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UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES
Faculté des Sciences
Département de Biologie Moléculaire
Etude de la protéine CIRP et de sa fonction dans le métabolisme des ARN
messagers
DE LEEUW Frederic
LABORATOIRE DE CHIMIE BIOLOGIQUE
Travaux présentés en vue de l’obtention du grade de docteur en sciences (biologie moléculaire)
Directeur de Thèse : Véronique KRUYS
ii RESUME : La protéine CIRP (Cold Induced RNA binding Protein) est une petite protéine de liaison à l’ARN de 172 acides aminés, qui est constituée du côté amino-terminal d’un domaine de liaison à l’ARN de type RRM (RNA recognition motif), et d’une partie carboxy-terminale riche en glycine et arginine qui comprend plusieurs motifs RGG. Elle a été identifiée comme étant inductible par hypothermie mais aussi par irradiation aux UV et par hypoxie. Nous avons analysé son expression et sa localisation en réponse à différents stress cellulaires. Nous avons montré qu’un traitement à l’arsénite qui induit un stress oxydant n’altère pas l’expression de CIRP provoque sa localisation dans les granules de stress (SG).
Les SG sont des structures ribonucléoprotéiques cytoplasmiques contenant des complexes de pré-initiation incompétents pour la traduction, et qui s’accumulent dans les cellules exposées à un stress. Ces structures constituent des sites de triages des ARNm, dans lesquels les ARNm sont soit stockés en attente d’une réinitiation de la traduction une fois le stress surmonté, soit destinés à être dégradés. La protéine CIRP se localise dans les SG que ce soit suite à un stress cytoplasmique ou du réticulum endoplasmique. Nous avons montré également que la localisation de la protéine CIRP dans les SG se déroule indépendamment de la présence de la protéine TIA-1 qui a été décrite comme responsable de l’assemblage des SG. De plus la surexpression de la protéine CIRP conduit à la formation de SG. Nous suggérons donc qu’il existe plusieurs voies qui mènent à l’assemblage de ces structures. En outre, nous avons analysé la localisation de mutants par délétion de la protéine CIRP et avons montré que le domaine RRM et le domaine RGG peuvent indépendamment localiser la protéine dans les SG. Par contre, la méthylation des résidus arginine du domaine RGG est une modification nécessaire à la localisation de CIRP dans les SG. Ensuite, nous avons étudié la fonction de la protéine CIRP dans le métabolisme des ARN messagers. Nous avons montré par une méthode d’adressage, que CIRP est un répresseur de la traduction des ARNm et que le domaine carboxy-terminal est nécessaire et suffisant à cette fonction.
iii Je remercie le Laboratoire de Chimie Biologique de m’avoir accueilli et de m’avoir permis de réaliser mes travaux. Je remercie particulièrement Cyril Gueydan et Véronique Kruys, deux personnes passionnées, qui m’ont conseillé et guidé durant cette aventure.
Dans ces quelques lignes, je tiens également à remercier l’ensemble des membres du laboratoire, passés ou présents, Corinne, Romuald, Maryline, Vincent, Tong, Sabrina, Julie, Isa, Frothe, Nathalie et Yacine, pour m’avoir accompagné et épaulé durant ces années. Je salue particulièrement Yacine et Jérôme, amis et adeptes privilégiés de philosophie du fumoir. Vous tous, je vous salue bien bas.
iv
IINTNTRROODDUUCCTITIOONN .............................................................................................................................................................. 11
Généralités ... 1
LES PROCESSING-BODIES ... 3
Découverte et composition. ... 3
Les P-bodies et la dégradation d’ARNm ... 4
Les P-bodies et la surveillance ARN ... 5
Les P-bodies et les petits ARN ... 6
Les P-bodies et la répression de la traduction ... 7
Dynamique des P-bodies ... 7
Assemblage des P-bodies ... 8
LES GRANULES DE STRESS ... 10
Découverte ... 10
Composition ... 11
Induction et Assemblage des granules de stress ... 12
Les différents types de stress ... 12
Le rôle du facteur d’initiation eIF2α ... 12
Rôle des protéines TIA. ... 16
Dynamique des granules de stress ... 17
Réversibilité des SG ... 17
Echange cytoplasme-SG et équilibre avec les polysomes ... 17
Biochimie des SG. ... 18
Les SG et le cytosquelette... 18
Fonction des SG ... 19
Implication des SG dans différents systèmes de régulation ... 20
Liens entre les P-bodies et les granules de stress ... 21
Autres granules RNPm ... 22
Les granules des cellules germinales. ... 22
Les granules des cellules neuronales ... 23
v
LA PROTEINE CIRP ... 24
Découverte ... 24
Structure ... 24
Expression... 25
Localisation... 25
Fonction ... 26
LA METHYLATION SUR ARGININE ... 27
La famille des arginine méthyltransférases : un aperçu... 27
Structure des arginine méthyltransférases ... 28
Les motifs cibles des méthyltransférases ... 28
Expression et localisation cellulaire ... 28
Fonctions ... 29
Méthylation sur arginine et protéines de liaison à l’ARN ... 29
Réversibilité de la méthylation sur arginine. ... 30
BUBUT T DDU U TTRRAAVAVAILIL ...................................................................................................................................................... 3232 RRESESUULLTTAATTSS............................................................................................................................................................................ 3333 Etude de l’expression et de la localisation de CIRP suite à un stress oxydant . 33 Localisation de la protéine CIRP dans les granules de stress suite à un stress oxydant ... 34
Localisation de la protéine CIRP en réponse à d’autres types de stress. ... 35
Localisation de la protéine CIRP dans les SG en absence des protéines TIA-1 ou TIAR. ... 36
Formation de SG suite à la surexpression de la protéine CIRP ... 36
Caractérisation des domaines responsables de la localisation de CIRP dans les SG ... 37
Rôle de la méthylation sur arginine dans l’export nucléaire de CIRP et dans son recrutement dans les SG. ... 39
Etude de la fonction de CIRP dans la régulation post-transcriptionnelle des messagers ... 40
Caractérisation du rôle de CIRP dans le métabolisme des ARNm par une méthode d’adressage ... 41
vi
DDISISCCUUSSSSIIONON EETT PPEERRSPSPEECCTTIIVEVESS .............................................................................................. 4444
De la protéine CIRP comme marqueur spécifique des SG ... 44
De la distribution nucléocytoplasmique de CIRP ... 44
Du rôle des différents domaines de CIRP dans son adressage aux SG ... 45
De l’effet de la méthylation sur la migration de la protéine CIRP dans les SG 46 Du rôle de CIRP comme répresseur traductionnel ... 46
Des déterminants de la répression traductionnelle de CIRP ... 47
Du rôle de CIRP dans les SG ... 47
Des différentes fonctions cellulaires de CIRP ... 48
De la formation des granules de stress ... 49
De l’étude de la régulation post-transcriptionnelle ... 50
AANNNNEEXXEESS .................................................................................................................................................................................... 5252 MATERIEL ET METHODES ... 52
Matériel ... 52
Construction de plasmides ... 52
Mesure d’activité luciférase ... 52
Analyse par Northern blot et RT-PCR... 53
Anticorps et Western Blot ... 53
Fractionnement nucléocytoplasmique. ... 53
Culture cellulaire et traitements ... 53
Fixation des cellules et immunofluorescence ... 54
Analyse de la méthylation sur arginine ... 54
BIBLIOGRAPHIE ... 56
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I I N N T T R R O O D D U U C C T T I I O O N N
Généralités
Chez les eucaryotes, dès la transcription, les protéines de liaison à l’ARN joue un rôle primordial dans le destin des ARNm. Ceux-ci, depuis leur naissance jusqu’à leur dégradation, sont accompagnés par toute une série de facteurs, parmi lesquels certains y sont liés de manière stable, tandis que d’autres sont l’objet d’échanges dynamiques. Cet ensemble constitué de l’ARNm, des protéines qui y sont fixées, plus les éventuels petits ARN non codant associés forme ce que l’on appelle le « complexe ribonucléoprotéique messager», (en anglais messenger ribonucleoprotein particle), ou RNPm. Cette combinaison de facteurs est responsable de (quasiment) tout ce qui arrivera à l’ARNm dans le cytoplasme. Chez la levure, on estime le nombre de protéines de liaison à l’ARN aux alentours de 570 (Costanzo et al.
2001). Ce nombre est beaucoup plus élevé chez les eucaryotes supérieurs. En effet, chez l’homme, le seul motif de liaison à l’ARN de type RRM est présent dans à peu près 500 gènes différents (Maris et al. 2005). Les autres types de domaines de liaison à l’ARN sont notamment: le domaine KH, le dsRBD (pour double-stranded RNA binding domain), les doigts de zinc, les motifs RGG. La plupart des protéines de liaison à l’ARN messager fixent celui-ci sur des motifs ou séquences spécifiques. Ceux-ci se situent principalement dans les extrémités non-traduites de l’ARNm (UTR) en 5’ ou en 3’.
Les différents composants du RNPm qui fixent l’ARNm peuvent être considérés comme des adaptateurs, qui seraient l’interface entre le messager et les différents mécanismes cellulaires responsables de la localisation subcellulaire, la traduction, la dégradation de l’ARNm mais aussi des voies de transduction. Evidemment, ces adaptateurs peuvent soit avoir une action positive et jouent alors le rôle d’activateurs, soit un effet négatif et jouer le rôle d’inhibiteurs. De plus, ces adaptateurs sont eux aussi soumis à des systèmes de régulation, notamment par modification post-traductionnelle comme, par exemple, la phosphorylation, ce qui peut avoir des répercussions sur leur capacité d’interaction, que cela soit avec l’ARNm ou des partenaires protéiques. Ainsi, en contenant différents sites de liaison
2 pour différents facteurs, les ARNm voient leur expression régulée de manière très fine. Il en résulte que les mécanismes de régulation post-transcriptionnelle de l’expression génétique sont au moins aussi complexes que ceux qui ont mené à la synthèse du messager (Keene et Tenenbaum 2002, Hieronymus et Silver 2004). Pour cette raison, les RNPm ont été comparés à des « opérons post-transcriptionnels » (Keene et Tenenbaum 2002, Keene 2007, Moore 2005). Ces dernières années, alors que l’on a découvert chez les eucaryotes supérieurs un nombre de gènes moins important que prévu, on y découvre une régulation post- transcriptionnelle de plus en plus complexe.
Parmi ces mécanismes de régulation, nous nous intéresserons dans les pages qui suivent à des structures cytoplasmiques particulières, les granules RNPm : en particulier les Processing Bodies (P-bodies) et, surtout, les granules de stress (SG). Les P-bodies représentent un agrégat de RNPm non-traduits et un lieu de dégradation des ARNm. Ces structures sont impliquées dans de nombreux mécanismes de régulation. Les granules de stress sont des structures ribonucléoprotéiques cytoplasmiques contenant des complexes de pré-initiation incompétents pour la traduction, et qui s’accumulent dans les cellules exposées à un stress environnemental. Ces structures constituent probablement des sites de triages des ARNm, dans lesquels les ARNm sont soit stockés en attente d’une réinitiation de la traduction une fois le stress surmonté, soit destinés à être dégradés. Ensuite, nous nous intéresserons à une petite protéine de liaison à l’ARN : la « Cold Inducible RNA-binding Protein » (CIRP) qui contient un domaine de liaison à l’ARN de type RRM ainsi que des motifs RGG, et dont la fonction n’est pas élucidée. Enfin, nous étudierons un cas de modification post- traductionnelle, la méthylation sur arginine des protéines de liaison de l’ARN.
3
Le L es s P P ro r oc c e e ss s si i ng n g- -b bo od di ie es s
Les P-bodies (pour «mRNA-Processing bodies ») sont des granules cytoplasmiques ribonucléoprotéiques formés entre autre des composants de la machinerie de dégradation d’ARN 5’-> 3’, de la surveillance ARN, des complexes impliqués dans le silence des gènes par petits ARN.
Découverte et composition.
En 1997, Bashkirov et al. observent que XRN1, la principale exoribonucléase 5’ 3’
présente dans le cytoplasme chez les eucaryotes, se localise dans des petites structures cytoplasmiques granulaires pour former des foyers discrets enrichis en cette protéine. L’idée que ces foyers soient des sites de dégradation d’ARN fut émise cinq ans plus tard, après que soit observé le fait que l’enzyme qui clive la coiffe 5’ des ARNm (DCP2) ainsi que ses co- facteurs colocalisent avec XRN1 dans ces foyers cytoplasmiques, et ce à la fois chez la levure comme chez les eucaryotes supérieurs (van Dijk et al. 2002, Ingelfinger et al 2002, Lyke- Andersen 2002, Sheth et Parker 2003, Cougot et al. 2004). Parallèlement, on observa que la protéine GW182, alors de fonction inconnue mais cible d’une maladie humaine auto-immune, formait également des foyers cytoplasmiques (appelés GW-bodies) (Eystathioy et al. 2002).
Assez vite, on montra que les GW bodies étaient des P-bodies (Eystathiov et al. 2003) et à l’aide de sérum de patients atteints de cette maladie auto-immune, on découvrit d’autres composants des P-bodies, Rap55 (ou Lsm14) et Ge-1 (ou Hedls), tous deux impliqués dans le décoiffage des ARN messagers (Eystathiov et al. 2003). Il est à noter que GW182 ou Ge-1 n’ont pas d’orthologue chez la levure, ce qui est une première indication d’une complexification de ces structures durant l’évolution. Le fait que les P-bodies soient observables constitutivement dans des cellules de mammifères et pas chez la levure, où ils ne le sont que suite à une surexpression ou à la déplétion de certains de leurs composants ou en réponse au stress, supporte également cette idée.
Par la suite, le nombre de protéines répertoriées dans les P-bodies a fortement augmenté (voir tableau 1). On y retrouve, outre des protéines de dégradation des ARNm, des éléments de la surveillance ARN (Nonsense Mediated Decay), de l’interférence ARN et de la répression de la traduction. Il est important de signaler que les protéines ribosomales ainsi que
4 celles du complexe d’initiation de la traduction sont absentes des P-bodies, à l’exception, chez les mammifères, de la protéine de liaison de la coiffe eiF4E et de son partenaire d’interaction, eiF4E-T (Teixeira et al. 2005, Brengues et al. 2005, Andrei et al. 2005). La composition des P-bodies indique qu’ils sont impliqués dans de nombreux modes de régulation post- transcriptionnels et que donc, ils jouent un rôle important dans la régulation de l’expression génétique.
Les P-bodies et la dégradation d’ARNm
Chez les eucaryotes il existe deux voies de dégradation des ARNm. Les deux voies sont précédées par la dégradation de la queue poly(A) du messager suite à l’action de déadénylases (pour revue : Parker et Song 2004). Ensuite, l’ARNm est dégradé soit via une voie 3’5’qui est réalisée par un complexe exonucléolytique appelé l’exosome, lui-même régulé par le complexe SKI. Concernant la seconde voie, la coiffe du messager est éliminée par le complexe de décoiffage, composé de DCP2 associé à de nombreux cofacteurs, et l’ARNm peut alors être dégradé par XRN1, une exonucléase à activité 5’ 3’ (figure 1).
Il est intéressant de remarquer que toutes les protéines impliquées dans la voie de dégradation 5’ 3’ sont répertoriées dans les P-bodies (voir tableau 1) mais que les protéines de l’exosome ou du complexe SKI en sont apparemment exclues (Sheth et Parker 2003, Brengues et al. 2005), ce qui indique une certaine compartimentation du cytoplasme au niveau de la dégradation des ARNm.
Dès lors, il était important de savoir si les P-bodies représentent effectivement des sites de dégradation d’ARNm ou une réserve d’enzymes de dégradation. Le traitement des cellules à l’actinomycin D, inhibiteur de la transcription, a révélé que l’ARNm est nécessaire à la formation de ces structures (Cougot et al. 2004, Teixeira et al. 2005). De plus, si l’on bloque la dégradation des ARNm en inhibant la déadénylation, on inhibe la formation des P- bodies (Sheth et Parker 2003, Andrei et al. 2005). Par contre, l’inhibition de cette dégradation lors d’une étape plus tardive, par inactivation de XRN1, entraîne une augmentation du nombre et de la taille de ces foyers. Enfin, on a mis en évidence la présence d’intermédiaires de dégradation des ARNm dans les P-bodies (Sheth et Parker 2003, Cougot et al. 2004, Teixeira et al. 2005, Andrei et al. 2005). L’ensemble de ces résultats montrent que non seulement ces structures sont des sites de dégradation d’ARNm mais qu’en plus leur présence est liée à la quantité d’ARNm à dégrader.
Cependant, la plupart des composants de P-bodies se retrouvent également de manière diffuse dans le cytoplasme. De plus, il existe des échanges dynamiques de
5 composants entre les P-bodies et le cytoplasme. Il se pourrait donc qu’il y ait une dégradation 5’3’ en dehors des P-bodies ou que celle-ci soit au moins initiée dans le cytoplasme.
Les P-bodies et la surveillance ARN
Au cours de l’évolution, les cellules eucaryotes ont acquis des systèmes de contrôle qualité de l’ARNm (Fasken et Corbett 2005). Parmi ceux-ci, le mécanisme NMD (pour non- sense mediated decay) provoque la dégradation d’ARNm qui contiennent des codons d’arrêt de la traduction prématurés, afin d’empêcher la traduction de protéines potentiellement toxiques (pour revue : Conti et Izaurralde 2005). Un arrêt prématuré de la traduction provoque l’assemblage d’un complexe composé des protéines UPF1-3, qui sont conservées chez tous les eucaryotes, et des quatre protéines effectrices additionnelles SMG1 et SMG 5-7, qui elles ne se retrouvent pas chez S. cerevisiae (voir figure 2B).
Bien que l’on ne sache pas exactement comment le complexe s’assemble sur l’ARNm, il est établi que le complexe de NMD recrute les enzymes des voies de dégradation de l’ARN que sont l’exosome et le complexe de décoiffage. Le mode d’entrée de l’ARN dans les voies de dégradation varie entre espèces. Les voies 3’ 5’ et 5’ 3’ coexistent généralement mais chez la levure, par exemple, la dégradation se fait principalement via la voie 5’3’.Il se pourrait donc que des P-bodies aient un rôle éventuel dans la surveillance ARN.
Dans les cellules de mammifères, il a été observé que SMG7 non seulement se localise dans les P-bodies, mais provoque l’accumulation d’UPF1 et SMG5 dans ces foci (Unterholzner et Izaurralde 2004, Fukuhara et al. 2005). De plus, SMG7 interagit (probablement associée à SMG5) avec la forme phosphorylée d’UPF1 (qui est la forme d’UPF1 associée à UPF2 et UPF3) et promeut sa déphosphorylation (forme où UPF1 est libre) (voir figure 2A). Ces observations suggèrent que l’assemblage du complexe NMD est lié aux P-bodies. Dès lors, on peut supposer que soit le complexe NMD emmène l’ARNm à dégrader dans les P-bodies, ou soit que les P-bodies soient recrutés suite à l’activation du complexe, et que la formation des P-bodies soit une conséquence de la mise en place du NMD.
Il faut cependant remarquer que chez S. cerevisiae, le NMD a lieu en condition de croissance normale alors les P-bodies sont difficilement observables dans ces conditions (Shet et Parker 2006). De même, dans des cellules de D. melanogaster appauvries en GW182, où la formation des P-bodies est donc inhibée, le NMD est toujours actif et efficace (Rehwinkel et al. 2005). Ces résultats indiquent donc que la formation des P-bodies serait plutôt une conséquence qu’une cause de la mise en place de NMD.
6 Les P-bodies et les petits ARN
Les siARN (petits ARN interférants - small interfering RNA) et les miARN (ou microARN), sont deux types de petits ARN impliqués dans la régulation post- transcriptionnelle (pour revue Bartel 2004). Bien que leur biogenèse soit différente, leur action est médiée par une même famille de protéines très conservées : les protéines Argonaute, présentes dans les P-bodies.
Le siARN est parfaitement complémentaire à l’ARNm cible et amène les protéines Argonaute à cliver celui-ci (voir figure 3A). La dégradation des fragments qui en résultent est exécutée par l’exosome et XRN1. Chez les plantes, le miARN agit de manière similaire. Chez l’animal, le miARN est généralement partiellement complémentaire à sa cible et inhibe l’expression du messager par deux mécanismes : par répression de sa traduction et par accélération de sa dégradation (voir figure 3B). Celle-ci ne se fait pas par clivage mais en menant la cible vers la machinerie de dégradation de l’ARNm. En effet, il a été montré que les miARN accélèrent la déadénylation de leurs cibles. L’action des miARN nécessite les protéines Argonaute, GW182, DCP1-DCP2, XRN1 et le complexe de déadénylation CCR4- CAF1-NOT. L’ensemble de ces protéines se localise dans les P-bodies (voir tableau 1). De plus, on y retrouve également les siARN, les miARN, ainsi que les ARNm cibles (Liu et al 2005, Pillai et al 2005, Bhattacharyya et al. 2006). Ces observations suggèrent fortement un lien entre les P-bodies et la régulation post-transcriptionnelle par les petits ARN.
Cependant, on retrouve également les différents facteurs cités ci-dessus sous forme libre dans le cytoplasme. La question est donc de savoir si les P-bodies constituent des structures nécessaires à l’action des petits ARN. Plusieurs observations ont été faites.
Premièrement, dans les cellules humaines et de drosophile, l’absence de GW182 mène à une forte inhibition de la voie de dégradation par les miARN mais n’inhibe que partiellement la voie de dégradation par siARN, la fonction de clivage de la protéine Ago2 n’étant que légèrement altérée (Chu et Rana 2006). Deuxièmement, que ce soit à l’aide de drogues inhibitrices de ces structures ou par l’inactivation de facteurs nécessaires à leur formation, il a été montré qu’en absence de P-bodies, la voie du siARN n’est pas affectée et que le miARN continue de réprimer l’expresssion de ses cibles (Chu et Rana 2006). Dès lors, l’accumulation des protéines Argonaute, des siARN, des miARN et de leurs ARNm cibles serait une conséquence plutôt que la cause de cette régulation.
7 Les P-bodies et la répression de la traduction
Les miARN ne jouent pas qu’un rôle dans la dégradation des ARN mais peuvent aussi réprimer la traduction de leur cible, et dans beaucoup de cas, sans affecter la stabilité de l’ARNm (Valencia-Sanchez et al. 2006). Les mécanismes moléculaires ne sont pas encore connus mais il a été montré que des constituants des P-bodies y jouent un rôle. En particulier, la protéine GW182 qui est nécessaire à la formation des P-bodies, l’est également, dans des cellules de drosophile ou humaines, à la voie de répression de la traduction par les miARN (pour revue : Behm-Ansmant et al. 2006). De même, l’absence de RCK/p54 qui provoque le désassemblage des P-bodies, induit également la perte de fonction de miARN (Chu et Rana 2006). Ceci, plus les observations décrites ci-dessus, montre que les P-bodies sont liés aux fonctions non seulement de dégradation mais aussi d’inhibition traductionnelle par les miARN.
Les P-bodies sont également impliqués dans la répression de la traduction via d’autres mécanismes. En effet, chez la levure, certaines conditions physiologiques, comme la privation de glucose, induisent la dissociation des polysomes et provoquent l’augmentation en taille et en nombre des P-bodies, où s’accumulent les ARNm (Teixeira et al. 2005, Brengues et al.
2005). Chez les eucaryotes supérieurs, on retrouve un certain nombre de protéines impliquées dans la répression de la traduction, telles que RCK/p54, CPEB, eiF4E-T dans les P-bodies (voir tableau 1).
De plus, un lien entre les polysomes et les P-bodies a été démontré par l’utilisation de la cycloheximide (Sheth et Parker 2003, Cougot et al.2004). Cette drogue inhibe la traduction durant l’élongation en figeant les polysomes, et cette stabilisation mène au désassemblage des P-bodies. Par contre, l’utilisation d’inhibiteurs de l’initiation de la traduction favorise la formation de ces structures. Ces résultats suggèrent que les P-bodies résultent de l’accumulation de mRNP non traduits.
Dynamique des P-bodies
De nombreuses protéines qui composent les P-bodies interagissent entre elles sous forme de complexes. Ainsi, on trouve chez les mammifères des complexes de décoiffage des ARNm composés des enzymes DCP1, DCP2 et de co-activateurs Ge-1, RCK/p54, EDC3 (Fenger-Gron et al. 2005). Chez la levure, des protéines impliquées dans la dégradation de l’ARN telles que les protéines Pat1, Dhh1, XRN1 et le complexe LSm1–7 peuvent être immunoprécipitées sous forme de complexes (Bouveret et al. 2000). De même, GW182, RCK/p54, DCP1-2 et les protéines Argonaute interagissent entre elles indépendamment de
8 leur liaison à l’ARN (Chu et Rana 2006, Meister et al. 2005, Eulalio et al. 2007a). Il est donc probable qu’une protéine se localise dans les P-bodies de par ses interactions avec d’autres protéines, et que la formation même de ces structures soit le résultat de ces réseaux d’interactions (voir figure4).
Les P-bodies ne sont pas de gros complexes figés, ou encore des précipités non spécifiques, ce sont des structures dynamiques. En effet, leur taille et nombre varient selon les conditions physiologiques et il a été montré que les protéines et les ARN qui constituent les P-bodies y entrent et en sortent de manière réversible (Teixeira et al. 2005, Brengues et al.
2005, Kedersha et al. 2005, Wilczynska et al. 2005, Bhattacharyya et al. 2006). De plus, il est à noter que la présence de ces structures varie avec le cycle cellulaire : abondantes en phase S tardive et en phase G2 mais faible à inexistante dans les cellules mitotiques (Yang et al. 2004, Lian et al. 2006).
Une des étapes importantes de la régulation de l’expression génétique est la transition pour les messagers de l’état actif de traduction en association avec les polysomes, à un état inactif de traduction. Il est probable qu’en fin de cycle de traduction, il y ait des modifications du complexe mRNP pour réprimer la traduction du messager. De même, certaines modifications peuvent mener à la dégradation de l’ARNm. Comme la formation des P-bodies nécessite des ARN non-traduits, mais qu’ils ne comprennent pas de ribosome ou de facteur de traduction et étant donné leur structure dynamique, il a été proposé que les P- bodies correspondent à ce lieu d’état inactif de traduction, provisoire ou définitif, et/ou de dégradation (Eulalio et al. 2007a).
Assemblage des P-bodies
Les mécanismes d’assemblage des P-bodies ne sont pas connus. Cependant, il été montré que les protéines GW182 ou Ge1 sont nécessaires à la formation de ces structures et que leur surexpression conduit à des P-bodies plus grands (Eystathioy et al. 2002, Yu et al.
2005). Ces protéines constituent donc des candidats potentiels pour l’assemblage de ces structures. De plus, l’expression de GW182 durant le cycle cellulaire est corrélée à la présence des P-bodies dans le cytoplasme (Yang et al. 2004, Lian et al. 2006). Cependant, on ne trouve pas d’orthologue de GW 182 chez la levure, ce qui suggère que plusieurs mécanismes contribuent à l’assemblage des P-bodies. Il y a également d’autres protéines dont l’absence inhibe la formation des P-bodies. Ainsi, Lsm1, RCK/p54, eIF4E-T ainsi que les protéines impliquées dans la voie de régulation par miARN (comme la protéine Drosha) sont également nécessaires à la formation des P-bodies (voir tableau 1).
9 Récemment, il a été montré qu’exclure les ARNm de leur cycle de traduction dans les polysomes n’est pas suffisant pour la formation des P-bodies. En effet, il faut que les ARNm soient engagés dans des mécanismes de répression traductionnelle par petits ARN et/ou des voies de « décoiffage » pour que ceux-ci se localisent dans ces structures. Ceci et le fait que les processus impliqués dans les P-bodies se déroulent même en absence de P-bodies confirment que leur formation ne soit pas la cause mais bien une conséquence des différents mécanismes de régulation du métabolisme de l’ARNm (Eulalio et al. 2007b).
De manière intéressante, un lien entre le cytosquelette et les P-bodies a été mis en évidence chez la levure. En effet, la déstabilisation des microtubules, à l’aide d’une drogue (le bénomyle), favorise la formation des P-bodies, et ce, alors que les taux de traduction et de dégradation de l’ARN sont inchangés, ce qui exclut que la formation de P-bodies soit une réponse au stress (Sweet et al. 2007). De plus, un lien direct entre le cytosquelette et les P- bodies est suggéré par l’interaction des protéines constituant les microtubules Tub2p et Tub3p avec Dcp1p et Edc3p, deux composants de P-bodies (Gavin et al. 2006), de même que la présence d’α-tubuline, Tub1p, dans les P-bodies. Pour tenter d’expliquer ces observations, les auteurs proposent un modèle dans lequel les microtubules inhiberaient la formation de P- bodies en interagissant, directement ou indirectement, avec un ou plusieurs de leurs constituants, empêchant ainsi leur assemblage.
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Le L e s s G Gr r a a nu n ul le e s s d de e S St tr r e e ss s s
Découverte
Chez la plupart des organismes vivants, le stress cellulaire induit une inhibition générale de la traduction. Ceci permet une réaction rapide de la cellule : les fonctions de
« routine » et « maintenance » (house-keeping) sont arrêtées, pour faire place aux mécanismes de réponse au stress, afin d’augmenter les chances de survie de la cellule. Chez les eucaryotes, cette inhibition générale de la traduction implique la phosphorylation du facteur d’initiation de la traduction eIF2, entraînant un arrêt de la traduction. Cette inhibition ne s’accompagne pas nécessairement d’une dégradation des ARNm (Storti et al. 1980). Ceci suggère que les ARNm puissent être temporairement stockés par la cellule.
Dans les années 1980, on a découvert que lorsque des cellules de tomate (Lycopersicon peruvianum) sont soumises à un stress hyperthermique, des agrégats cytoplasmiques, contenant des petites HSP (pour heat shock protein : protéine de réponse au stress hyperthermique) se forment dans le cytoplasme. Ces foyers contiennent la plupart des ARN messagers à l’exception notable des ARNm codant pour des HSP (Nover et al 1983, 1989), ces dernières participant à la réponse au stress. Ces observations suggèrent que ces agrégats nommés granules de stress hyperthermique (HSG : Heat shock Stress Granule) soient le lieu où s’accumulent les ARNm qui ne sont pas traduits durant le stress subi, tandis que les ARNm de réponse au stress en sont spécifiquement exclus, leur traduction restant ainsi active.
Plus tard, l’équipe d’Anderson (Kedersha et al. 1999) a observé par immunofluorescence, dans des cellules de mammifères, que les protéines inhibitrices de la traduction TIA-1 et TIAR, se retrouvent dans des foyers cytoplasmiques en réponse à différents types de stress.
On y observe aussi la présence d’ARN polyA(+), ce qui suggère une fonction similaire des granules de stress de mammifères à celle des granules de plantes : un stockage des ARNm non traduits durant le stress cellulaire (Kedersha et al. 1999). De plus, d’autres protéines de liaison à l’ARN, telles que la protéine cytoplasmique de liaison au poly(A), la PABP s’y localise également. L’équipe d’Anderson suggère que la phosphorylation du facteur d’initiation de la traduction eIF2-alpha soit responsable de l’induction des granules de stress
11 (SG) et que la protéine TIA-1 soit impliquée dans l’assemblage de ces structures (Kedersha et al 2002, Anderson et Kedersha 2002, Gilks et al. 2004).
Composition
Les granules de stress sont des complexes qui n’ont jusqu’à présent pas pu être isolé par une approche biochimique. C’est pourquoi toutes les données sur leur composition ont été obtenues par microscopie à fluorescence, en utilisant les protéines TIA-1 et/ou TIAR comme marqueurs de ces structures. Ainsi, il été montré que certains éléments de la machinerie de traduction se localisent dans les SG (Kedersha et al. 1999, 2002, Kimball et al. 2003 Stoecklin et al. 2004). On y retrouve toujours la petite sous-unité ribosomale mais jamais la grande, ce qui indique l’absence de ribosome fonctionnel au sein des SG. La présence des facteurs d’initiation de la traduction indique que le complexe de préinitiation couplé au messager, le complexe 48S se localise dans les SG. Ces observations suggèrent que les SG constituent un réservoir de messagers, dont l’initiation de la traduction a été bloquée. Le fait que les SG soient formés par ces complexes laisse supposer une reprise rapide de la traduction de ces messagers après la disparition des SG, une fois le stress cellulaire surmonté.
On ignore la proportion d’ARNm qui suite à un stress se localise dans les SG. De plus, il ne semble pas y avoir de signal particulier nécessaire à un ARNm pour se localiser dans les granules (Kedersha et al. 2005). On suppose que tous les ARNm ne s’y retrouvent pas, c’est le cas par exemple du messager codant pour la protéine chaperonne Hsp70 (Kedersha et Anderson 2002). En fait, il semble que les ARNm impliqués dans la réponse au stress soient exclus des granules, leur traduction étant accrue durant le stress cellulaire.
Cependant, le mécanisme de sélection des ARN messagers dans les SG n’est pas connu.
Le nombre de protéines de liaison à l’ARN répertoriées dans les granules de stress a considérablement augmenté en quelques années (voir tableau 2). On y retrouve notamment des protéines impliquées dans le transport d’ARNm comme la protéine Staufen (Thomas et al.
2005), dans la régulation de la traduction comme FMRP ou CPEB (Mazroui et al. 2002, Wilczinska et al. 2005) et dans la stabilité d’ARNm. La présence dans les granules de stress de protéines reconnues pour être des régulateurs positifs (HuR) (Kedersha et al. 2002) ou négatifs (tristetraproline) (Stoecklin et al. 2004) de la stabilité des ARNm soulève la possibilité que les granules de stress n’aient pas seulement une fonction de stockage mais aussi une fonction de triage des ARNm destinés à être traduits ou dégradés (Kedersha et Anderson 2002, Stoecklin et al. 2004).
12 Des protéines ayant des propriétés enzymatiques se localisent également dans les granules de stress : la ribo-endonucléase associée à Ras-GAP, G3BP (Tourriere et al. 2003), l’endonucléase PMR1 (Yang et al. 2006) et la déaminase de cytidine APOBEC3G (Gallois- Montbrun et al 2007, Kozak et al.2006). La protéine Ago2 (Leung et al. 2006), impliquée dans la régulation de l’expression génétique par miARN, se localise également dans les SG.
De plus, les SG peuvent contenir des éléments de cascade de signalisation intracellulaire comme TRAF2 (Kim et al 2005) impliquée dans la voie d’activation de NF-kB par le TNFα.
Induction et Assemblage des granules de stress Les différents types de stress
Chez les eucaryotes, les réactions au stress impliquent toute une série de mécanismes de défense, regroupés sous le nom d’ISR (pour Integrated Stress Response). Parmi ceux-ci, on retrouve l’inhibition de la traduction à l’étape d’initiation et une augmentation de l’expression de différents facteurs de réponse au stress. Historiquement, les types de stress sont divisés en deux groupes selon les facteurs de réponse au stress induits (pour revue Brostrom et Brostrom 1998). Les stress du réticulum endoplasmique (ER), liés à des perturbations de l’homéostasie du calcium ou à des traitements par des agents réducteurs des groupements thiols, induisent l’expression de la famille des GRP (Glucose Related Protein). Les stress cytoplasmiques, comme le choc hyperthermique ou le traitement à l’arsénite qui provoque un stress oxydatif, induisent l’expression des HSP (pour Heat Shock Protein). Les deux types de réponse ne sont pas exclusifs et peuvent être activés simultanément.
Le rôle du facteur d’initiation eIF2α Régulation de la traduction par eIF2
Un des mécanismes majeurs de régulation de la traduction en cas de stress s’accompagne de la phosphorylation de la sous-unité α du facteur d’initiation eIF2 (pour revue, Kimball 1999). Durant l’initiation de la traduction, eIF2 forme un complexe avec le GTP et l’ARNt initiateur, le methionyl-ARNti (met-ARNti). Ce complexe, appelé complexe ternaire fixe ensuite la petite sous-unité ribosomale, le 40S, pour former le complexe de pré- initiation 43S (pour revue, Pain 1996). Sous l’action du complexe d’initiation eIF4F, formé par eIF4A, eIF4E et eIF4G, l’ARN messager lie le 43S et il en résulte le complexe de pré- initiation 48S (pour revue, McKendrick et al. 1999). Lors de l’une des dernières étapes d’initiation, le GTP lié à eIF2 est hydrolysé en GDP. Les facteurs d’initiation sont alors relâchés du ribosome, et la phase d’élongation peut commencer (Figure 5). Avant de lier un
13 met-ARNti et de former ainsi un nouveau complexe ternaire, le GDP associé à l’eIF2 doit être remplacé par un GTP. Cette réaction est catalysée par le facteur d’échange eIF2B (Figure 6).
La phosphorylation de la sérine 51 du facteur eIF2α séquestre eIF2B et empêche l’échange GDP/GTP. Cette inhibition provoque une diminution du taux du complexe ternaire eIF2- GTP-metARNt et conduit donc à une inhibition de la traduction.
eIF2 et l’induction de facteurs de réponse au stress
La phosphorylation d’eIF2α provoque une inhibition générale de la traduction mais conduit paradoxalement à une augmentation de l’expression de certains gènes de réponse au stress, notamment l’activateur de transcription ATF4 (voir figure 7). Ce mécanisme de régulation implique la capacité des ribosomes à scanner les ARNm et à ré-initier la traduction.
En effet, l’ARN messager d’ATF4 est constitué de deux micro ORF (Open Reading Frame : Cadre Ouvert de Lecture) qui précèdent, dans le sens 5’3’, la région codante pour ATF4. La première µORF est située en amont à une distance telle qu’elle permet une réinitiation de la traduction de la seconde µORF. Par contre, la distance entre la µORF2 et la région codant pour ATF4 est trop petite pour permettre une réinitiation de la traduction. Alors que la µORF1 recrute les ribosomes sur le messager, la seconde µORF inhibe la traduction de la région codante pour ATF4. En effet, en conditions normales, il y a peu de eIF2α phosphorylé, et donc une grande disponibilité du complexe ternaire et donc après avoir traduit la µORF1, la petite sous-unité du ribosome rescanne le messager et l’initiation s’effectue rapidement c’est- à-dire au niveau de la deuxième µORF. Par contre, en période de stress, eIF2α est phosphorylé, il y a peu de complexes ternaires disponibles, la réinitiation prend plus de temps, ce qui permet à la petite sous-unité ribosomale de passer la µORF2, et l’initiation se fait alors au niveau de la phase codant pour ATF4 (Lu et al. 2004, Vattem et Weck 2004). La production d’ATF4 ainsi que celle d’autres facteurs activent la réponse globale au stress (ISR : Integreted Stress Response), qui est un programme d’expression de gènes favorisant la survie de la cellule au stress cellulaire. Il est à noter que la traduction d’un autre facteur de transcription de réponse au stress, GCN4, est régulée par un mécanisme semblable mais le messager comporte, dans ce cas là, quatre µORF (Hinnebusch 1997).
14 La phosphorylation d’eIF2α : un mode d’induction des SG
Il est communément admis est que la phosphorylation d’eIF2 est nécessaire et suffisante à la formation des SG. Ce modèle est appuyé par plusieurs observations.
Premièrement, la surexpression d’un mutant (S51A) non-phosphorylable d’eIF2α bloque la formation des granules de stress (Kedersha et al. 2002). Deuxièmement, l’expression d’un mutant phosphomimétique (S51D) est suffisante pour induire la formation de SG. Enfin, des fibroblastes de souris n’exprimant que le mutant S51A ne sont pas capables d’induire la formation de SG suite à différents types de stress (arsénite, choc hyperthermique). Cependant, si ces cellules expriment également le mutant S51D, elles récupèrent cette propriété (Kedersha et al. 2002).
Des traitements avec des inhibiteurs de l’activité respiratoire des mitochondries provoquent la formation des SG, alors qu’eIF2α n’est pas phosphorylé (Stoecklin et al. 2004).
Cependant, ce phénomène n’est pas en contradiction avec les observations précédentes. La carence en énergie induite par le poison diminue le GTP disponible et la réaction d’échange GDP/GTP par eIF2B est alors fortement défavorisée. Il y a donc moins de complexes ternaires disponibles, comme lors de la phosphorylation de l’eIF2α.
Récemment, deux petites molécules naturelles, la patéamine A (extraite d’une éponge marine) et l’hippuristanol (extrait d’un corail) ont permis de démontrer un autre mécanisme d’induction des SG n’impliquant pas la phosphorylation de eIF2 (Dang et al 2006, Mazroui et al. 2006. Ces deux molécules inhibent la traduction en perturbant l’activité de l’hélicase eIF4A (Bordeleau et al. 2006, Low et al. 2005). Le rôle de l’eIF4 n’est jusqu’à présent pas élucidé. C’est une hélicase d’ARN dont l’activité consomme de l’ATP, qui forme le complexe eIF4F avec eIF4G et eiF4E. Ce complexe est responsable du recrutement des ribosomes en permettant la liaison du complexe 43S avec l’ARN messager. L’hippuristanol semble agir en inhibant la capacité d’eiF4A à se lier à l’ARN tandis que la patéamine A modifie l’affinité d’eIF4A pour ses partenaires d’interactions, eIG4G et eIF4E. Dans les deux cas, le recrutement du ribosome par l’ARNm est inhibé (Bordeleau et al. 2006, Low et al. 2005). En outre, cette inhibition de la traduction s’accompagne de la formation de SG, et ce, en absence de la phosphorylation de l’eiF2α (Mazroui et al. 2006, Dang et al. 2006). Les granules de stress induits par ces molécules semblent avoir la même composition que les SG induits par la phosphorylation d’eIF2α, à ceci près qu’eIF2 est absent des SG induits à l’arsénite mais présent dans les SG induits par la patéamine A (Dang et al 2006).
15 Les kinases d’eIF2α
Bien que l’état de phosphorylation d’eIF2 semble jouer un rôle important dans la formation des SG, peu d’études rapportent le rôle des kinases phosphorylant eIF2α dans ce contexte. Quatre kinases d’eIF2α ont été identifiées chez les mammifères : HRI, PKR, PERK, GCN2 (pour revue : Wek et al. 2006). Chacune d’elles est activée par différents types de stress (voir figure 6). L’activation de la kinase GCN2 est induite suite à une carence en acides aminés (pour revue : Kimball 2001), mais elle l’est également suite à d’autres stress qui ne sont pas directement liés aux carences nutritionnelles telles que l’irradiation aux UV (Deng et al. 2002) et l’inhibition du protéasome (Jiang et Wek 2005). La kinase PKR joue un rôle important dans la réponse à l’infection virale : elle est activée par de l’ARN double-brin et son expression est inductible par les interférons (Thomis et al. 1992). La kinase PERK (ou PEK) est une protéine membranaire située dans la membrane du réticulum endoplasmique (RE). Elle est activée suite à un stress du RE (pour revue : Harding et al. 2002). Elle est responsable de la formation de SG suite à la phosphorylation d’eIF2α lors d’un traitement à la thapsigargine qui bloque les pompes de calcium du RE (Kimball et al. 2002). La kinase HRI (heme regulated eIF2 kinase) a été identifiée comme un facteur d’inhibition traductionnel en cas de déficience en hème dans les réticulocytes (Crosby et al. 2000). L’activation de la kinase HRI dans les réticulocytes peut également être causée par un choc hyperthermique ou osmotique. De plus, une étude basée sur l’utilisation des fibroblastes de souris n’exprimant pas HRI suggère que cette kinase phosphoryle eIF2α suite à un traitement par l’arsénite induisant la formation des SG (McEwen et al. 2005). Ces résultats sont cependant contestés par des données contradictoires, utilisant également des fibroblastes de souris dépourvus de HRI, non publiées mais accessibles sur le site du laboratoire de David Ron (http://saturn.med.nyu.edu/research/mp/ronlab/Postings/HRI&As.html).
Localisation d’eIF2α dans les SG
La présence d’eIF2 dans les SG est controversée. Dans une première étude, l’équipe du Dr Anderson a montré que les SG induites à l’arsénite, comprennent les protéines TIA-1/R, eIF3, eIF4E, la petite sous-unité ribosomale et a noté l’absence de la grande sous- unité ribosomale, ainsi que d’eIF2 (Kedersha et al. 2002). Les SG semblent alors formés par l’accumulation de complexes 48S déficients en complexes ternaires (GTP-eIF2α-metARNti), qui sont nommés 48S*. Cependant, une autre étude montre que les SG formées suite à un traitement à la thapsigargine contiennent le facteur d’initiation eIF2 (Kimball et al 2003).
16 D’autre part, la patéamine A induit la formation de SG contenant eIF2 (Dang et al. 2006). Il semble donc que la localisation de l’eIF2α dans les SG soit dépendante de l’inducteur des SG.
Rôle des protéines TIA.
Les protéines TIA (TIA-1 et TIAR) sont des protéines de liaison à l’ARN, qui comportent du côté amino-terminal trois domaines de liaison à l’ARN de type RRM (RNA Recognition Motif), qui sont très conservés entre les deux protéines. Leur domaine carboxy- terminal présente une composition en acides aminés identiques à 50% et est riche en glutamine. Ce sont des protéines qui font la navette entre le noyau et le cytoplasme mais qui sont majoritairement nucléaires à l’état stationnaire dans les cellules somatiques. Au niveau du noyau, elles sont impliquées dans l’épissage alternatif de plusieurs messagers (Le Guinner et al. 2001). Dans le cytoplasme, elles exercent une inhibition traductionnelle de messagers porteurs de séquences riche en adénine et uracile (ARE : A-U Rich Element) au niveau de leur région 3’ non-traduite (3’ UTR : 3’ UnTranslated Region) tel que les messagers codants pour le TNFα (Piecyk et al. 2000), la cyclooxygénase-2 (Dixon et al. 2003) et le cytochrome C (Kawai et al. 2006).
Les protéines TIA sont associées à la découverte des SG dans les cellules de mammifères (Kedersha et al. 1999), et constituent des marqueurs de ces structures. La surexpression de TIA-1, induit spontanément la formation de SG (Gilks et al. 2004). De plus, la surexpression d’un mutant TIA-1 dépourvu de ses domaines RRM, domaines de liaison à l’ARN, inhibe la formation des SG, par un processus d’auto-aggrégation cytoplasmique (Kedersha et al. 1999). Ainsi, le domaine C-terminal des protéines TIA, en particulier celui de TIA-1, présente une similarité significative avec la protéine prion de mammifère PrP (Kedersha et al. 1999, Gilks et al. 2004), suggérant que les protéines TIA, du moins TIA-1, sont capables de s’oligomériser, via leur domaine carboxy-terminal. L’importance du pouvoir d’auto-aggrégation de la région carboxy-terminale de TIA-1 pour la formation de SG a été démontrée par le fait que sa substitution par la région prion (le domaine NM) de Sup35p ne modifie pas la capacité de TIA-1 de former des SG (Gilks et al. 2004). En outre, l’utilisation de fibroblastes de souris dépourvues du gène codant pour la protéine TIA-1 a permis de montrer que la présence de cette dernière est nécessaire à la formation des SG. TIA-1 est donc actuellement la seule protéine dont l’absence provoque une inhibition de la formation des SG (Gilks et al. 2004).
Dès lors, le mécanisme proposé de formation de SG est le suivant (voir figure 8) : la phosphorylation d’eiF2α entraîne une carence en complexe ternaire eiF2-GTP-ARNt
