Institut de Pharmacie

Institut de Pharmacie

Service de Chimie Pharmaceutique Organique Professeur J. Nève

CONTRIBUTION A L’ETUDE DU POUVOIR ANTIOXYDANT DE DIVERS AGENTS D’INTERET THERAPEUTIQUE : CIBLAGE DU SYSTEME MYELOPEROXYDASE / PEROXYDE

D’HYDROGENE / CHLORURE

Par

Pierre Van Antwerpen Pharmacien

Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur en Sciences Pharmaceutiques

Bruxelles, juin 2006

Je tiens tout d’abord à remercier Monsieur le Professeur Jean Nève de m’avoir accueilli au sein de son service. Je le remercie de m’avoir fait confiance et d’avoir été présent aussi souvent que possible malgré ses tâches administratives et ses multiples représentations. Son soutien indéfectible mâtiné de quelques encouragements a été précieux dans l’élaboration et l’évolution de ce travail.

J’aimerais aussi remercier Patrick Moreau, notre technicien. Le travail important élaboré au cours de cette thèse n’aurait pas pu voir le jour sans son aide précieuse, son envie de travailler et d’apprendre. Beaucoup des manipulations effectuées ont été réalisées avec son concours et des liens amicaux ont pu ainsi se tisser entre nous.

Je remercie également les membres du service de Chimie Pharmaceutique Organique que j’ai côtoyé tout au long de cette thèse : Marie pour sa bonne humeur et ses conseils HPLC, Michèle avec ses plats mitonnés qui embaumaient le service à midi, le Docteur Michel Gelbke pour son aide dans l’interprétation de la RMN, les différents post-

doctorants et surtout mon Supérieur Hiérarchique Direct, le Professeur-Assistant François Dufrasne. Ce personnage attachant allie bonhomie, jeux de mots, bougonneries légendaires et pédagogie ; ce fut un réel plaisir de travailler et d’apprendre la chimie avec lui.

Je pense aussi aux assistants, techniciens et doctorants que j’ai pu rencontrer au sein de notre Institut et que je remercie pour ces années passées ensemble.

Je désire également remercier le Docteur Karim Zouaoui Boudjeltia pour la

collaboration que nous avons pu créer entre nos deux laboratoires. Notre complémentarité et notre goût pour la cuisine méditerranéenne ne sont certainement pas étrangers à ce fait.

Mais j’ai pu également apprécier son jusqu’au-boutisme, sa franchise et ses qualités de chercheur. Cette collaboration m’a permis également de faire la connaissance de Sajida Babar et du Docteur Ilham Legssyer que je remercie pour leur aide et le travail qu’elles accomplissent. Je remercie également les Professeurs Michel Vanhaeverbeek et Jean Ducobu pour la confiance qu’ils m’ont témoignée et l’attention qu’ils portent à nos travaux.

Je tiens aussi à remercier le Docteur Martine Prévost pour son travail de modélisation de la myéloperoxydase et les discussions constructives qui en ont résulté. Je voudrais la remercier également pour son aide dans les représentations graphiques de la MPO de ce manuscrit.

montrer son enthousiasme et nous encourager dans notre recherche.

Enfin, mes pensées vont à mes proches qui m’ont soutenu tout au long de ce travail : ma famille en Belgique et bien évidemment ma Maman que j’ai mise a contribution pour les corrections ; ma famille au Maroc, qui par les bienfaits d’internet, a pu me témoigner ses marques de sympathie et d’encouragements et surtout Jamila qui m’a toujours encouragé et avec qui je passe des moments et une vie agréables.

Pour terminer, je dédie ce manuscrit à mon père car je sais qu’il aurait apprécié ce travail et à ma fille pour la joie qu’elle nous procure.

Le corps humain est le siège constant de la synthèse d’espèces oxygénées réactives dont la production contrôlée est indispensable au bon fonctionnement de l’organisme.

Cependant dans de nombreuses pathologies, il arrive qu’une production exagérée et/ou incontrôlée de ces espèces aboutisse à des dégâts oxydatifs. Parmi les mécanismes de production d’espèces oxydantes, le système myéloperoxydase / peroxyde d’hydrogène / chlorure détient une place importante. Ceci est notamment la conséquence de la grande quantité de MPO présente dans les neutrophiles, pouvant être libérée très rapidement lors de l’inflammation. De plus l’acide l’hypochloreux synthétisé par ce système est un très bon oxydant.

Nous avons étudié l’impact des anti-inflammatoires non-stéroïdiens (oxicams, nimésulide et acide flufénamique) sur trois espèces oxygénées réactives : le radical hydroxyle, le peroxyde d’hydrogène et l’acide hypochloreux. Les premiers résultats montrent le faible pouvoir anti-oxydant des molécules testées et la nécessité de concentrer notre recherche sur le système myéloperoxydase / peroxyde d’hydrogène / chlorure, responsable de la synthèse de l’acide hypochloreux. Lors de l’étude de l’inhibition de ce système, il est ressorti que l’acide flufénamique est un bon inhibiteur de la myéloperoxydase car il inhibe la synthèse de l’acide hypochloreux en étant directement oxydé par l’enzyme.

En raison de l’efficacité de l’acide flufénamique, cette molécule a été testée dans un modèle d’oxydation des lipoprotéines de basse densité (LDL) par le système myéloperoxydase / peroxyde d’hydrogène / chlorure en comparaison avec des thiols tels que la N-acétylcystéine et son sel de lysine, le glutathion et le captopril. Les résultats montrent une perte importante du pouvoir d’inhibition de l’acide flufénamique dans ce modèle alors que les thiols et la N-acétylcystéine en particulier, présentent une efficacité non négligeable. Ce phénomène pourrait être attribué à la capacité de la myéloperoxydase de se fixer sur les lipoprotéines, ce qui pourrait masquer l’entrée du site catalytique. Dans ces conditions, la taille de la molécule devient un facteur crucial dans l’inhibition de l’oxydation des lipoprotéines de basse densité et la N-acétylcystéine apparaît dès lors comme un inhibiteur puissant dont les résultats en font un excellent candidat dans des études d’intervention visant la diminution du risque de pathologies cardiovasculaires chez certains patients.

i

1. INTRODUCTION GENERALE 1

2. LE STRESS OXYDATIF ET LES ANTIOXYDANTS 2

2.1.LES ESPECES OXYGENEES REACTIVES... 2

2.1.1. Définition... 2

2.1.2. Origine et rôle des espèces oxygénées réactives... 2

2.1.2.1. L’anion ‘radicalaire’ superoxyde... 3

2.1.2.1.1. Définition ... 3

2.1.2.1.2. Origine ... 3

2.1.2.2. Le peroxyde d’hydrogène... 6

2.1.2.3. L’acide hypochloreux... 6

2.1.2.4. Le radical hydroxyle... 7

2.2.LES DEFENSES CONTRE LES ESPECES OXYGENEES REACTIVES... 8

2.2.1. Les antioxydants... 8

2.2.2. Les défenses enzymatiques ... 9

2.2.2.1. Les Superoxyde Dismutases (SOD) ... 9

2.2.2.2. La catalase ... 10

2.2.2.3. Famille des glutathion peroxydases... 11

2.2.2.4. Les glutathion S-transférases... 12

2.2.2.5. Le système thiorédoxines / peroxyrédoxines... 13

2.2.2.6. Autres peroxydases... 14

2.2.3. Les défenses non-enzymatiques... 15

2.2.3.1. Les protéines complexantes... 15

2.2.3.2. Les métallothionéines... 16

2.2.3.3. L’albumine ... 16

2.2.4. Les antioxydants endogènes de faible masse moléculaire. ... 16

2.2.4.1. Le glutathion... 17

2.2.4.2. La bilirubine ... 17

2.2.4.3. Autres espèces ... 18

2.2.5. Les antioxydants exogènes de faible masse moléculaire ... 19

2.2.5.1. L’acide ascorbique... 19

2.2.5.2. La vitamine E ... 20

2.2.5.3. Les caroténoïdes ... 21

2.2.5.4. Les dérivés phénoliques issus des végétaux... 22

ii

2.2.6. Synergie entre les antioxydants... 22

2.2.7. Les substances thérapeutiques comme antioxydants ... 23

2.2.7.1. La N-Acétyl-Cystéine... 23

2.2.7.2. Les anti-inflammatoires non-stéroïdiens ... 25

2.2.7.3. Les inhibiteurs de l’enzyme de conversion de l’angiotensine... 27

3. LE SYSTEME MYELOPEROXYDASE / H2O2 / CL^- 29 3.1.INTRODUCTION... 29

3.2.ORIGINE... 29

3.2.1. Les peroxydases de plantes, de champignons et de bactéries... 30

3.2.2. Les peroxydases animales ... 30

3.2.2.1. La thyroïde peroxydase (TPO) ... 31

3.2.2.2. La lactoperoxydase (LPO)... 31

3.2.2.3. L’éosinophile peroxydase (EPO)... 31

3.2.2.4. La myéloperoxydase (MPO) ... 32

3.3.SYNTHESE DE LA MYELOPEROXYDASE... 32

3.4.STRUCTURE... 33

3.4.1. Structure protéique... 33

3.4.2. Structure de l’hème ... 37

3.4.3. Interaction protéine-hème ... 41

3.5.ACTIVITE DE LA MYELOPEROXYDASE... 49

3.5.1. Le composé I ... 49

3.5.2. Oxydation des (pseudo)halogénures en hypo (pseudo) halogénures... 52

3.5.3. Les composés II et III ... 53

3.5.4. Mesures de l’activité de la myéloperoxydase... 55

3.6.LE ROLE DU SYSTEME MYELOPEROXYDASE /H2O2/CL^- DANS DIVERSES PATHOLOGIES... 57

3.6.1. Le système myéloperoxydase / H2O2 / Cl^- dans les syndromes inflammatoires57 3.6.2. Le système myéloperoxydase / H2O2 / Cl^- dans l’athérosclérose... 61

3.6.2.1. La myéloperoxydase et les lipoprotéines de basse densité... 63

3.6.2.2. La myéloperoxydase et les lipoprotéines de haute densité... 65

3.6.2.3. La myéloperoxydase et la rupture de la plaque d’athérome... 66

3.6.2.4. L’effet pléiotropique des statines sur l’expression de la MPO... 66

3.6.3. Le système myéloperoxydase / H₂O₂ / Cl^- dans d’autres pathologies... 68

iii

4. BUTS DU TRAVAIL 69

5. MATÉRIEL ET MÉTHODES 71

6. RÉSULTATS 72

6.1.THE REACTIONS OF OXICAM AND SULFOANILIDE NON STEROIDAL ANTI-

INFLAMMATORY DRUGS WITH HYPOCHLOROUS ACID:DETERMINATION OF THE RATE

CONSTANTS WITH AN ASSAY BASED ON THE COMPETITION WITH PARA-AMINOBENZOIC ACID

CHLORATION AND IDENTIFICATION OF SOME OXIDATION PRODUCTS.FREE RADICAL

RESEARCH,2004,38 :251-258. ... 72

6.1.1. Introduction... 72

6.1.2. Résumé ... 73

6.1.3. Discussion ... 75

6.1.4. Conclusions ... 76

6.2.IN VITRO COMPARATIVE ASSESSMENT OF THE SCAVENGING ACTIVITY AGAINST THREE REACTIVE OXYGEN SPECIES OF NON-STEROIDAL ANTI-INFLAMMATORY DRUGS FROM THE OXICAM AND SULFOANILIDE FAMILIES.EUROPEAN JOURNAL OF PHARMACOLOGY, 2004,496:55-61. ... 77

6.2.1. Introduction... 77

6.2.2. Résumé ... 77

6.2.3. Discussion ... 78

6.2.4. Conclusion... 80

6.3.INHIBITION OF THE MYELOPEROXIDASE CHLORINATING ACTIVITY BY NON- STEROIDAL ANTI-INFLAMMATORY DRUGS:FLUFENAMIC ACID AND ITS 5-CHLORO- DERIVATIVE DIRECTLY INTERACT WITH MYELOPEROXIDASE TO INHIBIT THE SYNTHESIS OF HYPOCHLOROUS ACID.OSTEOARTHRITIS AND CARTILAGE, SOUMIS.... 81

6.3.1. Introduction... 81

6.3.2. Résumé ... 81

6.3.3. Discussion ... 85

6.3.4. Conclusion... 86

6.4.THIOL-CONTAINING MOLECULES INTERACT WITH THE MYELOPEROXIDASE /H2O2/ CHLORIDE SYSTEM TO INHIBIT LDL OXIDATION.BIOPHYSICAL AND BIOCHEMICAL RESEARCH COMMUNICATION,2005,337:82-88. ... 87

6.4.1. Introduction... 87

6.4.2. Résumé ... 87

iv

6.4.3. Discussion ... 89

6.4.4. Conclusion... 90

6.5.CAPTOPRIL INHIBITS THE OXIDATIVE MODIFICATION OF APOLIPOPROTEIN B-100 CAUSED BY MYELOPEROXYDASE IN A COMPARATIVE IN VITRO ASSAY OF ANGIOTENSIN CONVERTING ENZYME INHIBITORS.EUROPEAN JOURNAL OF PHARMACOLOGY.IN PRESS. ... 91

6.5.1. Introduction... 91

6.5.2. Résumé ... 91

6.5.3. Discussion ... 92

6.5.4. Conclusion... 92

7. DISCUSSION GÉNÉRALE ET PERSPECTIVES 93

8. CONCLUSIONS 100

9. BIBLIOGRAPHIE 101

10. ANNEXES 122

v

Abréviations

μM mM ACC II ADN AINS ALA ApoB100 ATP C5a

Comp I Comp II DR DTNB EPO FAD fMLP GPx GSH GSSG H2O2

HClO HDL HMGCoA HRP IC50 ICAM IECA IL1 IL8 LDL LOX-1

microMolaire milliMolaire

ACCumulation du composé II Acide DésoxyriboNucléique

Anti-Inflammatoires Non-Stéroïdiens δ-AminoLevulinate

Apolipoprotéine B100 Adénosine TriPhosphate Facteur du Complément 5a

Composé I de la myéloperoxydase Composé II de la myéloperoxydase Désoxyribose

Acide DiThiobis(2-Nitro)Benzoïque Eosinophile Peroxydase

Flavine Adénine Dinucléotide formyl-MET-LEU-PHE Glutathion Peroxydase Glutathion (réduit) Glutathion Oxydé Peroxyde d’hydrogène Acide Hypochloreux

Lipoprotéine de Haute Densité HydroxyMethylGlutarylCoenzymeA Peroxydase de Raifort

Concentration Inhibitrice à 50 % InterCellular Adhesion Molecule

Inhibiteur de l’Enzyme de Conversion de l’Angiotensine Interleukine 1

Interleukine 8

Lipoprotéine de Basse Densité Lectine-like Oxidized LDL receptor

vi LPO

LTB4 MCD M-CSF MMP MPO NAC NADP NAL NO NO2-

·OH

O2·-

PABA PAF PBG PLP Prx SOD TMB TNB TNFα

TPO TPx TR Trx VCAM

Lactoperoxydase Leukotriène B4

MonoChloroDimédone

Monocytes-Colony Stimulating Factor MétalloProtéase Matricielle

Myéloperoxydase N-Acétyl-Cystéine

Nicotinamide Adénine DiNucléotide Phosphate Sel de Lysine de la N-Acétyl-Cystéine

Oxide Nitrique Nitrite

Radicale Hydroxyle Anion Superoxyde

Acide P-AminoBenzoïque Platelet Activating Factor PorphoBilinoGène

Phosphate de PyridoxaL Peroxirédoxine

SuperOxyde Dismutase TetraMéthylBenzidine Acide ThioNitroBenzoïque Tumor Necrosis Factor Alpha Thyroïde Peroxydase

Thiorédoxine Peroxydase Thiorédoxine Réductase Thiorédoxine

Vascular Cell Adhesion Molecule

1. Introduction Générale

Le corps humain est le siège constant de la synthèse d’espèces oxygénées réactives dont la production contrôlée est indispensable au bon fonctionnement de l’organisme.

Cependant dans de nombreuses pathologies, il arrive qu’une production exagérée et/ou incontrôlée de ces espèces aboutisse à des dégâts oxydatifs. De nombreux auteurs ont étudié alors l’effet protecteur d’agents thérapeutiques dans des modèles mimant la production incontrôlée des espèces oxygénées réactives et cherché à évaluer la capacité antioxydante de ces agents.

C’est ainsi que dans le cadre de l’inflammation, le Laboratoire de Chimie Pharmaceutique Organique a exploré le pouvoir antioxydant des anti-inflammatoires non- stéroïdiens (AINS) face à différentes espèces oxygénées réactives. Les AINS agissent en inhibant la cyclo-oxygénase de type I et/ou II, réduisant la production des prostaglandines issues de la cascade de l’acide arachidonique. Cette inhibition se fait notamment sur le lieu même de l’inflammation où est produit un nombre important d’espèces oxydantes délétères.

Parmi les mécanismes de production d’espèces oxydantes, le système myéloperoxydase (MPO) / peroxyde d’hydrogène / chlorure détient une place importante.

Ceci est notamment la conséquence de la grande quantité de MPO présente dans les neutrophiles, pouvant être libérée très rapidement lors de l’inflammation ; de plus l’acide hypochloreux synthétisé par ce système est un très bon oxydant. C’est donc tout naturellement que nous avons orienté le présent travail vers l’étude de l’impact des AINS sur ce système. De plus, la myéloperoxydase est de plus en plus largement citée dans diverses pathologies, ce qui accroît sans cesse son intérêt comme cible thérapeutique potentielle.

2. Le stress oxydatif et les antioxydants

2.1. Les espèces oxygénées réactives

2.1.1. Définition

L’oxygène, sous sa forme diatomique, est un gaz essentiel à la vie de nombreuses espèces. Il est notamment nécessaire pour la production efficace d’énergie dans les cellules eucaryotes en participant au transport des électrons dans la chaîne respiratoire des mitochondries. Un autre rôle essentiel de ce gaz est son utilisation dans la production d’espèces oxygénées réactives que les polymorphonucléaires (PMN), comme les neutrophiles, synthétisent en vue de combattre les structures exogènes. En outre, la production de ces espèces oxygénées par les cellules participe à la voie de signalisation intracellulaire. A titre d’exemple, le peroxyde d’hydrogène peut inhiber les tyrosine phosphatases par oxydation d’un résidu cystéine, favorisant ainsi la voie d’acitivation des MAP kinases (Beaudeux et Vasson, 2005). Néanmoins, les effets largement bénéfiques de ce gaz et de ces dérivés n’occultent en rien sa toxicité qui s’exprime par la production incontrôlée des espèces oxygénées réactives (Halliwell et Gutteridge, 1999).

Les espèces oxygénées réactives sont des produits de l’oxygène, généralement divisés en espèces radicalaires et non-radicalaires, qui se caractérisent par une instabilité et/ou un pouvoir oxydant fort comme le montre le Tableau 1. Si les espèces radicalaires se distinguent par la présence d’un électron non apparié sur la couche électronique la plus externe, les espèces non-radicalaires sont caractérisées par un oxygène avec un étage d’oxydation supérieur à –2. Dans les deux cas, ces molécules vont chercher par oxydation à compléter la couche électronique externe de l’oxygène pour tendre vers une forme plus stable.

2.1.2. Origine et rôle des espèces oxygénées réactives

Parmi les espèces oxygénées réactives, ce chapitre se focalisera sur l’anion superoxyde (O2·-), le peroxyde d’hydrogène (H2O2), l’acide hypochloreux (HClO) et le radical hydroxyle (^·OH). Ces espèces sont généralement à l’origine de toutes les autres et sont fréquemment rencontrées dans les maladies à composante inflammatoire telles que les maladies inflammatoires chroniques et certaines maladies cardiovasculaires.

Tableau 1 : Principales espèces oxygénées réactives et leur temps de demi-vie (Sies, 1993)

Espèces réactives de l’oxygène Temps de demi-vie (sec) Radicalaire :

·OH, radical hydroxyle 10^-9

RO^·, radical alkoxyle 10^-6

ROO^·, radical peroxyle 7

O2·-¯, anion superoxyde élimination enzymatique

NO^·, radical oxynitrique 1^-10

Non-radicalaire:

H2O2, peroxyde d’hydrogène élimination enzymatique

HClO, acide hypochloreux dépendant du pH

ONOO^-, peroxynitrite 0,05-1

2.1.2.1. L’anion ‘radicalaire’ superoxyde 2.1.2.1.1. Définition

L’anion radicalaire superoxyde est produit par l’addition d’un électron unique sur l’orbitale π* anti-liante de l’oxygène. Malgré son nom de superoxyde, ses propriétés oxydatives sont bien loin de ce qu’il laisse supposer. Il en résulte que selon les auteurs, on retrouvera O2·- ou O2- pour symboliser l’espèce et que le terme d’anion superoxyde sera utilisé.

2.1.2.1.2. Origine

L’origine principale de O2·- est sans conteste la chaîne respiratoire mitochondriale. En effet, ce système permet la production d’adénosine triphosphate (ATP) en transférant des électrons issus de la nicotinamide-adenine-dinucléotide réduite (NADH) entre différents complexes hémo-protéïques (complexe NADH déshydrogénase, complexe b-c1, complexe cytochrome oxydase). En bout de chaîne, les électrons sont libérés dans la matrice par réduction de l’oxygène pour former de l’eau [Eq 1]. L’oxygène sous sa forme diatomique, bien que très électronégatif, a beaucoup de mal à accepter le premier électron. Le complexe cytochrome oxydase par ses hèmes comprenant un fer et un

cuivre permet cette première réduction pour produire O2·-. Cette espèce beaucoup plus réactive va dès lors rapidement recueillir les trois autres électrons avant d’être libérée sous forme d’eau. Etant donné que cette chaîne est à la base d’une large production énergétique sous forme d’ATP, il est compréhensible qu’elle soit responsable de 90 % de la consommation de l’oxygène que nous respirons (Alberts et al., 1994)

O₂

+

+

Complexe

cytochrome oxydase

C’est au cours de ce transfert continu d’électrons que la production de O2·- apparaît.

Pour une raison et à un endroit encore inconnus, une petite partie de l’oxygène est libérée sous forme d’O2·- et cette production est fonction de la pression partielle en oxygène dans l’air. Si la teneur en oxygène s’accroît dans l’atmosphère, cette production augmente par la présence accrue de ce gaz dans les mitochondries (Halliwell et Gutteridge, 1999).

Une autre source importante d’O2·- est la NADPH oxydase. Il s’agit d’un flavocytochrome qui produit l’espèce réactive par l’intermédiaire du NADPH. En réalité, cette enzyme fait partie de tout un système inductible que l’on retrouve notamment dans les neutrophiles et qui est activé au cours de la réponse inflammatoire (il est également présent dans les macrophages, monocytes et éosinophiles). En effet, en réponse à différents signaux chimiques (IL-1, IL-2, TNF_α,…), une cascade de phosphorylations est induite dans la cellule. Elle aboutit à la migration de facteurs cytosoliques tels que la p47-phox et la p67-phox (phox pour phagocytic oxydase) vers la membrane afin d’activer le cytochrome b-558, responsable de l’activité NADPH oxydase. Cette enzyme comprend deux sous- unités : une α qui fixe l’hème entre les deux sous-unités et une β qui est responsable de l’acheminement des électrons depuis le NADPH jusqu’aux atomes d’oxygène [Eq. 2].

NADPH

+

+

+

Pour ce faire, chaque molécule d’oxygène reçoit un électron alors que le NADPH peut en céder deux. Il en résulte que le cytochrome b-558 possède une activité flavoprotéique, utilisant la flavine adénine dinucléotide (FAD) pour transférer un à un les électrons sur les deux molécules d’oxygène (Fig. 1) (Morel et al., 1991 ; Teahan et al., 1994 ; Owen et Hancock, 2000).

NADPH + H⁺

NADP⁺

FAD

FADH₂ 2 O₂

2 O₂^·- FAD

Reductase Cytochrome

Figure 1. Production de l’anion superoxyde par le flavocytochrome b-558

Ce système très complexe permet la synthèse régulée de O2·- par les neutrophiles qui jouent un rôle important dans la destruction oxydative des structures exogènes au cours du processus inflammatoire. Néanmoins, le système NADPH oxydase est également présent dans les cellules endothéliales, les ostéoclastes ou les chondrocytes (Owen et Hancock, 2000).

Une autre source possible est la xanthine oxydase. Cette enzyme est produite à partir de la xanthine déshydrogénase qui au cours d’une ischémie, peut subir une protéolyse. Il semble que ce soit les conditions particulières de l’hypoxie qui inhibent une trypsine permettant aux protéases d’entrer en action. Il en résulte que lors de la reperfusion et l’apport accru d’oxygène, la xanthine oxydase catabolise la transformation de l’hypoxanthine en xanthine en produisant O2·- (Bast et al., 1991 ; Harrison, 2000). Ce système pourrait participer au processus inflammatoire en agissant en synergie avec les neutrophiles et en fournissant des quantités supplémentaires d’anion superoxyde (Harrison, 2000).

D’autres systèmes sont capables de produire O2·- mais leur rendement est relativement anecdotique et ne semblent pas intervenir durant le processus inflammatoire.

Citons par exemple : les aldéhyde oxydases du foie ou les protéines hémiques qui peuvent oxyder leur fer (II) en fer (III) avec production du radical O2·-. C’est ainsi que 3 % de l’hémoglobine présente dans les globules rouges existe sous la forme oxydée (méthémoglobine). Ajoutons encore, les réactions d’auto-oxydation telles que la transformation de l’adrénaline en adrénochrome et enfin, certains systèmes cytochrome P450 produisent également ce radical en présence de xénobiotiques (Halliwell et Gutteridge, 1999).

Comme le montrent les différents exemples, la production de O2·- peut être divisée en deux origines. Une origine physiologique (transport des électrons dans la mitochondrie, enzymes hépatiques) où le radical ne semble pas avoir de rôle défini, et une origine pathologique (NADPH oxydase, xanthine oxydase) où la production du radical répond à une stimulation et intervient dans le processus inflammatoire.

2.1.2.2. Le peroxyde d’hydrogène

Le peroxyde d’hydrogène (H2O2) est généralement présent à l’endroit de production de O2·-. Rien d’étonnant puisque ce radical peut donner le H2O2 par dismutation en présence ou non de superoxyde dismutase (SOD), [Eq. 3]

2 O₂^·- 2 H⁺

SOD Dismutation naturelle

H₂O₂ O₂

+ +

On retrouve ainsi le H2O2 dans les mitochondries mais aussi aux abords des neutrophiles où la production contrôlée de O2·- aboutit à la formation de cette espèce. Le H2O2 est ainsi largement produit au cours de l’inflammation en vue de réagir directement ou de produire de l’hypochlorite (voir Chapitre 2.1.2.3.).

Mais le H2O2 peut également apparaître indépendamment de O2·-. C’est ainsi qu’on le retrouve dans les peroxysomes, qui sont de petits organites intracellulaires présents dans les cellules eucaryotes. Délimités par une membrane unique, ils effectuent certaines réactions métaboliques d’oxydation qui produisent le H2O2. Celui-ci est utilisé par la catalase pour peroxyder une variété de substrats (alcool, phénols, formaldéhyde) ou pour être transformé en eau (si en excès). Ce type de réaction est particulièrement présent dans les cellules du foie et des reins où le H2O2 permet de détoxifier diverses molécules circulant dans le sang (Freeman et Crapo, 1984 ; Alberts et al., 1994).

2.1.2.3. L’acide hypochloreux

L’acide hypochloreux (HClO) est obtenu par synthèse enzymatique grâce à la myéloperoxydase (MPO) et le H2O2 [Eq 4]. C’est ce système qui fera l’objet de toutes les attentions dans la suite de ce travail.

H₃O⁺

+

+

+

[Eq. 4]

La présence simultanée de cette enzyme et de H2O2 est en général consécutive à l’activation des neutrophiles au cours de la réaction inflammatoire. En effet sous l’action de cytokines, ces cellules produisent O2·- et par là-même H2O2. Il en résulte que HClO est essentiellement produit par des polymorphonucléaires (PMN) et majoritairement par les

neutrophiles (Klebanoff, 1999 ; Furtmüller et al., 2000a). Cette espèce est caractérisée par un pouvoir oxydant nettement plus élevé que le H2O2 qui est mis à profit par les neutrophiles pour oxyder et chlorer des structures exogènes au cours de l’inflammation.

2.1.2.4. Le radical hydroxyle

Le radical hydroxyle (^·OH) est une espèce radicalaire hautement réactive dont le temps de demi-vie avoisine 10^-9 secondes (Sies, 1993). Contrairement aux autres espèces évoquées plus haut, sa production n’est pas réellement induite par les différents médiateurs de l’inflammation même si sa production semble accrue au cours de la réponse inflammatoire (Halliwell et Gutteridge, 1999). Son origine est généralement le fruit de la présence simultanée de plusieurs espèces oxydantes avec ou sans métaux de transitions [Eq 5-8] et n’a pas de rôle physiologique connu.

·OH H₂O₂

+

Fe⁺⁺ / Cu⁺

+

+

+

+

+

Fe⁺⁺ / Cu⁺ Fe⁺⁺⁺ / Cu⁺⁺

·OH H₂O₂

+ +

+

+

+

+

O₂^-.

O₂^-.

O₂ O₂

Le radical hydroxyle peut donc apparaître dès qu’il y la production d’espèces oxydantes quel que soit le tissu, la cellule ou la structure. Le milieu biologique étant majoritairement constitué d’eau, cette espèce est produite tout au long de la vie que ce soit consécutivement à des radiations délétères pour l’organisme (rayons γ), la chaleur ou des conditions habituelles de la vie cellulaire.

2.2. Les défenses contre les espèces oxygénées réactives

2.2.1. Les antioxydants

Comme évoqué précédemment, de nombreuses espèces oxydantes sont produites et bien qu’elles soient souvent indispensables à l’organisme, elles ne sont pas moins responsables de dégâts importants. Pour faire face à ces produits oxydants délétères, le corps humain possède tout un arsenal de défenses que l’on qualifie d’antioxydants. De plus, de nombreuses molécules d’origine naturelle (flavonoïdes, catéchines,…) ou issues de synthèses organiques (Trolox, N-acétyl-cystéine,…) sont étudiées pour leur propriétés antioxydantes et leurs contribution dans la lutte contre les espèces oxydantes de l’organisme. Mais bien que le terme « antioxydant » soit fréquemment utilisé, il est difficilement définissable car il couvre un large nombre de molécules et des domaines très divers comme l’alimentation, l’industrie chimique, l’industrie pharmaceutique… C’est pourquoi Halliwell et Gutteridge (1999) donnent une définition assez large des antioxydants qui s’exprime comme suit : « Un antioxydant est toute substance, présente à une concentration inférieure à celle du substrat oxydable, qui est capable de retarder ou de prévenir l’oxydation de ce substrat ». En ce qui nous concerne, les substrats oxydables sont les molécules oxydées in vivo par les espèces oxygénées réactives.

Il découle de cette définition que sous le vocable « antioxydant » vont se retrouver une multitude d’agents qu’il va falloir classer en fonction de leurs propriétés. La suite du travail va s’attacher à présenter une liste non-exhaustive de molécules antioxydantes, fréquemment citées dans la littérature et classées comme suit :

• Les défenses antioxydantes enzymatiques.

• Les défenses antioxydantes non-enzymatiques : les protéines de séquestration des métaux et les molécules de faible poids moléculaire (« scavengers »).

• Les agents thérapeutiques antioxydants.

2.2.2. Les défenses enzymatiques

2.2.2.1. Les Superoxyde Dismutases (SOD)¹

La famille des superoxyde dismutases comporte trois isoformes (SOD1, SOD2, SOD3) dont le rôle est la dismutation de deux anions superoxyde en espèces oxygénées moins réactives que sont H2O2 et O2 [Eq. 9].

Enzyme-Cu²⁺

+

Enzyme-Cu ⁺

Enzyme-Cu ⁺

+

+

+

+

2 O₂^.-

+

+

SOD

[Eq. 9]

La SOD1 est une protéine d’environ 32000 Da, constituée de deux sous-unités qui contiennent chacune un atome de cuivre (II) et un atome de zinc (II). Si le Cu²⁺ sert à l’activité catalytique de l’enzyme, le Zn²⁺ stabilise la structure de la protéine. Elle est essentiellement présente dans le cytosol.

Il existe également une forme tétramèrique de 88000 Da où chaque sous-unité contient du manganèse comme cation nécessaire à l’activité enzymatique. Cette Mn-SOD (SOD2) est présente dans la plupart des tissus mais est localisée au niveau des mitochondries.

Une autre forme tétramère Cu²⁺-Zn²⁺ (SOD3) de 135000 Da a été isolée dans la matrice extracellulaire et dans une moindre mesure dans les liquides extracellulaires. La localisation de cette SOD3 suggère qu’elle protège les tissus de l’anion superoxyde. En effet, elle se lie aux cellules grâce à un site de liaison sur sa partie C-terminale dont l’affinité pour l’héparine varie en fonction du type d’enzyme (type A = haute affinité, type B = affinité variable, type C = affinité réduite). C’est grâce à ce site de liaison qu’elle peut également se fixer sur les cellules endothéliales. Landmesser et al. (2000) ont suggéré que la SOD3 pourrait protéger les lipoprotéines de basse densité (LDL) de l’oxydation mais, paradoxalement, elle pourrait également favoriser l’oxydation des LDL par la MPO. En effet, la colocalisation de la MPO et de la NADPH oxydase sur l’endothélium permet l’oxydation des LDL après activation par l’angiotensine II (Zhang et al., 2003 ; Zouaoui

1 Thérond et Bonnefont-Rousselot, 2005.

Boudjeltia et al., 2004) ; la SOD3 permettrait de transformer l’anion superoxyde généré par la NADPH oxydase en peroxyde d’hydrogène indispensable à l’activité de la MPO.

L’importance de ces SOD a été mise en évidence chez des souris transgéniques dépourvues de SOD Cu-Zn. Si les souris jeunes apparaissent normales, elles développent rapidement des troubles neurologiques et des cancers (Ho, 1998 ; Reaume et al., 1996).

2.2.2.2. La catalase

La catalase est une enzyme constituée de quatre sous-unités possédant un hème couplé au Fe (III). Le site catalytique est enfoui dans une poche non-polaire accessible par un tunnel étroit permettant l’entrée de molécules de petite taille telles que le H2O2, à l’instar de la myéloperoxydase (Reid et al., 1981). Chaque sous-unité peut également fixer une molécule de NADPH. Cette enzyme est présente dans tous les tissus avec une plus forte proportion dans le foie et les globules rouges. En ce qui concerne sa localisation dans la cellule, la catalase est essentiellement associée à des organites appelés peroxysomes, où la catalase se trouve à proximité d’enzymes générant du H2O2 (glycolate oxidase, flavoprotéine déhydrogénases impliquées dans la β-oxydation des acides gras) (Chance et al., 1979). Une plus faible portion se retrouve au niveau des mitochondries et du réticulum endoplasmique. Dans les globules rouges, la catalase permet de cataboliser le H2O2 issu de la dismutation d’anions superoxyde générés par l’auto-oxydation de l’hémoglobine.

L’activité principale de la catalase est la dismutation de deux molécules de H2O2 en H2O et O2 [Eq. 10]. L’enzyme native est oxydée par une première molécule de H2O2 en un composé I où un oxygène déficient en électrons est fixé au Fe³⁺ de l’hème. Le composé I est ensuite réduit en la forme native par une deuxième molécule de H2O2. Dès lors, la présence de la SOD et de la catalase permet par dismutations successives de transformer quatre molécules d’anion superoxyde en deux molécules d’H2O et trois molécules d’oxygène [Eq. 11].

Catalase-Fe³⁺

+

Composé I

Composé I

+

+ +

H₂O₂

H₂O₂ Catalase-Fe³⁺ H₂O

+

2 H₂O₂ 2 H₂O

+

Catalase

[Eq. 10]

4 O₂^.-

+

+

SOD - Catalase

[Eq. 11]

Il est à noter que la catalase est également capable d’oxyder de petites molécules telles que le méthanol et l’éthanol en leurs aldéhydes respectives.

Enfin, une mutation sur le chromosome 11 peut se traduire par une déficience en catalase (acatalasémie) qui s’accompagne d’une apparition d’ulcérations buccales sans autres signes cliniques apparents (Hirono et al., 1995).

2.2.2.3. Famille des glutathion peroxydases

La famille des glutathion peroxydases (GPx) comporte à ce jour 7 isoformes qui ont pour activité la réduction des hydroperoxydes (H2O2 et ROOH). Ces enzymes utilisent comme cofacteur le glutathion [Eq. 12]. Le glutathion oxydé (GS-SG) est alors régénéré par la glutathion réductase qui utilise le NADPH comme donneur d’électrons.

2 GSH

+

+

GPx

A l’exception de l’isoforme 7, les glutathion peroxydases possèdent toutes un sélénium dans leur site actif. En réalité, le sélénium qui se situe dans le groupe IV du tableau périodique et qui se rapproche du soufre, est présent sous forme de sélénocystéine dans la protéine.

La GPx1 est une protéine de 95000 Da composée de quatre sous-unités contenant chacune un atome de sélénium dans leur site actif. Elle est présente dans la plupart des tissus mais se retrouve en grandes quantités dans les érythrocytes, le foie et les reins. Elle est localisée à 90 % dans le cytosol et à 10 % dans les mitochondries. La GPx2 possède à peu près les mêmes caractéristiques que l’isoforme 1. C’est un tétramère d’environ 80000 Da que l’on retrouve dans le cytoplasme des cellules du tractus gastro-intestinal. Son rôle principal serait de réduire les hydroperoxydes d’origine alimentaire ou ceux produits au cours de la peroxydation lipidique intestinale. La GPx3 est également un tétramère de 90000 Da mais qui a peu d’homologie avec l’isoforme 1 (49%). Elle est présente dans le plasma, les reins, les poumons, le cœur et le placenta. Son rôle dans le plasma suscite encore des interrogations puisqu’elle possède une faible affinité pour le glutathion. Elle pourrait dès lors utiliser un autre réducteur tel que la thiorédoxine. Contrairement aux autres peroxydases, la GPx4 est un monomère de 18000 Da qui est capable de réduire les hydroperoxydes lipidiques sans l’hydrolyse préalable par une phospholipase A2. Elle est présente dans tous les tissus et permettrait ainsi de protéger les membranes cellulaires

contre les effets délétères des peroxydations lipidiques (Thérond et Bonnefont-Rouselot, 2005).

Trois autres GPX ont été plus récemment décrites. La GPx5 est ainsi présente au niveau de l’épididyme (Hall et al., 1998). La GPx6 n’a été détectée que chez l’embryon ou dans les cellules des tissus olfactifs (Kryukov et al., 2003). La Gpx7 est le seul isoforme qui ne possède pas de sélénium et qui pourtant réduit les hydroperoxydes lipidiques en utilisant le glutathion comme cofacteur. Tout comme la GPx4, il s’agit d’un monomère de 22000 Da que l’on retrouve dans le cytoplasme de la plupart des tissus (Utomo et al., 2004).

Si l’on compare la localisation et les quantités de GPx et de catalase dans l’organisme, on peut facilement établir des synergies entre les deux systèmes. Le H2O2

produit dans les mitochondries et le réticulum est pris en charge par la GPx alors que le H2O2 issu des peroxysomes est éliminé par la catalase. Néanmoins, les quantités de GPx laissent supposer que ces systèmes sont largement responsables de l’élimination de H2O2

(Chance et al., 1979), ce qui expliquerait l’aspect bénin des manifestations cliniques de l’acatalasémie alors que les déficiences en GPx sont responsables d’hémolyse et de dégénérescence cérébrale. Par ailleurs, les souris transgéniques knockout pour la GPx sont également plus sensibles aux toxiques tels que l’ozone et les anthracyclines.

2.2.2.4. Les glutathion S-transférases

La famille des glutathion S-transférases, précédemment appelée glutathion peroxydase non séléno-dépendantes, permet essentiellement l’addition de glutathion sur des xénobiotiques (chloroforme, DDT, paracétamol) afin de les éliminer plus facilement de l’organisme sous une forme d’acétylcystéine ce qu’il leur confère un caractère hydrosoluble. Ceci explique que ces enzymes se retrouvent en grande quantité dans le foie.

Mais si les glutathion S-transférases font partie de l’arsenal de défense contre les espèces oxydantes, c’est surtout parce qu’elles sont capables de métaboliser les aldéhydes cytotoxiques issues de la peroxydation lipidique telles que le 4-hydroxy-2-nonenal (Halliwell et Gutteridge, 1999). De plus, elles sont capables de métaboliser certains peroxydes organiques (excepté le H2O2) en alcool tout comme la glutathion peroxydase pour les hydroperoxydes phospholipidiques (Sies et al., 1978).

2.2.2.5. Le système thiorédoxines / peroxyrédoxines

Au milieu des années nonante, un nouveau système de défense antioxydant a été mis en évidence par hasard. Il est constitué de peroxydases (peroxyrédoxine), réductases (thiorédoxine réductase) et de cofacteurs appelés thiorédoxines. Ce système complexe permet la métabolisation de divers peroxydes en leurs alcools respectifs en utilisant comme donneurs d’électrons différents polypeptides contenant le plus souvent deux fonctions thiol.

La figure 2, ci-dessous, montre que la thiorédoxine peroxydase (peroxyrédoxine, TPx) réduit le peroxyde en formant un pont disulfure intramoléculaire. Une thiorédoxine (Trx) régénère alors la peroxydase en formant à son tour un pont disulfure intramoléculaire ; c’est le système peroxyrédoxine. Afin de régénérer ce cofacteur, une thiorédoxine réductase, complexe formé de deux polypeptides, utilise les électrons du NADPH pour réduire le FAD fixé sur le premier polypeptide (AhpF, 57 kDa, TR-FADH2) qui peut à son tour réduire le deuxième polypeptide (AhpC, 21 kDa, TR), lui-même ayant réduit la thiorédoxine (Trx) en formant un pont disulfure intramoléculaire (Rhee et al., 2005).

S S S

H S H

SH SH S

H S H

S S

SH SH

S S SH ROOH SH

ROH

+

H₂O

TPx₂

TPx₂ Trx

Trx TR

TR TR-FAD

TR-FADH₂

NADPH

+

NADP⁺

Thiorédoxine Thiorédoxine Réductase Thiorédoxine

Peroxydase

Figure 2. Schéma du mode d’action du système peroxyrédoxine.

A ce jour, il existe six isoformes de peroxyrédoxines (Prx I à VI) divisés en trois sous-groupes. Le premier groupe contient les Prx I à IV contenant dans la partie N- et C- terminale une cystéine intacte, indispensable à l’activité catalytique. D’une manière générale, c’est le résidu de cystéine en position N-terminale qui est d’abord oxydé par le peroxyde en acide sulfénique (RSOH). Ensuite, un pont disulfure intra-moléculaire est formé avec la cystéine en position C-terminale. L’enzyme est alors exclusivement régénérée par une thiorédoxine. Le deuxième groupe (Prx V) contient une cystéine intacte

dans la partie N-terminale mais n’a plus d’homologie avec le premier groupe en ce qui concerne la partie C-terminale. Néanmoins, une autre cystéine est nécessaire à l’activité catalytique et se trouve à d’autres endroits dans la chaîne polypeptidique (Evrard et al., 2004). Nous assistons dès lors à une oxydation de la cystéine en position N-terminale suivie par la formation d’un dimère avec une autre Prx V avant de former un pont disulfure intra-moléculaire. A nouveau, l’enzyme est exclusivement régénérée par une thiorédoxine.

Enfin, le troisième groupe (Prx VI) ne possède qu’une cystéine dans la partie N-terminale nécessaire à son activité catalytique. Une fois l’acide sulfénique obtenu, il est réduit par un donneur d’électrons inconnu à ce jour qui pourrait être le glutathion (Fisher et al., 1999).

Dans ce contexte, il n’est d’ailleurs pas exclu qu’une oxydation plus poussée aboutisse à la formation de l’acide sulfinique (RSO2H). Bien que le mécanisme ne soit pas encore élucidé, il est acquis que cette forme ne peut être réduite par le système thiorédoxine réductase et la formation du dérivé sulfinique a longtemps été considérée comme irréversible. Cependant, une sulfirédoxine (Srx) a été mise en évidence et réduit de manière spécifique le dérivé sulfinique en présence d’ATP, de magnésium et d’un thiol qui joue le rôle de donneur d’électrons (Biteau et al., 2003).

L’importance de ce système est révélée par la présence des Prx à tous les niveaux : les Prx I et II sont localisées dans le cytosol, la Prx III est située dans les mitochondries qui, avec une thiorédoxine spécifique aux mitochondries, semble constituer la première ligne de défense contre le H2O2 généré par la chaîne respiratoire (Rhee et al., 2005). La Prx IV est présente dans le liquide extracellulaire. La Prx V est plus largement distribuée dans le cytosol, les mitochondries, le noyau ou les peroxysomes. Enfin, la Prx VI est présente dans le cytosol.

2.2.2.6. Autres peroxydases

D’autres peroxydases interviennent également dans la défense contre les espèces oxydantes car elles utilisent le H2O2 comme substrat (Halliwell et Gutteridge, 1999). La myéloperoxydase (qui fera l’objet d’un chapitre dans cet ouvrage, Chapitre 3.), la thyroïde peroxydase ou l’éosinophile peroxydase. Cependant, la portée de ces enzymes est limitée et les effets sont très contrastés. C’est ainsi que dans le cas de la myéloperoxydase, le H2O2

est consommé afin de former de l’acide hypochloreux, nettement plus oxydant. C’est seulement en cas d’excès de H2O2 que la myéloperoxydase peut alors jouer le rôle de catalase et réduire la concentration de peroxyde.

2.2.3. Les défenses non-enzymatiques 2.2.3.1. Les protéines complexantes

Dans l’arsenal de défense contre les espèces oxygénées réactives, les protéines complexant les métaux sont fréquemment citées. En effet, les métaux, tels que le fer et le cuivre sont capables de jouer le rôle de donneur d’électrons sous leur forme réduite et d’entraîner la formation d’espèces radicalaires [Eq. 13-14] :

·OH H₂O₂

+

Fe⁺⁺ / Cu⁺

+

+

+

+

+

Fe⁺⁺ / Cu⁺ Fe⁺⁺⁺ / Cu⁺⁺

En raison des quantités de fer et de cuivre présentes dans l’organisme, environ 4,5 et 0,08 grammes respectivement, celui-ci ne pourrait pas survivre si ces espèces n’étaient pas complexées de manière telle que toute réaction chimique soit impossible.

C’est ainsi que le fer absorbé provient majoritairement de fer (III) couplé à un hème et du fer (II) couplé à des protéines. Le fer qui pénètre dans la circulation est pris en charge par la transferrine. Cette protéine d’environ 79 kDa est synthétisée dans le foie et possède deux sites de fixation du fer (III). La constante de stabilité du complexe avoisine les 10²² à pH 7,4 et nécessite la présence de carbonates ou bicarbonates. Les cellules possèdent un récepteur à transferrine qui permet d’amorcer une endocytose, la vacuole formée est alors acidifiée et le fer détaché du complexe afin d’être pris en charge par un autre transporteur, inconnu à ce jour. Le fer peut alors être stocké dans la ferritine. Cette énorme protéine est constituée de 24 sous-unités d’environ 20 kDa chacune et peut stocker jusqu’à 4500 atomes de fer (III). Il existe également des molécules de plus petite taille, capables de complexer le fer in vivo : citrate, ATP, GTP, inositol phosphate sont fréquemment cités et pourraient jouer le rôle de transporteur au niveau intracellulaire.

Notons encore la présence de la lactoferrine qui est également capable de fixer deux atomes de Fer (III) mais à des pH plus acides que la transferrine. Elle est notamment sécrétée par les neutrophiles et est rencontrée dans la salive, le lait maternel, la bile, le liquide séminal (Crichton et al., 1987). Tous ces complexes formés avec le fer présentent l’avantage d’empêcher le rôle pro-oxydant de celui-ci (Hayman et Cox 1994).

Le cuivre est probablement absorbé au niveau du duodénum sous forme de complexe avec des acides aminés. Arrivé dans le sang, le cuivre est fixé sur l’albumine

qui possède un site à haute affinité pour ce cation et est transporté jusqu’au foie. Le cuivre y est incorporé et fixé sur la caeruloplasmine, une protéine d’environ 132 kDa qui contient six sites de fixation à haute affinité ainsi qu’un septième, moins performant. Le cuivre en excès est rejeté dans la bile pour y être éliminé. Des récepteurs à la surface des cellules permettent d’incorporer le complexe caeruloplasmine-Cu²⁺ mais la nature du transporteur intracellulaire du cuivre est encore incertaine (Halliwell et Gutteridge, 1999).

Encore une fois, l’affinité du cuivre pour la caeruloplasmine permet d’éviter les dégâts que pourrait produire ce cation par son activité pro-oxydante. Néanmoins et bien que cette protéine soit rarement saturée, la faible affinité pour le septième site de fixation rendrait le Cu²⁺ disponible pour activer certaines oxydations, notamment celle des LDL (Mukhopadhyay et al., 1996) mais cette théorie est très controversée.

2.2.3.2. Les métallothionéines

Ces protéines de petite masse (~ 6500 Da) sont présentes dans le cytosol essentiellement au niveau du foie, des reins et de l’intestin (Dunn et al., 1987). Elles sont très riches en soufre (23-33% de cystéines), ce qui en fait de très bons ligands pour les métaux. Leur rôle principal consiste à stocker des métaux lourds sous une forme non- toxique mais elles jouent également un rôle dans le métabolisme du cuivre et du zinc. Les métallothionéines ont par essence un pouvoir antioxydant dû au nombre important de résidus de cystéine par protéine. Mais la fixation des métaux pourrait également prévenir des effets pro-oxydants de ces cations.

2.2.3.3. L’albumine

L’albumine se trouve en grande quantité dans le plasma (0,5 mM) et possède une fonction thiol bien exposée. A ce titre, l’albumine est souvent considérée comme un antioxydant important dans le milieu extracellulaire (Halliwell et Gutteridge, 1990a). De plus, elle est capable de fixer différents métaux (Cu²⁺, Fe³⁺ et V²⁺) et de prévenir leurs effets oxydants (Quinlan et al., 1992).

2.2.4. Les antioxydants endogènes de faible masse moléculaire.

Outre les systèmes de défense enzymatique et les protéines complexant les métaux, diverses molécules de petite taille constituent l’arsenal de défense contre les espèces

oxydantes soit comme cofacteur des enzymes déjà citées plus haut (le glutathion) soit comme antioxydant propre.

2.2.4.1. Le glutathion

Le glutathion (N-(N-L-γ-glutamyl-L-cystéinyl)glycine) est un élément important dans les réactions antioxydantes. Il est synthétisé in vivo par la γ-glutamylcystéine synthétase et la glutathion synthétase en présence d’ATP (Fig. 3). Il est avant tout le cofacteur de la famille des glutathion peroxydases qui permet d’éliminer diverses espèces de peroxydes dont le H2O2. Il permet également de protéger les fonctions thiols de différentes protéines et de complexer le cuivre (Pederson et al., 1996). De plus, par sa fonction réductrice, il est un très bon capteur des espèces oxygénées réactives (Peskin et al., 2001).

-O HN

NH O

O

S H

NH₃+ O

O

O

Figure 3. Structure du glutathion

Il est le thiol le plus abondant au niveau intracellulaire avec une concentration de l’ordre de 0,1 à 1 mM et la forme réduite est largement majoritaire avec une concentration dix fois supérieure à la forme oxydée (Barhoumi et al., 1993). Il semble d’ailleurs qu’un déplacement de cette équilibre entre la forme réduite et la forme disulfure (oxydée) serait impliqué dans des dysfonctionnements cellulaires observés avec l’âge (Droge, 2002). De manière plus générale, les thiols intracellulaires protègent également de l’oxydation les systèmes de phoshorylation indispensables à la transduction du signal. Les systèmes de phosphorylation des protéines sont effectivement très sensibles aux phénomènes oxydatifs (Sen, 2000).

2.2.4.2. La bilirubine

La bilirubine est le produit final de l’oxydation de l’hémoglobine. Dans le plasma, elle est fixée à l’albumine. Son rôle comme antioxydant in vivo n’est pas encore tout à fait établi mais in vitro, cette molécule a démontré de très bonnes propriétés antioxydantes vis- à-vis des peroxydes (Neuzil et Stocker, 1993).

2.2.4.3. Autres espèces

- Les acides α-cétoniques ont la particularité de se décarboxyler en présence d’oxydants tels que H2O2 ou HClO [Eq. 15] (Nath et al., 1995).

R O

O O

H H O

O H

R OH

O

+ +

+

- Certaines hormones sexuelles possédant une fonction phénol (oestrogènes) ont des propriétés antioxydantes capables de stopper la propagation de la peroxydation lipidique (Keaney et al., 1994).

- La mélatonine, qui joue un rôle important dans les cycles d’éveil et de sommeil, a également démontré des effets antioxydants (Marshall et al., 1996).

- L’acide lipoïque (acide 1,2-dithiolane-3-pentanoïque) est le cofacteur d’un complexe multienzymatique qui catalyse la décarboxylation des acides α-cétoniques. La présence d’atomes de soufre au sein de la structure a poussé de nombreux auteurs à étudier ses propriétés antioxydantes. Néanmoins sa présence en quantité faible dans l’organisme en fait un acteur mineur dans la lutte contre les oxydants (Packer et al., 1995).

- La coenzyme Q, qui joue un rôle essentiel dans le transport des électrons au niveau des mitochondries, est aussi présente dans les membranes cellulaires et les lipoprotéines (Ernster et Dallner, 1995). Cette propriété permettrait de réduire la peroxydation lipidique dans ces milieux lipophiles.

– L’acide urique est le produit d’oxydation de l’hypoxanthine et de la xanthine et se trouve sous forme d’urate dans le plasma (pKa = 5,4). Si dans de nombreuses espèces l’urate est métabolisé en allantoïne par l’urate oxidase, l’être humain semble dépourvu de l’enzyme et a tendance à l’accumuler. Ces propriétés chimiques en font un redoutable capteur des radicaux libres (Ames et al., 1981) puisqu’il semble ne pas réagir avec l’oxygène pour former le radical peroxyle et qu’il peut être régénéré par l’acide ascorbique.

- Etant donné que le noyau imidazole de l’histidine a un effet pro-oxydant sur la peroxydation lipidique promue par le cation fer, les dipeptides constitués d’histidine, tels que la carnosine, l’homocarnosine et l’ansérine, et qui ne possèdent pas cette propriété pro-oxydante, sont dès lors souvent considérés comme antioxydants. Néanmoins, il faut

relativiser leur contribution dans la lutte antioxydante car il n’existe pas d’étude de leur impact in vivo (Winkler et al., 1984 ;Aruoma et al., 1989a).

- La mélanine est un produit de polymérisation de la tyrosine qui contient des groupements quinones et hydroquinones (réducteurs). La mélanine brune ou noire (eumélanine) possède des propriétés d’absorption de rayons ultraviolets. En effet, l’irradiation des eumélanines produit des radicaux superoxydes qui sont rapidement réduits par les hydroquinones ou les semiquinones présentes dans leurs structures (Korytowski et al., 1986 ; Sarna et al., 1986).

2.2.5. Les antioxydants exogènes de faible masse moléculaire

De nombreuses molécules issues de notre alimentation : vitamines, nutriments, composés naturels,… sont considérés comme des antioxydants. Notons à titre d’exemples, les plus courants :

2.2.5.1. L’acide ascorbique

L’acide ascorbique ou vitamine C est un cofacteur d’au moins huit enzymes dont les plus connues sont la proline- et la lysine hydroxylase, impliquées dans la synthèse du collagène mais aussi la dopamine-β-hydroxylase qui convertit la dopamine en noradrénaline. Il est présent dans l’organisme sous forme d’ascorbate et sa déficience, donnant lieu au scorbut, a déjà longuement été étudiée. En ce qui concerne ses propriétés antioxydantes, elles sont attribuées à sa capacité d’être réduit en radical ascorbyle après perte d’un électron qui lui permet d’éliminer efficacement les radicaux libres (Fig. 4).

Cette forme radicalaire de la vitamine C est relativement stable et peut être régénérée lorsqu’elle s’accumule en ascorbate et en déhydroascorbate (Nishikimi et Yagi, 1996). Le déhydroascorbate est instable et est majoritairement dégradé en acides oxalique et L- thréonique. Néanmoins, une NADH-semihydroascorbate réductase et une déhydroascorbate réductase dépendante du glutathion ont également été recensées. Ces enzymes sont capables de recycler les formes oxydées de l’ascorbate (Diliberto et al., 1982 ; Wells et al., 1990). En ce qui concerne les interactions avec d’autres antioxydants, la vitamine C pourrait jouer un rôle dans le recyclage du radical tocophéryle (Tanaka et al., 1997) et interagirait avec le glutathion (Meister et al., 1995).

O CH₂OH

-O OH

O O

H O

CH₂OH

O O

O O H

O CH₂OH

O O

O O H

HOOC COOH

HOCH₂ OH

O OH

OH -e^- - H⁺

+e^- + H⁺

. -e^- - H⁺ +e^- + H⁺

+

Acide oxalique

Acide L-thréonique Figure 4. Oxydation de l’acide ascorbique et dégradation du dérivé déhydroascorbate

Le pouvoir réducteur de l’ascorbate lui a valu également l’étiquette de pro-oxydant.

En effet, il est capable de réduire le fer et le cuivre et d’induire la réaction de Fenton aboutissant à la production de radical hydroxyle (Halliwell et Gutteridge, 1990b). Bien qu’il ne soit pas prouvé in vivo, ce phénomène n’est pas propre à la vitamine C. Toute substance réductrice (thiols, NAD(P)H, tocophérol) pourrait également jouer ce rôle.

2.2.5.2. La vitamine E

La vitamine E est considérée comme étant le plus important inhibiteur de la peroxydation lipidique. Cette vitamine liposoluble regroupe un ensemble de molécules appelées, d-α-, d-β-, d-γ et d-δ-tocophérols qui sont capables d’éliminer le radical peroxyle des lipides (Fig. 5) (Diplock, 1985).

Son activité antioxydante tient au fait qu’à la suite de la perte d’un électron arraché par une espèce radicalaire (radical peroxyle), le tocophérol produit le radical tocophéryle beaucoup plus stable que le peroxyle. Il peut être alors recyclé par la vitamine C (Diplock, 1985) ou oxydé à nouveau en tocophérylquinone qui est réduit en dérivé dihydroquinonique et conjugué avec l’acide glucuronique pour être éliminé (Neuzil et al., 1997).

O O

H

R3

R1

R2 H

CH₃ CH₃

3

O O

H

R3

R1 R2

CH₃

R O

R3

R1 R2

CH₃ R O

O

R3

R1 R2

CH₃ R O OH

Tocophérol α: R1, R2, R3 = CH₃ β: R1, R3 = CH₃ et R2 = H γ: R1, R2 = CH₃ et R3 = H δ: R1 = CH₃ et R2, R3 = H

LOO^. LOOH

.

+ H₂O

+

+

Figure 5. Structures du tocophérol et interaction avec le peroxyle lipidique

2.2.5.3. Les caroténoïdes

Les caroténoïdes sont un groupe de pigments (généralement jaune à rouge) présents dans de nombreux végétaux, bactéries ou espèces animales (Fig. 6).

Lycopène

β-carotène

α-carotène

Figure 6. Exemple de carotènes parmi les plus connus

Le rôle principal de certains d’entre eux consiste à servir de précurseurs à la vitamine A ou rétinol, indispensable à la vision, à la croissance et à la différenciation cellulaire (Krinsky, 1993). Mais la présence de nombreuses doubles liaisons au sein de leurs structures en fait des antioxydants reconnus, notamment par leur effet protecteur vis- à-vis des radiations solaires (UVA) (Biesalski et al., 1996). De nombreuses expérimentations, menées in vitro, ont démontré leur effet antioxydant face aux radicaux libres (Liebler et MacClure, 1996).

2.2.5.4. Les dérivés phénoliques issus des végétaux

Les substances phénoliques ont différents rôles dans les plantes qui vont de précurseurs dans la biosynthèse d’autres molécules à la défense contre les attaques extérieures en passant par un rôle attracteur au cours de la pollinisation. Particulièrement cités, les anthocyanes, très présentes dans le vin et qui par leurs effets antioxydants in vitro (Saint-Cricq de Gaulejac et al., 1999), sont à la base de ce qu’on appelle le « French Paradox » (Frankel et al., 1995) ; mais aussi, les flavanoïdes qui regroupent un ensemble de structures classées en flavanes, flavanones, flavones, flavonols et qui ont démontré de très bons effets antioxydants (Cos et al., 1998 ; Robak et al., 1988). Toutefois, une étude de la relation structure-activité des flavonoïdes met en exergue la variabilité des effets au sein d’une même famille de molécules (Rice-Evans et al., 1995). Une molécule également très décrite est le resvératrol. Ce polyphénol dérivé du stilbène présent dans le raisin et dans le vin a démontré des propriétés antioxydantes en inhibant notamment la peroxydation lipidique (Tadolini et al., 2000). Ces résultats ont également contribué à entretenir la théorie du « French Paradox ».

2.2.6. Synergie entre les antioxydants

L’arsenal de défense contre les espèces oxydantes n’est certes pas un ensemble de substances qui agissent individuellement. Il s’agit plutôt d’enzymes, de protéines et de molécules endogènes ou exogènes qui agissent en synergie pour réduire le plus possible les effets des espèces oxydantes. A titre d’exemple, les tocophérols sont réputés pour leur inhibition de la peroxydation lipidique et sont même cités comme les plus efficaces (Diplock, 1985). Mais la peroxydation lipidique peut également être prévenue grâce à toute une série de défenses, appelées de première ligne, qui comprennent les SOD, les catalases,