Étude de l’interaction des polyélectrolytes avec l’ADN

Comme nous l’avons vu dans l’introduction, les CPEs cationiques offrent des propriétés optiques uniques qui peuvent être mises à profit pour la détection de biomolécules telles que l’ADN et les protéines.10

Pour la plupart de ces capteurs à base de CPEs, la détection des substances chimiques ou d’intérêt biologique est reliée à une

139

modification des propriétés optiques et/ou électroniques du polymère à travers une modification de sa conformation et/ou des interactions interchaînes.²⁹ Toutefois, dans le cas de l’ADN, relativement peu d’études ont été menées sur l’identification des mécanismes régissant l’association et l’auto-assemblage des complexes ADN-CPE et sur la structure de ces complexes alors que ces informations sont essentielles pour établir une relation entre la structure et les propriétés.¹⁶ Une compréhension fine de cette relation permettrait de mieux contrôler les propriétés pour viser une application biomédicale spécifique.

Schéma 3-2 : CPEs du type P3HT-R (triméthylammonium, méthylimidazolium,

triméthylphosphonium et pyridinium) et séquences ADN utilisés dans cette étude.

Schéma 3-3 : Nucléotides composant les séquences d’ADN utilisés dans cette étude..

Ainsi, l’objectif de cette partie visait à synthétiser une série de poly(3-hexylthiophène) portant des groupements cationiques sur les chaînes latérales de diverses natures afin de comprendre l’influence de la nature du groupement chargé et de la

140

conformation du squelette polythiophène sur l’auto-assemblage avec l’ADN en solution aqueuse. Ce travail a été effectué en collaboration avec le Dr. Mathieu Surin et le Dr. Jenifer Rubio-Magnieto du laboratoire de Chimie des Matériaux Nouveaux de l'Université de Mons. Dans ce but, quatre polyélectrolytes avec quatre groupements cationiques différents (triméthylammonium, N-méthylimidazolium, pyridinium et triméthylphosphonium) (Schéma 3-2) ont été préparés à partir du poly(3-bromohexylthiophène) (P3HT-Br). Leur synthèse a été décrite dans le chapitre 2. Le poly(3-bromohexylthiophène) de départ utilisé pour synthétiser les CPEs avait les caractéristiques suivantes : Mn = 13500 g.mol^-1 et Ð = 1,26 (P3HT-Br2).³⁰ Afin d’effectuer nos études, trois types d'ADN ont été utilisés: deux ADN simple brin (ssDNAd(T)20 et ssDNAd(R)20) et un ADN double brin de séquence aléatoire (dsDNAd(R)20) dont les séquences en nucléotides sont décrites ci-dessus.

1. Interaction entre un ADN simple brin de vingt thymines (ssDNAd(T)20) et les P3HT-R :

Chaque CPE a été mélangé dans un rapport molaire 1:1 avec un ADN simple brin de vingt Thymine (ssDNAd(T)20) (Schéma 3-2) dans une solution tampon (pH 7,4) (voir partie expérimentale). Les spectres UV-Vis. des complexes ainsi obtenus montrent un déplacement bathochrome du maximum d'absorption par rapport aux CPE purs dont la valeur dépend de la nature du cation utilisé (Δλmax allant de 12 à 28 nm, Tableau 3-7).

Oligonucléotide Polymère UV-vis P3HT-R λabs.max (nm) UV-Vis P3HT-R/ADN λabs.max (nm) Δλabs.max (nm) ssDNAd(T)20 P3HT-Im 445 473 +28 ssDNAd(T)20 P3HT-Py 464 476 +12 ssDNAd(T)20 P3HT-NMe3 449 473 +24 ssDNAd(T)20 P3HT-PMe3 450 466 +16

Tableau 3-7 : Maxima d'absorption pour les P3HT-R et les P3HT-R/ssDNAd(T)₂₀,rapport molaire 1:1 en solution tampon à 20°C (pH 7,4).

Ce déplacement du maxima d'absorption vers le rouge est attribué à un changement de la conformation du polymère p-conjugué lors de sa complexation avec le brin d’ADN. Une planarisation du squelette p du CPE a lieu et donc, une meilleure conjugaison est

141

obtenue. Cet effet a été observé pour d'autres structures ADN-CPE et interprété comme la formation d'un complexe appelé "duplex" par Leclerc et al.^12a Un déplacement du maximum d’absorption de l’ADN situé à 266 nm est également noté suggérant que la conformation du ssDNAd(T)20 est également modifiée lors de la formation du duplex.

Figure 3-21 : Spectres CD à température ambiante de ssDNA(T)20/P3HT-R (1:1), en solution tampon (pH = 7,4).

Afin d’examiner plus en détail ce comportement et obtenir des informations sur les conformations des complexes supramoléculaires ADN-CPE formés, une étude par dichroïsme circulaire (CD) de ces composés a été menée. L’ADN simple-brin ssDNAd(T)20 présente une bande positive centrée à 275 nm et une bande négative à 245 nm (Figure 3-21).³¹ Les polyélectrolytes P3HT-R étant quant à eux achiraux, ils ne présentent pas de signal en CD. Pour le mélange ssDNAd(T)20/P3HT-R (1:1), l'intensité du signal diminue entre 210 et 300 nm (zone d'absorption de l'ADN) quelque soit la nature du CPE. Aucun changement n’est noté ni dans la forme ni dans la position de la bande (Figure 3-21). Nous pouvons aussi constater la présence d'un dichroïsme circulaire induit (ICD) entre 400 et 600 nm (zone d'absorption des CPEs synthétisés) (Figure 3-21). Le signe du spectre ICD du complexe ADN-CPE suggère que le polyélectrolyte a une conformation chirale préférentiellement hélicoïdale droite (duplex chiral). L'intensité de ces ICD varie avec la nature des groupements cationiques présents sur le polymère dans l’ordre suivant: PMe3> NMe3> Im> Py; le P3HT-Py ayant un signal nul. Les intensités les plus élevées de l’ICD sont observées pour les plus petits cations avec une charge localisée (NMe3 et

142

PMe3). Ainsi, il apparaît clairement que l'effet de la localisation de la charge dans les groupements cationiques CPEs est important dans le processus d'auto-assemblage chiral. Il joue un rôle dans les interactions cations-p(base) et dans la structuration du polymère avec le simple brin d’ADN lorsqu’ils sont liés, permettant la formation du complexe chiral.

Il est intéressant de noter que ce type d’ICD a déjà été décrit pour les interactions entre l'ADN et des oligomères π-conjugués,32

entre des sucres et des polythiophènes.³³ Dans ces cas, l’ICD est due à la formation de liaisons hydrogènes entre les molécules p-conjuguées et la biomolécule. Ce phénomène a également été observé pour un ADN double brin et un poly(cobaltoceniuméthylène). Dans ce cas, il a été alors proposé que le polymère organométallique se lie avec l'ADN par interactions électrostatiques.³⁴

2. Interaction entre ADN simple et double brin (respectivement ssDNAd(R)20

et dsDNAd(R)₂₀) et P3HT-R :

Pour étudier les effets de la séquence et de la topologie de l’ADN sur la chiralité des structures formées, des ADN simple- et double-brin (ssDNAd(R)20 ou dsDNAd(R)20) présentant des séquences aléatoires (Schéma 3-2) ont été mélangés dans un rapport molaire 1:1 avec le P3HT-PMe3 (Tableau 3-8). Le choix de ce dernier est motivé par sa meilleure réponse en dichroïsme circulaire comparée aux autres CPEs. Le spectre d’absorption UV-Visible du mélange ssDNAd(R)20/P3HT-PMe3 conduit à un déplacement bathochrome du maximum d’absorption du P3HT-PMe3 plus élevé (Dλmax = 36 nm) en comparaison du complexe formé avec ssDNAd(T)20 (Δλmax = 16 nm ssDNAd(T)20/P3HT-PMe3).

Oligonucléotide Polymère UV-vis P3HT-R (nm)

UV-Vis P3HT-R/ADN λabs.max (nm) Δλabs.max (nm)

ssDNAd(R)20 P3HT-PMe3 450 486 +36

dsDNAd(R)20 P3HT-PMe3 450 493 +43

Tableau 3-8 : Maxima d'absorption pour le P3HT-PMe3, le P3HT-PMe3/ssDNAd(R)20

(1:1) et le P3HT-PMe3/dsDNAd(R)20 (1:1) en solution tampon à 20°C (pH 7,4).

De manière assez surprenante, le spectre de CD du complexe ssDNAd(R)20 /P3HT-PMe3 présente une bande négative à environ 254 nm et une bande positive à 220 nm dans la gamme où absorbe l'ADN. Ce comportement diffère de celui du ssDNAd(R)20 ayant une structure en hélice droite en solution et, pour lequel le spectre CD montre une bande

143

positive centrée à 275 nm et une bande négative à 245 nm (Figure 3-22).³¹ De la même manière, le spectre de CD du complexe ssDNAd(R)20/P3HT-PMe3 présente une bande négative centrée autour de 515 nm et une bande positive à près de 443 nm. Le signe des bandes est donc complètement inversé par rapport à celui du complexe ssDNAd(T)20/P3HT-PMe3.

Figure 3-22 : Spectres CD à température ambiante de ssDNA(R)20/P3HT-PMe3 et dsDNA(R)20/P3HT-PMe3 en solution tampon (pH = 7,4).

Ces résultats indiquent que l’auto-assemblage du P3HT-PMe3 avec ssDNAd(R)20

modifie fortement la conformation de l'ADN de départ. Le spectre d'ICD résultant a alors une signature préférentielle d’une hélice gauche contrairement au spectre du ssDNAd(T)20/P3HT-PMe3. En effet, les bases purines présentes dans l’ADN simple brin ssDNAd(R)20 possédant un plan conjugué plus large que les thymines, elles interagissent plus fortement avec le polymère par des interactions de type π (π-π et cations-π). Cette interaction plus forte est en accord avec le déplacement vers le rouge plus important des bandes d'absorption du polymère lorsque celui-ci est complexé avec ssDNAd(R)20 plutôt qu’avec ssDNAd(T)20.

Dans le cas de l'oligonucléotide double-brin dsDNAd(R)20, le spectre d'ICD du mélange dsDNA(R)20/P3HT-PMe3 (1:1) montre la même allure que celle observée précédemment pour le complexe ssDNAd(R)20/P3HT-PMe3 (Figure 3-22). Au niveau de la bande d'absorption de l'ADN, le spectre CD du dsDNA(R)20/P3HT-PMe3 est plus proche du spectre CD de l'ADNpur, en conformation d'hélice B, que le spectre CD du mélange ssDNAd(R)20/P3HT-PMe3. Cette différence peut s’expliquer par la plus grande affinité des

144

CPE vis-à-vis des ssADN en comparaison des dsADN.³⁵ Cette affinité supérieure peut être attribuée à l'hydrophobie plus élevée de l'ADN simple brin combinée à l’interaction du polymère via des interactions monomères-π (base). Dans le cas de l'ADN double brin, ces interactions sont peu probables, de part l'hybridation de l'ADN.

3. Effet de la température et du rapport molaire:

Pour mieux comprendre les processus d'auto-assemblage, nous avons étudié les effets du rapport molaire et de la température sur les propriétés optiques du complexe ADN/P3HT-R. Tout d'abord, nous avons suivi la variation du maximum d’absorption (Δλmax = λabs(P3HT-PMe3/ssDNAd(R)20) - λabs(P3HT-PMe3)) dans le mélange ssDNAd(R)20/P3HT-PMe3 en fonction de la composition (Figure 3-23).

Figure 3-23 : Variation du maximum d'absorption (Δλmax) pour le polymère en fonction de la composition du P3HT-PMe3 dans une solution tampon contenant un mélange ssDNAd(R)20/P3HT-PMe3.

Le mélange ssDNAd(R)20/P3HT-PMe3 a un maxima d'absorption déplacé vers le rouge en fonction de la composition du mélange (λabs(P3HT-PMe3) ~ 450 nm). Lorsque la composition de P3HT-PMe3 est supérieure à ~0,45, le Δλmax diminue. Cette valeur est cohérente avec l'équilibre des charges : le polymère contient deux fois plus de charges (en moyenne, un nombre de 47 groupements latéraux chargés positivement a été estimé à partir des résultats de spectrométrie de masse MALDI-TOF)³⁶ que l’oligonucléotide utilisé (20 groupements phosphodiester chargés négativement) conduisant donc à ce rapport de charges ssADN/P3HT-R d’environ 0,43. Ce résultat démontre que les interactions

145

électrostatiques jouent un rôle majeur dans l’affinité de liaison existante entre le polymère et l'ADN.

La figure 3-24 montre que les spectres CD du mélange ssDNAd(T)20/P3HT-PMe3

sont similaires, quelques soit le rapport molaire. Le signal ICD du polymère diminue de 0°C à 40°C et à plus haute température, disparaît (Figure 3-24). En effet, le comportement dynamique de l'oligothymine avec la température empêche l'association avec le polymère.

Figure 3-24 : Spectres de CD de mélanges ssDNAd(T)20/P3HT-PMe3 à différent ratio a) 1:2, et b) 1:3 à différentes températures; et c) 1:N à 20°C. Les mesures ont été effectuées en solution tampon (pH = 7,4).

146

Pour le mélange ssDNAd(R)20/P3HT-PMe3 (1:1), nous observons des changements importants dans les spectres de CD lors du chauffage pour les bandes correspondantes à l'absorption du P3HT-PMe3 (entre 420-550 nm) (Figure 3-25a et 3-25c). Ainsi, entre 0 et 30°C, une bande négative centrée autour de 515 nm et une bande positive à environ 443 nm sont observées alors qu’aux alentours de 40°C, le signe de ces signaux est inversé du (-) vers le (+(-) (Figure 3-25c(-). Il est également noté un déplacement de la bande à 515 nm vers 502 nm ainsi que l’apparition d’une bande positive à 567 nm qui augmente en intensité et se déplace vers 550 nm. La température plus élevée conduisant à un comportement plus dynamique du brin d’ADN affaiblit les interactions monomères-p(base) présentes entre le polymère et les bases purines qui composent le brin d'ADN. Ainsi, on peut observer à 80°C une réorganisation conformationnelle qui rappelle celle du mélange ssDNAd(T)20/P3HT-PMe3, on a alors une conformation préférentiellement à droite.

Figure 3-25 : Spectres de CD pour xsDNAd(R)₂₀ à pH 7,4. a) et c) ssDNAd(R)20 /P3HT-PMe3, rapport molaire 1:1. b) et d) dsDNAd(R)20/P3HT-PMe3, rapport molaire 1:3.

147

Pour le complexe avec l'ADN double brin, l'effet de la température est très différent selon le rapport molaire du mélange dsDNAd(R)20/P3HT-PMe3 utilisé. En effet, pour un rapport molaire 1:1, la chiralité induite pour le polymère disparaît quand la température est supérieure à 40°C (Figure 3-26).

Figure 3-26 : Spectres de CD, en fonction de la température, pour dsDNAd(R)20 /P3HT-PMe3 (1:1) en solution tampon.

Lorsque l'on ajoute du P3HT-PMe3 pour avoir un rapport molaire de dsDNAd(R)20/P3HT-PMe3 1:3, le spectre de dichroïsme circulaire est très différent (Figure 3-26). Jusqu'à 60°C, l'intensité des bandes positives (~445 nm) et négatives (~510 nm) augmente. A 80°C, une inversion du signe des bandes et une diminution de l'intensité sont notées. Au-dessus de la Tf (57°C), les brins sont susceptibles de se séparer pour former des ADN simple brin. Le polymère étant en excès, des complexes ssDNAd(R)20/P3HT-PMe3

pourront donc être formés.

V. Conclusion

Dans ce chapitre, les propriétés thermiques et le comportement en solution de copolymères diblocs amphiphiles (P3HT-b-CPE) contenant un bloc hydrophobe (P3HT) et un hydrophile portant des groupes cationiques différents (CPE) ont été étudiés. Les propriétés thermiques de ces copolymères indiquent une signature claire de l'architecture

148

« copolymère dibloc ». En effet, la présence d'une température de transition vitreuse causée par le bloc CPE et une température de fusion induite par la présence du bloc P3HT sont notées. En outre, il a été montré que la nature du bloc CPE affecte la valeur de la Tg et dans une moindre mesure, la température de fusion du bloc P3HT, plus particulièrement dans le cas du P3HT-b-P3HTNMe3. L’étude du comportement en solution a ensuite été effectuée par spectroscopie d’absorption et d’émission, DLS et SANS. Ainsi, il a été observé que le diamètre des particules déterminé par DLS était plus important dans les mélanges MeOH/H2O. Dans ce mélange de solvant, l’agrégation des chaînes de polymère est réduite. Les chaînes de polymère dans les agrégats adoptent une conformation moins repliée et absorbent une plus grande quantité de solvant ce qui conduit à un gonflement de la structure et donc, à une augmentation du diamètre hydrodynamique. Ces résultats ont été confirmés par les études SANS que nous avons ensuite réalisées. Il a été également montré que les P3HT-b-CPEs forment des agrégats cylindriques de type cœur/coquille en solution. La structure des agrégats observés dépend de la nature du solvant dans lequel est dispersé le copolymère. L'étude AFM des films formés à partir de ces copolyélectrolytes en solution a révélé que la structure des agrégats en solution peut être transférée dans des films minces.

Ensuite, les homopolyélectrolytes, copolyélectrolytes à bloc et statistiques synthétisés dans le chapitre 2 ont été utilisés en tant que matériaux transporteurs d’électrons dans des cellules organiques solaires. L’introduction de ses polyélectrolytes dans une couche interfaciale entre la couche photoactive et la cathode a permis une amélioration significative (~20 à 30%) des performances de la cellule. Il a été démontré que les polyélectrolytes intégrant des contre-ions bromure présentent des performances inférieures à celle des polyélectrolytes intégrant des contre-ions TFSI. En outre, le caractère hydrophile des anions bromures précédemment montré en flash DSC complique la reproductibilité des résultats et leur analyse fine. Toutefois, il apparaît clairement que la nature du contre-ion joue un rôle fondamental dans les performances de cette couche interfaciale. Des mesures supplémentaires (angle de goutte, température de transition vitreuse…) ainsi que l’extension de cette étude à d’autres contre-ions à base de surfactants permettant de jouer sur l’organisation sont actuellement en cours. Il a également été montré que les copolymères à blocs conduisent à de meilleurs résultats que leurs congénères homopolyélectrolytes comme l'avait précédemment démontré Bazan et al.⁴ La masse molaire du polymère ayant été identifiée comme un paramètre important dans ce type

149 d’applications,7

des polyélectrolytes de masse plus élevée ont été synthétisées pour leur permettre atteindre une efficacité maximale.

Enfin, dans une dernière partie, les polyélectrolytes synthétisés ont été utilisés afin de comprendre l’influence de la nature du groupement chargé et de la conformation du squelette polythiophène sur l’auto-assemblage avec l’ADN. Les résultats obtenus montrent que l'auto-assemblage de l'ADN avec les CPEs implique une restructuration qui va bien au-delà d'une simple planarisation du squelette p-conjugué du polymère, et conduit à des structures supramoléculaires chirales avec des signatures en dichroïsme circulaire induit spécifiques. En effet, il a été observé que la séquence et topologie des brins d’ADN utilisés jouaient un rôle prépondérant en modifiant la nature de l’interaction ADN-CPE. La nature du cation et plus particulièrement, la présence dans ce dernier d’une délocalisation de la charge a également été identifiée comme un paramètre important régissant l'auto-assemblage ADN-CPE.

Ces résultats montrant que l'auto-assemblage entre les CPE et l'ADN donne une structuration chirale spécifique en fonction de la séquence sont importants et très intéressants pour des applications en tant que biocapteurs. D’autres études (fluorescence, calculs ab initio…) sont actuellement en cours pour comprendre encore plus en détails ces interactions.

VI. Partie expérimentale :

Préparation des oligonucléotides (ODN). La solution tampon est préparée en utilisant du

tris(hydroxymethyl)aminométhane ((HOCH2)3CNH2), de l’EDTA et de l’eau Milli-Q. Les oligonucléotides sont dissouts dans la solution tampon à une concentration de 100 µM. La solution obtenue est centrifugée durant 2 minutes à 2000 tours.min^-1. 20 µL de cette solution seront utilisés pour préparer les différents mélanges d’ADN. 280 mL de solution tampon sont ensuite ajoutés à chaque mélange afin d’obtenir un volume final de 300 mL.

Préparation des structures supramoléculaires ADN/CPE. Les mélanges ADN/CPE sont

préparés dans la solution tampon décrite précédemment. La concentration exacte de l'ADN est déterminée par spectroscopie d'absorption UV-Visible à 25 °C en utilisant le coefficients d'extinction molaire (ε260) de chaque ADN, qui sont respectivement de 162 600 L.mol^-1.cm^-1, 196 100 L.mol^-1.cm^-1et 391 800 L.mol^-1.cm^-1 pour ssDNAd(T)20,

150

ssDNAd(R)20 et dsDNAd(R)20. Les échantillons de CPE sont également dissous dans une solution tampon TE (tampon Tris 20 mM et EDTA 1 mM). Les deux composés sont agités vigoureusement pendant 2 min puis sont laissés au repos durant 30 min avant analyse.