≤ 0,05 et ** p ≤ 0,01, n = 3/groupe.

B) Les niveaux d'ARN des gènes TGF-β1, α-SMA et PAI-1 ont été analysés par PCR quantitative sur les cellules A549 transfectées par un vecteur vide ou un plasmide codant pour αB-crystallin (24h). Moyenne ± SEM, * p ≤ 0,05 et ** p ≤ 0,01, n = 3/groupe.

C) Les expressions de l’E-cadhérine, PAI-1, et αB-crystallin ont été analysées par western blot après traitement au rTGF-β1 (24h ou 48h, 10ng/ml) dans les cellules A549 transfectées avec soit un siRNA scramble (contrôle) soit un siRNA spécifique pour αB-crystallin. HSC70 a servi de contrôle de charge (panel haut).

Les expressions de α-SMA et αB-crystallin ont été analysées par western blot dans les cellules A549 transfectées avec soit un vecteur vide (contrôle) soit un vecteur αB-crystallin. HSC70 a servi de contrôle de charge.

Pour confirmer ces résultats dans un modèle plus physiologique, des cellules primaires épithéliales de type II (AEC II), isolées à partir de souris WT et KO stimulées ou non avec du rTGF-β1, ont été utilisées. Comme attendu, le rTGF-β1 induisait l’expression, chez les AECII WT, du TGF-β1, de l’α-SMA, de PAI-1 et du facteur de transcription impliqué dans l’EMT, Snai2 (Slug, Figure 52). En revanche, les expressions de ces mêmes gènes étaient considérablement réduites en l'absence d’αB-crystallin dans les AEC II KO (Figure 52).

Figure 52 : αB-crystallin régule l’expression des gènes cibles du TGF-β1 dans les cellules épithéliales primaires

Les expressions des gènes αB-crystallin, TGF-β1, α-SMA, PAI-1 et Snai2 ont été analysées par PCR quantitative sur des AECII non traitées ou traitées avec du rTGF-β1 (6h, 10 ng/ml). Moyenne ± SEM, * p ≤ 0,05 et ** p ≤ 0,01, n = 7/groupe.

De manière intéressante, dans des fibroblastes primaires issus de souris WT et KO cultivées en présence ou en absence de rTGF-β1, le manque d’αB-crystallin diminuait significativement l'expression du TGF-β, de l’α-SMA, de PA1-1, mais aussi de procollagène 1 (Figure 53).

Nous concluons de ces résultats, qu’αB-crystallin pourrait favoriser la voie de signalisation du TGF-β1 expliquant ainsi son implication dans la fibrose pulmonaire.

Figure 53 : αB-crystallin régule l’expression des gènes cibles du TGF-β1 dans les fibroblastes primaires

Les expressions des gènes αB-crystallin, TGF-β1, α-SMA, PAI-1 et procollagène ont été analysées par PCR quantitative sur les fibroblastes primaires de souris WT et KO après traitement au rTGF-β1 (24h). Moyenne ± SEM, * p ≤ 0,05 et ** p ≤ 0,01, n = 8/groupe.