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Expression et caractérisation de quatre protéines du
virus de la maladie de Marek homologues aux protéines
majeures de tégument VP22, VP16, VP13/14 et
VP11/12 du virus HSV-1
Fabien Dorange
To cite this version:
Fabien Dorange. Expression et caractérisation de quatre protéines du virus de la maladie de Marek homologues aux protéines majeures de tégument VP22, VP16, VP13/14 et VP11/12 du virus HSV-1. Sciences du Vivant [q-bio]. Université François Rabelais (Tours), 2001. Français. �tel-02829328�
Université de François Rabelais TOURS
Ecole doctorale : Santé, Sciences et Technologie Année Universitaire : 2000-2001
Pour l'obtention du Grade de Docteur de l'Université de Tours
discipline du doctorat: Science de la vie et de la santéOption : Virologie Moléculaire par
Fabien Dorange
Expression et caractérisation de quatre protéines du virus de la maladie de Marek homologues aux protéines majeures de tégument VP22, VP16, VP13/14 et VP11/12 du virus HSV-1.
Présentée et soutenue le 19 décembre 2001 M.J.F. Vautherot Jury : Examinateur M. P.Coursaget Rapporteur M. A. Epstein Examinateur M. A. Jestin Rapporteur M. E. Thiry Président M.P. Roingeard Directeur de thèse M. J.F. Vautherot
Liste des abréviations
aa : acide aminé
ARNm Acide ribonucléique messager AcMo Anticorps monoclonal
Bluo-Gal halogenated indolyl-β-D-galactoside
CAPS 3-cyclohexyl-amino-1-propane-sulfonic acid CESC Chicken Embryo Skin Cell
CEF Chicken Embryo Fibroblast Da, kDa Dalton, kiloDalton
DNTP 2’-désoxynucléotide 5’-triphosphate
°C degré Celsius
EDTA Acide Ethylène Diamine Tétracétique
E.coli Escherichia coli
HEPES Acide N-2-hydroxyéthylpipérazine-N’-2-éthane sulfonique HSV-1 Herpes Simplex Virus type 1
HVT Herpes Simplex of Turkey IF(I) Immunofluorescence (indirecte)
ORF “Open Reading Frame” cadre ouvert de lecture
MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide MDV Marek’s Disease Virus
m.o.i multiplicité d’infection
NBT/BCIP Nitro Blue Tetrazolium/5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate
PBS Phosphate Buffer Saline PCR Polymerase Chain Reaction SDS Sodium Dodécyl Sulfate u.f.p unité formant page
SAB Sérum albumine bovine
SP Sérum de poulet
1 PARTIE BIBLIOGRAPHIQUE
1.1 LES HERPESVIRIDAE
La famille des herpesviridae est composée de virus enveloppés à ADN bicaténaire de 120 à 235 kpb présents dans la majorité des espèces animales (mammifères, reptiles, oiseaux, poissons, amphibiens et mollusques) (Roizman et Sears, 1996). Bien qu’ayant intégré dans leur génome des gènes codant pour des protéines impliquées dans le métabolisme des acides nucléiques (thymidine kinase, dUTPase, etc), dans la synthèse de l’ADN (DNA polymérase, hélicase, primase) et dans la modification des protéines (protéine kinase), les herpèsvirus sont dépendants de la machinerie de transcription de l’hôte (ARN polymérase) ainsi que des enzymes impliquées dans la réparation de l’ADN. La réplication de l’ADN viral s’effectue donc dans le noyau des cellules infectées. Les herpèsvirus vont également contrôler la traduction, en détournant la machinerie de traduction de l’hôte au profit de la synthèse des protéines virales, en réprimant l’expression des gènes cellulaires et en inhibant la synthèse protéique cellulaire. L’accomplissement de leur cycle de réplication se traduit par la libération de particules virales infectieuses et par la lyse de la cellule infectée. Les herpèsvirus peuvent également entrer en latence dans la cellule infectée en n’exprimant qu’un nombre restreint de gènes (Roizman et Sears, 1996).
1.1.1 Structure des virions.
Les herpèsvirus forment un groupe relativement homogène en terme de structure. Le core contenant l’ADN viral est inclus dans une capside icosahédrique d’une taille variable 100 à 110 nm de diamètre entourée d’un tégument et d’une enveloppe dans laquelle sont ancrées les glycoprotéines virales (Fig. 1) (Roizman et Sears, 1996). La taille variable des virions (120 à 300 nm) pourrait être due à l’épaisseur du tégument qui diffère entre chaque virus (Granzow et al., 2001).
Figure 1: Structure de l’herpèsvirus simplex 1 (HSV-1) en microscopie électrique en coloration négative (De Hans Ackerman; adresse internet : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/Ima
Figure 1: Structure de l’herpèsvirus simplex 1 (HSV-1) en microscopie électrique en coloration négative (De Hans Ackerman; adresse internet : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ICTVdb/Images/Ackerman/Anima lvi/Herpesvi/025-01.htm). tégument capside enveloppe 100 nm
ges/Ackerman/Animalvi/Herpesvi/025-01.htm). fig1
1.1.1.1 Le core
Le core d’un virus contient l’ADN viral double brin sous la forme d’un tore à l’intérieur de la capside. L’ADN viral, linéaire à l’intérieur de la capside, se circularise immédiatement dès son entrée dans le noyau après sa sortie de la capside (Garber et al., 1993). La taille des ADN viraux varie de 120 kb (varicella-zoster virus (VZV) à 235 kb (mouse cytomegalovirus, human herpesvirus 8 (HHV8) et cytomegalovirus (CMV)). La structure des génomes varie essentiellement en raison de la distribution de séquences répétées, ce qui permet de distinguer six groupes de A à F (Fig. 2).
Figure 2 : Organisation génomique des herpèsvirus des groupes A à F (Roizman et Sears, 1996). Les lignes horizontales représentent les régions uniques. Les domaines répétés sont figurés par des rectangles et sont ainsi désignés : domaine répété gauche ou droit (LTR et RTR) pour le groupe A, domaines répétés internes R1 à R4 pour le groupe C et domaines répétés internes et terminaux (IR et TR) pour le groupe D. Les séquences terminales du groupe B sont composées de séquences réitérées présentes en nombre variable à chaque extrémité du génome. Le nombre de ces séquences réitérées peut varier entre les deux extrémités. Le groupe E est composé d’une séquence unique longue (UL) et d’une séquence unique courte (US) délimitées par des séquences répétées internes et externes (TRL, TRS, IRL et IRS). Aucune répétition terminale n’a été décrite pour le sous-groupe F.
fig2
L’action de détergent non ionique (NP-40) seul ou en conjonction avec des solutions de force ionique élevée a permis de différencier chaque élément structural (enveloppe, tégument et capside), de les purifier et d’en déterminer la composition protéique (Spear et Roizman, 1972) (Lemaster et Roizman, 1980) (McLauchlan et Rixon, 1992). Le détergent non-ionique NP-40 seul permet de séparer les glycoprotéines de l’ensemble tégument-capside ; l’augmentation de la molarité en NaCl permet la séparation des protéines de tégument de la capside (Fig. 3). Des études plus récentes portant sur la séparation des différents éléments mettent en évidence des interactions résistantes aux forces ioniques entre certaines protéines de tégument et la capside (Ojala et al., 2000).
Figure 3: Etude microscopique de particule virale de l’herpèsvirus équin 1 EHV1. a) virions possédant une membrane virale intacte ou perméable à la coloration négative. B) particules constituées du tégument et de la capside ou de la capside seulement C) Constituants tégumentaires partiellement accrochés à la capside (De Steven K. Vernon ; adresse internet : http://www.virology.net/Big_Virology/Special/EHV1/EHVpage.html).
fig3
1.1.1.2 La capside
La capside possède un diamètre d’environ 100 nm. Elle possède une structure icosahédrique (20 faces), et est constituée de 162 capsomères composés de 150 hexons et de 12 pentons (Fig. 4). Figure 4 : Capside A d’HSV-1 reconstituée à partir de micrographie électronique de capsides A enrobées dans de l’eau vitreuse (Du dr.Z.Hong.Zhou; adresse internet :
http://hub.med.uth.tmc.edu/~hong/hsv1a/hsv-1A-capsid.gif) (Zhou et al., 1999).
fig4
1.1.1.3 Le tégument
Le tégument, structure comprise entre la capside et l’enveloppe, est une des caractéristiques des herpèsvirus. Les premières études réalisées en microscopie électronique sur des particules virales purifiées décrivaient une structure asymétrique et amorphe en coloration négative. Cependant, les contraintes physiques de cette technique sur des virions non fixés semblent induire une déformation de la structure tégumentaire et un étirement de l’enveloppe virale. Les études récentes de cryomicrospie électronique montrent au contraire une structure tégumentaire mieux ordonnée (Fig. 3) (Zhou et al., 1999). Au cours de la maturation virale, le tégument apparaît comme une structure dont les variations de composition sont en relation avec le passage du virus dans des différents compartiments de la cellule (Granzow et al., 2001). La structure du tégument peut également varier considérablement d’un herpèsvirus à l’autre (Granzow et al., 2001).
1.1.1.4 L’enveloppe
L’enveloppe est composée de membranes cytoplasmiques altérées dans lesquelles sont ancrées les glycoprotéines virales (Fig. 3A).
1.1.2 Classification
La classification des herpèsvirus a été réalisée en fonction de leurs propriétés biologiques et a permis de distinguer trois grandes sous familles : les alphaherpesvinae, les betaherpesvirinae et les gammaherpesvirinae.
Les alphaherpèsvirus possèdent un large spectre d’hôtes, ont un cycle de multiplication très court, diffusent très rapidement en culture, lysent efficacement les cellules infectées et ont la capacité d’établir des infections latentes dans les neurones des ganglions sensoriels (HSV1, HSV2, VZV, EHV1, virus de la pseudorage (PrV)).
Les betaherpèsvirus ont une infection restreinte à certains types cellulaires, infection qui progresse très lentement en culture. Ces virus (cytomégalovirus) peuvent être latent dans un grand nombre de cellules (glandes sécrétrices, reins, et autres tissus).
Les gammaherpèsvirus se répliquent tous in vitro dans les cellules lymphoblastiques, et certains d’entre eux sont à l’origine d’une infection lytique dans des cellules de type épithélial et fibroblastique. Ces virus infectent spécifiquement les lymphocytes B et T et peuvent être soit à l’état latent soit en phase lytique.
La classification actuelle prend en compte les données de nouvelles séquences nucléotidiques et les études de phylogénie (McGeoch et al., 2000) ont permis de reclasser certains herpèsvirus en fonction de leur structure génomique et des homologies de séquence avec les virus prototypes de chaque famille. Cependant, pour ces virus la définition des sous-familles n’est plus adaptée. C’est le cas du virus de la maladie de Marek qui possèdent des propriétés biologiques propres aux gammaherpèsvirus, mais qui a été reclassé dans les alphaherpèsvirus en raison de sa structure génomique et des homologies de séquence avec les autres alphaherpèsvirus (Buckmaster et al., 1988). En effet, le MDV qui infecte spécifiquement les lymphocytes, possède une structure génomique de groupe E et les gènes de structure du MDV (capside, tégument et glycoprotéine) présentent une plus forte homologie avec ceux des alphaherpèsvirus (HSV-1, VZV, EHV-1 et EHV-4).
L’alphaherpèsvirus modèle de groupe E, HSV-1, nous a donc servi de base pour mener notre étude sur la partie tégumentaire du MDV.
Après une description de la structure virale, nous décrirons la réplication du virus HSV-1 avec un intérêt particulier pour le rôle des protéines de tégument dans la constitution de la particule virale, dans les modulations qu’elles exercent sur la réplication virale, de l’entrée du virion dans la cellule hôte jusqu’à la libération de particules nouvellement synthétisées.
Dans un second temps, nous décrirons la maladie de Marek, puis analyserons le génome du MDV, en décrivant les gènes potentiellement oncogéniques et les gènes homologues au alphaherpèsvirus codant pour les protéines structurales (protéines de capside, de tégument et glycoprotéines).
1.2 VIRUS HSV-1 : STRUCTURE, REPLICATION ET RÔLE DES
PROTÉINES DE TÉGUMENT.
1.2.1 Structure virale
La particule virale est composée de quatre structures différentes : la capside renfermant le core, le tégument qui assure la liaison entre les protéines de capside et les glycoprotéines virales ancrées dans l’enveloppe extérieure. La particule virale contient au moins 30 protéines (Roizman et Sears, 1996).
1.2.1.1 La capside
Lors d’une infection virale, trois types de capsides peuvent être visualisés en microscopie électronique et séparés par ultracentrifugation en gradient de densité en saccharose (Gibson et Roizman, 1972 , Perdue et al., 1976). La capside de type A qui ne contient pas d’ADN viral, la capside de type B contenant les protéines d’échafaudage, et la capside de type C contenant l’ADN. Ces capsides diffèrent dans leur constitution protéique. La capside de type A contient 4 protéines différentes : VP5 (protéine majeure de capside), VP19C et VP23 qui forment les triplexes (VP19C + 2VP23), et VP26 codées respectivement par UL19, UL38, UL18 et UL35 (Booy et al., 1994 , McNabb et Courtney, 1992b, Newcomb et al., 1993 , Schrag et al., 1989 ). La capside de type B, précurseur des capsides de type A et C, contient 3 protéines supplémentaires, les protéines d’échafaudage : VP21, VP22a et VP24 codées respectivement par les gènes UL26 (extrémité 3’), UL26.5, UL26 (extrémité 5’) (Fig. 5) (Newcomb et al., 1993). La protéase virale codée par le gène UL26 s’autodigère pour donner naissance à deux protéines : la protéine VP24 porteuse du site actif et la protéine VP21 (Fig. 5) (Deckman et al., 1992, Preston et al., 1992). Cette dernière est ensuite clivée dans sa partie C-terminale perdant ainsi 25 aa (Liu
et Roizman, 1993). L’extrémité 3’ des gènes UL26 et UL26.5 étant communes dans le génome viral, la protéine VP22a est également clivée par la protéase VP24, ce qui donne naissance à la protéine VP22c dépourvue des 25 aa C-terminaux de VP22a (Fig. 5), présente dans les capsides virales de type C (Liu et Roizman, 1993).
Figure 5 : clivage (C) et maturation des protéines d’échafaudage fig5
L’assemblage de la capside qui a lieu dans le noyau sera étudié plus tard au cours de la réplication virale.
1.2.1.2 Le tégument
Le tégument est composé d’au moins 15 polypeptides qui assurent la liaison entre les protéines de capside et les glycoprotéines de l’enveloppe (Heine et al., 1974 , Trus et al., 1999 , Wang et al., 2001, Zhou et al., 1999 ). Cinq protéines majeures de tégument ont été identifiées : VP22, VP16 ou α-trans-inducing factor (α-TIF), VP13/14, VP11/12 et VP1/2 codées respectivement par les gènes UL49, UL48, UL47, UL46 et UL36 (Campbell et al., 1984 , Elliott et Meredith, 1992, Honess et Roizman, 1974 , McLean et al., 1990 , McNabb et Courtney, 1992a , Spear et Roizman, 1972 ). Il paraît important de noter qu’un groupe de gènes colinéaires (UL49 à UL46) code pour des protéines de même localisation dans le virion. La protéine VP22 s’associe avec la protéine VP16 pour former le corps tégumentaire (Elliott et al., 1995). La protéine VP16 se lie au cours du cycle viral à d’autres protéines de tégument moins représentées dans le tégument mais jouant un rôle majeur dans la réplication virale comme la protéine VHS (virion host-shut off) (Smibert et al., 1994). La protéine kinase UL13 (UL13), les protéines UL11 (UL11) UL37 (UL37) et US11 (US11) font également partie du tégument (Daikoku et al., 1997 , MacLean et al., 1989 , MacLean et al., 1987 , Roller et Roizman, 1992, Schmitz et al., 1995 ). D’autres protéines présentes de façon mineure dans le tégument peuvent être également incorporées au cours de l’infection virale (ICP4, ICP0) (Yao et Courtney, 1989, Yao et Courtney, 1992).
1.2.1.3 Les glycoprotéines.
Les glycoprotéines ont fait l’objet d’intenses recherches du fait de leur position stratégique à la surface du virion. Sans vouloir faire une analyse exhaustive, nous avons voulu résumer les résultats les plus récents en les traitant sous forme synthétique.
Les glycoprotéines sont au nombre de 12 dont 10 sont des glycoprotéines de surface. Ces glycoprotéines sont impliquées à la fois dans l’attachement du virion sur la cellule hôte, sa pénétration dans la cellule infectée et dans sa diffusion de cellule à cellule. Au cours de leur maturation dans les vésicules golgiennes, la partie cytoplasmique de ces glycoprotéines interagit spécifiquement avec les protéines de tégument permettant le second enveloppement du virion (Wang et al., 2001) (cf infra). Les glycoprotéines gC (UL44), gE (US8), gG (US4), gI (US7) et gM (UL10) ne sont pas essentielles à l’entrée et à la sortie du virion HSV-1 (Roizman et Sears, 1996), mais jouent un rôle important dans l’attachement (gC) et dans la diffusion de cellule à cellule du virion (gE-gI). Les autres glycoprotéines, gB (UL27), gD (US6), gH (UL22) et gL (UL1), essentielles à la réplication virale, sont impliquées principalement dans la pénétration du virus et dans la fusion des membranes virales et cellulaires (Spear, 1993) (Roizman et Sears, 1996). La glycoprotéine gK (UL53) serait impliquée dans la sortie du virus (Jayachandra et al., 1997).
Pour le moment, la glycoprotéine gJ (US5) n’a pas été détectée dans les virions. La glycoprotéine gN (UL49,5) est une protéine associée aux membranes dans les cellules infectées.
1.2.2 Fixation, pénétration et transport des capsides vers le noyau.
1.2.2.1 Rôle des glycoprotéines.
L’entrée du virion dans la cellule est dépendante de la spécificité des glycoprotéines vis-à-vis des récepteurs présents à la surface cellulaire. Les virus herpès simplex 1 et 2 peuvent infecter un grand nombre de cellules, et ceci suggère que ces cellules possèdent des récepteurs communs et des mécanismes similaires impliqués dans l’entrée virale. L’entrée du virus HSV-1 dans la cellule hôte requiert la fusion des membranes cellulaires avec l’enveloppe virale (Spear, 1993). Cinq glycoprotéines participent à l’entrée du virus: les glycoprotéines gB, gC, gD, gH et gL (Fig. 6) (Spear, 1993). La première étape, qui est celle de l’attachement, dépend de la liaison entre la glycoprotéine gC et les héparanes sulfates présents sur la surface membranaire (WuDunn et Spear, 1989). Un virus délété du gène gC (gC-) peut encore se lier aux cellules et être infectieux, mais son niveau d’attachement est inefficace comparé au virus sauvage (1%) (Herold et al., 1991). Ce faible attachement est dû à la glycoprotéine gB qui possède également une activité de liaison à l’héparine (Herold et al., 1994). Un traitement enzymatique éliminant les héparanes sulfates de la surface cellulaire diminue significativement l’efficacité d’infection (WuDunn et Spear, 1989). La liaison entre la glycoprotéine gD avec un récepteur de la famille TNF (tumor necrosis factor), HVEM ou HveA (HSV-1 entry mediator A) est également nécessaire et
renforcerait l’attachement du virion sur la membrane cellulaire (Montgomery et al., 1996 , Warner et al., 1998). La glycoprotéine gD se lie également à deux autres récepteurs appartenant à la superfamille des immunoglobulines. Ces récepteurs, présents au niveau des jonctions adhérentes des cellules épithéliales, ont été nommés HveB et HveC ou nectin2 et nectin1, respectivement (Takahashi et al., 1999). L’incubation de formes solubles de la gD ou le traitement du virus par des anticorps neutralisants dirigés contre cette protéine n’affectent pas l’adsorption du virus à la surface de la cellule mais empêchent sa pénétration (Fuller et Lee, 1992). La glycoprotéine gD est donc impliquée dans l’attachement à la cellule, mais plus particulièrement dans la fusion des membranes cellulaires et virales.
Figure 6: Rôle des protéines de tégument et des glycoprotéines virales dans le cycle viral. Les capsides C et A sont représentées sous forme hexagonale noire et blanche, respectivement. Le tégument apparaît grisé. HS : héparanes sulfates
fig6
Les glycoprotéines gB, gD, et gH sont essentielles à la fusion et à la pénétration du virion dans la cellule (Cai et al., 1988 , Forrester et al., 1992, Ligas et Johnson, 1988 ). En présence de polyéthylène glycol, activateur de la fusion membranaire, les virus délétés de ces gènes sont capables d’initier l’infection (Cai et al., 1988, Forrester et al., 1992, Ligas et Johnson, 1988 ). Un virus gB- forme difficilement des plages et l’utilisation d’anticorps neutralisants anti-gB empêche l’entrée des virus (Navarro et al., 1992). Les glycoprotéines gH et gL forment un hétérodimère nécessaire pour la maturation de chaque protéine (Hutchinson et al., 1992a). La glycoprotéine gL est également impliquée dans la pénétration virale, et un virus gL- perd sa capacité à pénétrer les cellules (Roop et al., 1993). Par ailleurs, l’expression transitoire des quatre glycoprotéines gB, gD, gH et gL induit la fusion cellulaire qui est une étape essentielle dans la diffusion virale (Browne et al., 2001 , Turner et al., 1998). Le rôle de ses quatre glycoprotéines dans la diffusion du virus de cellule à cellule sera discuté plus loin. L’ensemble de ces interactions basées sur la fusion des membranes cellulaires et virales puis à l’entrée de l’ensemble tégument-capside, est le modèle généralement admis.
Un autre modèle a été proposé qui quant à lui est basé sur l’invagination et la perforation de la membrane plasmique (Wild et al., 1998). La particule virale au contact de la membrane plasmique et du cytoplasme resterait enveloppée avant de libérer la capside dans la cellule.
1.2.2.2 Rôle du tégument
Le rôle des protéines du tégument dans le cycle viral commence après la fusion des membranes cellulaires et virales (Fig. 6) (Morrison et al., 1998). Certaines protéines de tégument restent associées aux membranes cellulaires, alors que d’autres toujours présentes sur la particule virale sont au contact des protéines cellulaires cytoplasmiques (Batterson et Roizman, 1983, Lycke et al., 1988, Sodeik et al., 1997, Zhou et al., 1999). Les modalités de la dissociation restent à préciser mais il semble que la phosphorylation des quatre protéines majeures de tégument puisse intervenir dans leur dissociation de la capside et que celà corresponde à leur activation. Ces protéines sont phosphorylées par des protéines kinases virales et/ou cellulaires (Morrison et al., 1998). Cette phosphorylation favorise leur dissociation de la capside et correspond à une activation de leur fonction modulatrice du cycle viral et cellulaire. Ainsi, les quatre protéines majeures de tégument, VP22, VP16, VP13/14 et VP1/2 ont été étudiées. La protéine VP22 peut être phosphorylée par la protéine kinase virale UL13, mais aussi par les kinases cellulaires casein kinase II (CKII) et protéine kinase C (PKC). Deux sites potentiels de phosphorylation de la protéine VP22 ont été déterminés dans la partie N-terminale (71SSS73) et C-terminale (292SAS294) (Elliott et al., 1999). Les protéines VP16 et VP13/14 peuvent être phosphorylées par les kinases cellulaires PKA et CKII, PKC, PKA respectivement (Morrison et al., 1998). Par opposition la protéine VP1/2, qui serait liée aux pentons de la capside, n’est pas dissociée de la capside bien qu’elle puisse être phophorylée par la CKII (Morrison et al., 1998).
La capside virale est ensuite transportée à travers le cytoplasme jusqu’au noyau où elle se lie avec le complexe du pore nucléaire (NPC), et l’ADN viral serait alors injecté dans le nucléoplasme au niveau des pentons (Sodeik et al., 1997, Whittaker et Helenius, 1998). Le transport de la capside de la membrane plasmique au pore nucléaire se réalise en 1 heure grâce à la présence du cytosquelette cellulaire et plus particulièrement le réseau de microtubules (Fig. 6) (Sodeik et al., 1997). Le transport de la capside est réalisé par une interaction entre la dynéine, protéine motrice des microtubules, et les pentons (Sodeik et al., 1997). La protéine VP1/2 qui interagit avec les pentons de la capside, semble donc jouer un rôle important dans le transport de la capside, mais également dans la libération de l’ADN (Sodeik et al., 1997, Zhou et al., 1999). En effet, la protéine VP1/2 est supposée interagir avec l’importine β au niveau du NPC (Zhou et al., 1999). Cette interaction ou la phosphorylation de VP1/2 induirait un changement de conformation des pentons du virion permettant l’expulsion de l’ADN de la capside (Ojala et al., 2000). Ainsi, un virus n’exprimant pas VP1/2 est défectueux dans la libération de l’ADN dans le noyau cellulaire (Batterson et Roizman, 1983).
L’ADN est ensuite rapidement et efficacement éjecté de la capside dans le noyau et se localise près des domaines nucléaires ND10 en les perturbant (Maul et al., 1996).
1.2.3 La régulation de l’expression des gènes.
Les gènes viraux sont divisés en trois classes distinctes, α, β et γ, en fonction de leur expression au cours de l’infection virale (Honess et Roizman, 1975). Les gènes α sont les premiers gènes a être exprimés au cours de l’infection et sont nommés gènes très précoces ou IE (immediate early), viennent ensuite les gènes β (E=early), et enfin les gènes tardifs γ (L=late). Parmi les six gènes α (Carter et Roizman, 1996, Roizman et Sears, 1996), quatre codent pour des protéines nucléaires transactivatrices qui agissent au niveau transcriptionnel ou post-transcriptionnel pour activer l’expression des gènes β et γ. Les gènes β? qui ne sont exprimés qu’en présence de gènes α, sont exprimés 5 à 7 heures après l’infection. Ces gènes, au nombre de sept, codent pour des protéines impliquées dans la réplication de l’ADN (ADN polymérase, thymidine kinase, ...). Les gènes α et certains gènes β vont ensuite activer la transcription des gènes tardifs codant essentiellement pour des protéines structurales. Cette régulation en cascade de l’expression des gènes viraux est hautement régulée. L’inhibition des synthèses des protéines α et β au cours de l’infection est également observée et serait due à l’autorégulation des gènes α et à l’expression des gènes γ (Roizman et Sears, 1996).
1.2.3.1 Rôle de la protéine de tégument VP16.
L’initiation de la réplication virale est sous la dépendance des gènes α qui sont transactivés par la protéine de tégument VP16. La protéine VP16, apportée par le virion, s’associe avec la protéine HCF qui la relocalise dans le noyau de la cellule nouvellement infectée où VP16 va participer à l’initiation de la réplication virale (Campbell et al., 1984 , LaBoissiere et O'Hare, 2000, Mackem et Roizman, 1982 ). En effet, une fois l’ADN viral circularisé dans le noyau (Garber et al., 1993), la protéine de tégument VP16 transactive les six gènes α (Fig. 7) (Campbell et al., 1984). D’un point de vue fonctionnel, la protéine est divisée en deux parties, une partie N-terminale impliquée dans l’attachement à l’ADN et une partie C-terminale acide transactivatrice. La partie N-terminale se lie à des facteurs cellulaires, Oct-1 et HCF, puis ce complexe protéique se fixe sur une séquence consensus (TAATGARAT où R est une base purique) située en amont de chaque gène α (Preston et al., 1988). Cette fixation est en partie due au facteur de transcription Oct-1 qui possède une activité de liaison à l’ADN localisée dans son domaine POU (Kristie et Sharp, 1993).
La partie C-terminale de VP16 transactive ensuite les gènes situés en aval et à proximité de cette séquence (Hagmann et al., 1997). Ce domaine d’activation a été particulièrement bien étudié dans le cas de protéines de fusion ayant des domaines de fixation à l’ADN. En effet, la fusion du domaine de liaison à l’ADN de l’activateur GAL4 avec le domaine transactivateur de VP16 permet la création d’un activateur transcriptionnel fort (Sadowski et al., 1988). VP16 agirait en augmentant le taux d’assemblage du complexe de préinitiation de la transcription (Lin et Green, 1991), en interagissant avec des facteurs généraux de la transcription, comme TFIIB (Lin et al., 1991), TFIIA (Kobayashi et al., 1995), la TBP et TAFII40 (composants de TFIID) (Klemm et al., 1995). VP16 pourrait également favoriser le recrutement de l’ARN pol II au complexe de préinitiation (Hengartner et al., 1995). L’activation de VP16 au sein du complexe HCF et Oct-1 nécessite la présence d’une boîte TATA à proximité de la séquence TAATGARAT (Fig. 7). Ce mécanisme de transactivation permettrait au virus de ne transactiver spécifiquement que les gènes α (Hagmann et al., 1997).
Figure 7 : La transactivation par VP16. Le domaine C-terminal de VP16, représenté en gris, changerait de conformation en présence des facteurs de transcription, permettant ainsi la transactivation des gènes situés en aval du promoteur (Hagmann et al., 1997).
fig7
Ainsi, une lignée de cellules Vero exprimant de manière constitutive la protéine VP16 augmente de façon significative le nombre de foyers infectieux lorsque l’ADN viral est transfecté dans ces cellules (Werstuck et al., 1990).
Un virus muté dans le gène UL48 codant pour une protéine VP16 délétée de la partie C-terminale transactivatrice montre une expression réduite des gènes IE et ceci a pour effet d’induire une augmentation de la multiplicité d’infection pour donner naissance à une u.f.p. (Ace et al., 1989). Ce virus peut cependant être propagé en culture cellulaire, à une haute multiplicité d’infection, ce qui suggère que la fonction transactivatrice de VP16 n’est pas essentielle à la réplication virale. Un autre virus muté délété du cadre de lecture entier montre un défaut dans la maturation de la particule virale et ne peut être propagé en culture cellulaire (Weinheimer et al., 1992). Ce virus ne produit pas de virions enveloppés extracellulaires et montre une réduction dans l’efficacité d’encapsider l’ADN viral de 50 à 75% par rapport au virus sauvage. La synthèse protéique virale est également diminuée à des stades d’infections intermédiaires et tardifs dans des cellules infectées par ce virus délété du gène UL48.
L’étude de ces deux virus montre que l’activité transactivatrice de VP16 favorise l’entrée en cycle lytique d’un virus infectieux dans une cellule permissive mais également que VP16 joue un rôle essentiel dans la maturation de la particule virale ainsi que dans la synthèse des protéines virales (cf infra).
Les protéines de tégument VP11/12 et VP13/14 ont été décrites comme modulateur de l’activité transactivatrice de VP16 (Zhang et McKnight, 1993, Zhang et al., 1991) et la protéine VP22, qui se fixe sur la partie transactivatrice de VP16, pourrait également moduler son activité (Elliott et al., 1995). Des résultats récents indiquent que la protéine VP13/14 pourrait également transactiver l’expression des gènes viraux en absence de VP16 (Donnelly et Elliott, 2001c). 1.2.3.2 Les gènes α
Les premiers ARNm viraux apparaissant dans le cytoplasme de la cellule infectée vont coder pour les 6 protéines α : ICP0 (infected cell protein 0), ICP4, ICP22 (US1), le produit du gène US1.5, ICP27 et ICP47. ICP0, qui peut être incorporée dans le tégument, est une protéine non essentielle à la réplication virale, bien qu’un virus délété de ce gène ne se réplique que très faiblement. Par contre, la délétion de ICP0 dans le virus mutant ? VP16 décrit précédemment (VP16 délétée de sa partie transactivatrice) est létal. Ceci suggère que la réduction de la transactivation liée à la délétion de la partie C-terminale de VP16 est en partie suppléée par la protéine ICP0 (Mossman et Smiley, 1999). ICP0 augmente le niveau de transcription des gènes viraux et joue un rôle dans la mise en place d’un environnement favorisant la réplication virale (Jordan et Schaffer, 1997) (cf infra). La protéine ICP4 est une protéine essentielle à la réplication virale en tant que transactivateur des gènes β et γ (DeLuca et al., 1985 , Godowski et Knipe, 1986 , Preston, 1979). ICP4 augmente le taux de transcription des gènes viraux au cours d’une infection virale. Sa liaison avec la TBP, TFIIB et TAF250 favorise la formation des complexes d’initiation de la transcription (Grondin et DeLuca, 2000 , Smith et al., 1993). ICP4 va également réprimer la synthèse des gènes α et notamment sa propre synthèse en se fixant sur des séquences consensus présentes sur les gènes α (Leopardi et al., 1995) ?Fig. 8).
Figure 8 : Représentation schématique de la région 5’ non-transcrite du gène codant pour ICP4. La transcription est initiée au nucléotide -1. Les régions grisées représentent les sites de fixation des protéines SP1, des protéines ICP4 et VP16 (α-TIF) et des protéines se liant aux boîtes TATA. La présence de régions riches en nucléotide G et C favorise la formation de structures
secondaires permettant une expression régulée de ICP4. Le symbole * est présent tous les dix nucléotides (Mackem et Roizman, 1982).
fig8
ICP27 est également essentielle à la réplication de HSV-1 (Sacks et al., 1985). Elle possède une fonction de régulation des gènes au niveau post-transcriptionnel, en influençant la maturation des ARNm et leur export du noyau (Sandri-Goldin, 1998). ICP27 présente une séquence RGG de liaison à l’ARN (Mears et Rice, 1996) et exerce une inhibition des synthèses cellulaires par blocage de l’épissage des ARNm (McGregor et al., 1996) (cf infra).
Ces protéines vont activer la synthèse des protéines β impliquées dans la réplication de l’ADN, puis les protéines α et β ainsi que la synthèse de l’ADN viral vont réguler l’expression des gènes γ qui codent majoritairement pour les protéines structurales du virion (Holland et al., 1980, Roizman et Sears, 1996 ).
1.2.4 Contrôle de la traduction et déviation du métabolisme cellulaire en faveur de
la synthèse virale.
Les herpèsvirus exercent un contrôle de la traduction au cours du cycle cellulaire qui joue un rôle important pour la réplication, la latence et l’expression de la virulence.
Le contrôle de la traduction permet au virus de réprimer l’expression des gènes cellulaires, de controler l’expression des gènes viraux, de maintenir ou de sortir de la latence, et de contourner la réponse antivirale de l’hôte (Gale et al., 2000).
1.2.4.1 Lutte contre la réponse anti-virale de l’hôte
En réponse à des stimuli externes (infection virale), la cellule peut moduler la synthèse des protéines en modifiant entre autre la synthèse des facteurs de transcription. La phosphorylation de eIF2α (facteur d’initiation de la traduction eucaryote) est un des contrôles les mieux connus. La présence de double brin d’ARN dans la cellule infectée active la protéine kinase R (PKR) qui phosphoryle eIF2α bloquant ainsi la synthèse protéique cellulaire. La phosphorylation de eIF2α qui empêche l’échange de eIF2-GDP en eIF2-GTP nécessaire à la formation du complexe ternaire (eIF2-GTP-Met-tRNA) peut mener à la mort cellulaire limitant ainsi la propagation de l’infection virale. Le virus HSV-1, comme beaucoup de virus, a évolué pour empêcher cette phosphorylation de eIF2α en bloquant la fonction PKR. Le produit du gène γ34,5 du virus
HSV-1 se lie à la phosphatase PPHSV-1α (holoenzyme protéine phosphatase 1) et ce complexe en déphosphorylant la sous-unité α de eIF2, la maintiendrait ainsi active (Chou et al., 1995 , He et al., 1997, Poon et Roizman, 1997). Un virus délété du gène γ34,5 montre un défaut de croissance et une augmentation de la phosphorylation de PKR et de eIF2α, ainsi qu’une synthèse protéique diminuée (Chou et al., 1995).
Un virus délété du gène γ34,5 qui présente une seconde mutation lui permettant de se répliquer a pu être isolé (Mohr et Gluzman, 1996). Ce virus compense la perte du gène γ34,5 en surexprimant la protéine US11 codée par le gène US11 (Cassady et al., 1998). US11 est une protéine de tégument qui se localise dans le nucléole des noyaux infectés. L’expression de US11 empêche l’inhibition de la synthèse protéique cellulaire et inhibe l’activation de la PKR (Poppers et al., 2000). Un domaine riche en proline, présent sur la séquence primaire de US11, fixe l’ARN et est également responsable de l’inhibition de l’activation de PKR (Roller et al., 1996).
1.2.4.2 Inhibition de la synthèse protéique.
Une des premières évidences de l’inhibition des synthèses des protéines cellulaires vient de l’analyse des protéines totales des cellules infectées par HSV-1 ou HSV-2 où la synthèse des protéines de l’hôte et le niveau des ARNm cellulaires diminue d’environ 90% dans les 3 heures suivant l’infection. Cette inhibition de la synthèse protéique cellulaire permettrait aux protéines virales d’être présente en quantité supérieure aux protéines cellulaires dans les stades suivant la pénétration virale (Fenwick et Walker, 1978).
L’inhibition de la synthèse protéique peut-être séparée en deux étapes : la première inhibition apparaît très rapidement après l’infection de la cellule par HSV-1, en l’absence de nouvelle synthèse protéique virale, alors que la seconde se met en place plus tard au cours de l’infection et nécessite l’expression des gènes viraux (Gale et al., 2000).
1.2.4.2.1 La protéine VHS.
Dès l’entrée du virion dans la cellule, au moins une protéine, la protéine de tégument VHS (virion host shut-off) libérée de la structure tégumentaire, est nécessaire pour la déstabilisation des ARNm (Kwong et al., 1988).
VHS, codée par le gène UL41, est une endoRNase similaire aux nucléases de la famille fen-1 (Everly et Read, 1997) et possède une homologie limitée à un petit segment de la protéine de liaison au polyA (PABP) (Read et al., 1993). Cette protéine inhibe la synthèse de protéines
cellulaires, entraîne la désorganisation des polysomes existants et la dégradation des ARNm (Fig. 6). Cette dégradation d’ARNm cellulaire permet aux premiers ARNm viraux d’être plus facilement traduits en augmentant la disponibilité de l’appareil de traduction cellulaire. De plus, VHS dégrade plus rapidement les ARN polyadénylés favorisant ainsi la traduction des premiers ARNm viraux qui sont majoritairement non polyadénylés. Un virus délété du gène UL41 montre une réduction de titre en culture cellulaire d’un facteur 10 par rapport au virus sauvage (Read et Frenkel, 1983).
Cependant, la protéine VHS néosynthétisée au cours de la réplication virale dégrade aussi bien les ARNm cellulaires et viraux. Son activité serait régulée par son association avec la protéine VP16 néosynthétisée aux stades tardifs de la réplication virale (Lam et al., 1996). Les aa 238 à 344 de VHS et la partie N-terminale de VP16 (aa 1 à 369) sont nécessaires à cette liaison (Smibert et al., 1994). L’interaction VP16-VHS paraît conditionner l’intégration de VHS dans le tégument (une protéine VHS délétée des aa 149 à 344 n’est plus incorporée dans le tégument (Smibert et al., 1994).
Deux autres protéines virales sont impliquées dans l’inhibition de la synthèse protéique induite par HSV-1 : UL13 qui est une protéine de tégument ayant une activité kinase et ICP22 (US1) pourraient jouer un rôle dans cette inhibition en régulant les protéines VHS et VP16 (Ng et al., 1997, Overton et al., 1994).
1.2.4.2.2 la protéine ICP27
Au stade de la synthèse des protéines virales, ICP27 joue un rôle dans l’inhibition tardive des synthèses protéiques de l’hôte (Hardwicke et Sandri-Goldin, 1994). ICP27 possède la propriété de stimuler et de réprimer spécifiquement différents gènes cibles. ICP27 s’associe avec la machinerie d’épissage, provoquant une réduction de transcrits épissés cellulaires et une accumulation de pré-ARNm dans le noyau au cours de l’infection (Hardy et Sandri-Goldin, 1994). ICP27 induit également une redistribution des « small nuclear RNPs » et d’autres facteurs impliqués dans l’épissage (Sandri-Goldin et al., 1995). Les transcrits cellulaires non épissés restent dans le noyau puis sont dégradés, ce qui aboutit à une baisse des transcrits cellulaires exportés dans le cytoplasme et donc une synthèse sélective de protéines spécifiquement virales, la plupart des transcrits viraux n’étant pas épissés (Gale et al., 2000).
1.2.4.3 Le contrôle de la traduction
Le contrôle de la traduction peut également s’effectuer sur des protéines en cours de synthèse. Deux gènes peuvent ainsi réguler l’efficacité de traduction des ARNm. La protéine de tégument UL13 phosphoryle EF-1δ, facteur nécessaire à l’élongation de la chaîne peptidique pendant la traduction (Kawaguchi et al., 1998). EF-1δ, intégré dans le complexe EF-1αβδ, est responsable de la regénération du GTP sur EF-1α??? ’hydrolyse du?GTP en GDP étant impliquée dans le transport des aa-tRNA aux ribosomes. Cette phosphorylation différentielle de EF-1δ par UL13 permettrait d’augmenter l’efficacité de traduction des ARNm. La protéine ICP0 interagit également avec EF-1δ, cependant le rôle de cette interaction sur la fonctionnalité de EF-1δ n’a pas été élucidé (Kawaguchi et al., 1997). La protéine ICP0, qui présente un domaine en doigt de zinc, est une protéine multifonctionnelle qui intéragit avec un grand nombre de protéines cellulaires dont la cycline D3 qui est un régulateur du cycle cellulaire (Kawaguchi et al., 1997), et la protéine HAUSP, une protéase spécifique de l’ubiquitine (Everett et al., 1997). La protéine ICP0 interagit également les histones déacétylases. Cette interaction empêcherait ainsi la répression de la synthèse virale par l’inhibition de ces enzymes (Lomonte et al., 2001). Ces interactions peuvent moduler plusieurs fonctions clés dans la cellule comme la transcription, la traduction, la régulation du cycle cellulaire, la dégradation de protéines par le protéasome et confèrent au virus un avantage pour sa réplication.
1.2.5 Réplication de l’ADN, formation des capsides et encapsidation de l’ADN
viral.
1.2.5.1 Réplication virale.
La synthèse de l’ADN viral a lieu dans le noyau sur une période s’étendant de 3 à 12 h p.i. (Roizman et Sears, 1996).
HSV1 possède trois origines de réplication situées entre les promoteurs des gènes ICP4 et ICP22 et ICP4 et ICP47 pour l’OriS1 et l’OriS2 et une troisième OriL3 située dans le milieu de la région UL entre les promoteurs de la protéine de liaison à l’ADN ICP8 (UL29) et l’ADN polymérase (UL30) (Stow et McMonagle, 1983, Weller et al., 1985). Les oriL et oriS peuvent être délétés indépendamment sans effets sur le rendement viral et l’accumulation d’ADN dans les cellules infectées (Igarashi et al., 1993).
Les protéines impliquées dans le métabolisme de l’ADN peuvent être divisées en 2 catégories. Les protéines intervenant dans la synthèse de l’ADN viral et celles impliquées dans le métabolisme des acides nucléiques (Roizman et Sears, 1996).
Sept protéines participent à la synthèse de l’ADN viral. Trois d’entre elles, codées par les gènes UL5, UL8 et UL52, sont présentes dans un complexe équimolaire qui fonctionne comme une primase/hélicase. La protéine ICP8 (UL29) se fixe spécifiquement avec l’ADN polymérase (UL30) sur les complexes de réplication et interagit spécifiquement sur la protéine codée par le gène UL9 qui reconnait trois séquences nucléotidiques près des origines de réplication. La protéine codée par le gène UL42 qui confère la maturation de l’ADN polymérase se lie également sur la protéine UL9 et l’ensemble de ces interactions permettraient l’initiation de la réplication de l’ADN (Marsden et al., 1996, Roizman et Sears, 1996 ).
La seconde catégorie de protéines est impliquée dans le métabolisme des acides nucléiques et comprend une DNAse alcaline, une thymidine kinase, une ribonucléotide reductase, une uracile DNA glycosylase et une déoxyuridine triphosphate nucleotidohydrolase (dUTPase) (Roizman et Sears, 1996).
1.2.5.2 L’assemblage de la capside et l’empaquetage de l’ADN viral.
L’assemblage de la capside s’effectue dans le noyau des cellules infectées. Les protéines VP5, VP19C, VP23 et les protéines d’échafaudage sont essentielles pour l’assemblage d’une capside intacte (Thomsen et al., 1994). L’adressage aux noyaux des protéines de capside, n’ayant pas de signaux de localisation nucléaire, s’effectue par leur association avec d’autres protéines de capside. Les protéines de capside VP5 et VP23 s’associent respectivement avec la protéine d’échafaudage VP22a et VP19C possédant des signaux de localisation nucléaire (Nicholson et al., 1994, Rixon et al., 1996, Spencer et al., 1998). Dans le noyau, ces complexes s’associent à leur tour avec les protéines VP21, VP22a et VP24 pour donner naissance à une capside de type B (Spencer et al., 1998). La protéine VP24 clive ensuite les 25 aa C-terminaux de VP22a ce qui permet la dissociation des protéines VP5 et VP22a aboutissant à la sortie des protéines d’échafaudage et à l’encapsidation simultanée de l’ADN viral dans la capside (type C) (Thomsen et al., 1995).
Les produits des gènes UL6, UL15, UL17, UL28, UL32, UL33 jouent un rôle essentiel dans les processus de clivage et d’empaquetage de l’ADN (Sheaffer et al., 2001). La protéine UL17 est une protéine de tégument indispensable à la multiplication virale (Salmon et al., 1998). Le virus
délété du gène UL17 peut produire des capsides de type A et B mais pas de type C et l’ADN viral reste sous forme concatémèrique. Ceci suggère que la protéine UL17 est nécessaire au clivage et à l’empaquetage de l’ADN (Salmon et al., 1998). Des études plus récentes montrent que UL17 serait impliquée dans la localisation correcte des capsides de type B vers le compartiment de réplication de l’ADN viral, où se réalise le clivage et l’empaquetage de l’ADN (Fig. 6) (Taus et al., 1998).
La protéine UL25 est également essentielle à l’empaquetage de l’ADN en jouant un rôle de rétention de ce dernier à l’intérieur de la capside (McNab et al., 1998). C’est une protéine qui est associée aux capsides de type A et B en petite quantité mais qui est présente en grande quantité sur les capsides de type C. C’est une protéine qui lie l’ADN viral et qui semble jouer un rôle plus tardif dans l’encapsidation en « accrochant » l’ADN viral dans la capside (Sheaffer et al., 2001).
1.2.6 Sortie de la particule virale nouvellement synthétisée
1.2.6.1 Rôle du tégument.
La capside contenant l’ADN viral se fixe sur la membrane nucléaire interne et subit un premier enveloppement au niveau de la membrane nucléaire interne se retrouvant ainsi enveloppée dans l’espace périnucléaire (Fig. 6 (8)) (Baines et Roizman, 1992 , Granzow et al., 1997 , Whittaker et Helenius, 1998). Il est très rare de voir des capsides vides subir ce phénomène, ce qui suggère que la capside renfermant l’ADN possède une structure différente des capsides de type A et B. Le changement structural permettrait à la capside de se lier aux protéines de tégument présentes sur la face interne de la membrane nucléaire (Baines et al., 1995 , Granzow et al., 2001, Whittaker et Helenius, 1998 ). A ce niveau, des divergences existent quant aux mécanismes de sortie du virus (Whittaker et Helenius, 1998). Selon le premier modèle évoqué, le virus nouvellement enveloppé emprunterait, à l’intérieur des vésicules de transport, la voie classique de sécrétion du réticulum endoplasmique vers le réseau transgolgien via le complexe de Golgi et atteindrait finalement la membrane plasmique où les particules virales infectieuses sont libérées par exocytose (Fig. 6 (9’)) (Campadelli-Fiume et al., 1991 , Di Lazzaro et al., 1995). Un autre modèle, décrit plus récemment, fait état de l’enveloppement-déenveloppement et réenveloppement de la particule virale (Fig. 6 (9)). Après son premier enveloppement au niveau de la membrane nucléaire interne, le virion subit un déenveloppement résultant de la fusion avec la membrane nucléaire externe, et se retrouve sous la forme de capside nue dans le cytoplasme. Cette capside subit un second enveloppement dans la région transgolgienne, en se fixant sur un ensemble de protéines tégumentaires qui apparaît, en microscopie électronique, plus dense que
celui impliqué dans le premier enveloppement. Le virus enveloppé présent dans une vésicule est libéré de la cellule par exocytose.
Les études récentes en microscopie électronique suggèrent fortement le second modèle :
Ces études montrent clairement les 3 étapes décrites (Granzow et al., 2001 , Granzow et al., 1997). Le tégument qui paraît peu abondant quand la particule virale est périnucléaire, acquiert sa taille maximale dans les vacuoles cytoplasmiques, ce qui suggère que le changement morphologique entre le virion intranucléaire et cytoplasmique reflète un changement de composition protéique du tégument.
Le second modèle est également mis en évidence dans des cellules infectées par des virus codant pour des glycoprotéines gH et gD modifiées possédant un signal de rétention dans le réticulum endoplasmique (RE) (Browne et al., 2001, Skepper et al., 2001 ). Les deux glycoprotéines sont exprimées, mais sont retenues au niveau de la membrane nucléaire et dans le RE. Les virus extracellulaires produits sont dépourvus des glycoprotéines gH et gD respectivement, ce qui suggère que les virus perdent leur enveloppe au niveau du passage nucléo-cytoplasmique puis acquièrent une nouvelle enveloppe dans des compartiments cytoplasmiques post-RE (Browne et al., 2001, Skepper et al., 2001 ).
Le fractionnement des organelles de cellules infectées par HSV-1, permet de détecter des particules virales dans les endosomes et le réseau transgolgien (TGN), mais pas dans les citernes golgiennes (Harley et al., 2001).
A l’heure actuelle, le rôle de quatre protéines de tégument dans la sortie du virus a été décrit: UL11, UL37, VP1/2, et VP16 (Fig. 6).
La protéine UL11 est impliquée au niveau du premier et du second enveloppement. Une accumulation de capsides renfermant de l’ADN dans le noyau près des membranes nucléaires est détectée dans les cellules infectées par un virus délété du gène UL11 (Baines et Roizman, 1992). Pour ce même virus, une augmentation de virions non-enveloppés dans le cytoplasme et une baisse de production de virus extracellulaire, suggèrent un rôle de cette protéine dans l’enveloppement des virions à la fois dans le noyau et le cytoplasme (Baines et Roizman, 1992). La protéine UL11 est une protéine myristylée et cette modification post-traductionnelle permettrait l’ancrage de cette protéine sur les membranes cellulaires. La protéine UL11 ancrée servirait à son tour de point d’ancrage pour les autres protéines de tégument sur les membranes
(Baines et al., 1995, MacLean et al., 1989 ). La capside se fixerait ensuite sur ce coussin tégumentaire. L’accumulation sur le pourtour du noyau des protéines UL34 et UL31 suggère que les deux protéines sont impliquées dans le 1er enveloppement (Reynolds et al., 2001, Roller et al., 2000 ). La localisation d’une de ces deux protéines est dépendante de l’expression de l’autre ainsi que de la protéine kinase Us3 (Reynolds et al., 2001). Les virus délétés des gènes UL31 et UL34 du PrV forment de petites plages par comparaison au virus parental. Des études en microscopie électronique montrent une réduction du nombre de particules cytoplasmiques et extracellulaires. Ces deux protéines possèderaient les mêmes fonctions durant la phase de premier enveloppement au niveau de la membrane nucléaire (Fuchs et al., 2001, Klupp et al., 2000 ). Le virus HSV-1 délété du gène UL37 ne forme pas de particule virale extracellulaire (Desai et al., 2001). Une augmentation de capside dans le noyau des cellules infectées, suggère un rôle de la protéine UL37 dans l’enveloppement nucléaire. (Desai et al., 2001) Certaines capsides non-enveloppées sont cependant détectées dans le cytoplasme de ces cellules, et un rôle dans le second enveloppement de la protéine UL37 déjà présente sur la capside est soupçonné (Desai et al., 2001).
Le passage des virus de l’espace périnucléaire vers la partie cytoplasmique nécessiterait la protéine codée par le gène UL20 du virus HSV-1. En effet, dans les cellules infectées par un virus délété du gène UL20, une accumulation de virions dans l’espace périnucléaire est observée (Baines et al., 1991).
Le second enveloppement requiert des protéines supplémentaires par rapport au premier enveloppement. Une délétion du gène UL36 codant pour la protéine VP1/2 est létale pour la multiplication virale. Des capsides virales nues s’accumulent dans le cytoplasme des cellules infectées suggérant que la protéine VP1/2 est requise pour l’enveloppement secondaire (Desai, 2000). De même, dans le cas du PrV, une accumulation de capsides est visualisée dans le cytoplasme des cellules infectées par un virus délété du gène UL37, ce qui suggère que la protéine codée par ce gène est nécessaire au second enveloppement et semblerait recruter les autres protéines de tégument impliquées dans le second enveloppement (Klupp et al., 2001). Les protéines UL37 des virus PrV et HSV-1 possèdent donc un rôle commun permettant le second enveloppement des virions (Desai et al., 2001).
Enfin, le virus délété du gène UL48 ne produit pas de virus enveloppés extracellulaires (Weinheimer et al., 1992), ce qui suggérait un rôle essentiel de VP16 dans la sortie du virion. Cependant, la diminution de la synthèse protéique virale et du taux d’encapsidation de l’ADN
viral (associé à la dérégulation de VHS) rendait ce résultat difficilement interprétable. Un virus délété des gènes UL48 et UL41, chez qui la synthèse protéique virale et le taux d’encapsidation de l’ADN sont en partie rétablis, ne produit toujours pas de virus extracellulaires (Mossman et al., 2000). En microscopie électronique, une accumulation de capsides non-enveloppées contenant de l’ADN viral est visualisée dans le cytoplasme des cellules infectées ce qui indique que la protéine VP16 est essentielle à la maturation virale après le passage nucléaire, sans doute au stade du second enveloppement (Mossman et al., 2000).
Une seconde expérience met en évidence les deux fonctions de VP16. Un virus infectieux dérivé du virus délété du gène UL48 a pu être obtenu à la suite d’une longue incubation. Ce virus montre cependant une différence fondamentale par rapport au virus sauvage : sa réplication entraîne la formation de syncytiums géants et les cellules ne libèrent aucune particule virale extracellulaire (Mossman et al., 2000). L’analyse génomique de ce virus met en évidence des mutations dans le gène UL41 et dans la protéine gK qui est impliquée dans la fusion des membranes cellulaires (Mossman et al., 2000).
La protéine VP22 semble être également impliquée dans la sortie du virus et plus particulièrement dans la diffusion de cellule à cellule du virus HSV-1. Un virus exprimant une protéine VP22 tronquée en position C-terminale, et plus récemment, un virus UL49- délété du cadre de lecture entier ont été construit (Elliott et Whiteley, 2001 , Pomeranz et Blaho, 2000). Ces virus, qui produisent des particules virales extracellulaires, forment de petites plages par comparaison au virus sauvage, ce qui suggère un rôle de VP22 dans la diffusion de cellule à cellule du virus HSV-1 (Elliott et Whiteley, 2001, Pomeranz et Blaho, 2000). D’ailleurs, la protéine VP22 d’HSV-1 induit la re-localisation de VP16 pour former le corps tégumentaire, ce qui suggère un rôle majeur de ces deux protéines dans l’édification du tégument (Elliott et al., 1995). Ces résultats sont à rapprocher de ceux obtenus avec un virus BHV-1 délété du gène UL49 (VP22) qui montre également un défaut de croissance en culture cellulaire (Liang et al., 1995). La protéine VP22 d’HSV-1 se localise dans le cytoplasme des cellules infectées dans les stades précoces de l’infection virale, puis s’accumule dans le noyau dans les stades tardifs de l’infection (Elliott et O'Hare, 1999 , Elliott et O'Hare, 2000, Pomeranz et Blaho, 1999 ). Les modifications post-traductionelles de la protéine VP22, ADP-ribosylation, phosphorylation par la protéine virale UL13 ou par les protéines kinases cellulaires, peuvent expliquer en partie ces différentes localisations au cours du cycle viral (Blaho et al., 1994 , Pomeranz et Blaho, 1999). La protéine VP22 du BHV-1 peut-être également phosphorylée et montre une localisation majoritairement nucléaire (Harms et al., 2000). Les deux protéines VP22 peuvent s’associer au
cours de l’infection virale à la chromatine cellulaire et virale. La protéine VP22 du BHV-1 interagit avec les histones, et la déacétylation de l’histone H4, associée à la répression de la transcription des gènes, est observée dans les cellules infectées (Ren et al., 2001a). Le cytosquelette cellulaire est également modifié par les protéines VP22 d’HSV1 et de BHV1 qui réorganisent le réseau de microtubules lors d’une infection virale (Elliott et O'Hare, 1998, Harms et al., 2000 ). De plus, ces deux protéines possèdent la propriété de transport intercellulaire, utilisant des mécanismes d’exportation et d’importation similaires à la famille des pénétratines (Tat, l’homéodomaine d’Antennapedia) (Elliott et O'Hare, 1997, Harms et al., 2000, Prochiantz, 2000). D’ailleurs, l’utilisation de la protéine VP22 d’HSV-1, comme vecteur pour l’importation de molécules biologiques dans les cellules ou à des fins vaccinales, est largement étudiée (Cheng et al., 2001 , Hung et al., 2001 , Normand et al., 2001 , Wills et al., 2001).
De même que la phosphorylation des protéines de tégument induit leur dissociation du virion dès l’entrée dans la cellule, on peut imaginer que leur assemblage dans le nouveau virion requiert l’incorporation de protéines non phosphorylées qui peuvent être soit des protéines déphosphorylées soit des protéines néosynthétisées non phosphorylées (Spengler et al., 2001). Ainsi, la protéine VP22 n’est pas phosphorylée dans les virions (Elliott et al., 1999). Par contre, l’assemblage dans le virion de la protéine VP22 du BHV-1 est conditionné par sa phosphorylation sur un résidu tyrosine (Ren et al., 2001b).
La quantité totale des protéines de tégument incorporées dans le virion semble constante, mais la quantité relative de chaque protéine peut-être variable et en relation avec leur quantité relative dans la cellule infectée. La quantité de la protéine VP22 incorporée dans le virion augmente lors d’une infection par un virus possédant deux copies du gène UL49. Dans ces mêmes virions, la protéine VP13/14 est au contraire détectée en quantité moindre (Leslie et al., 1996). Une augmentation de l’incorporation de la protéine VP13/14 dans les virions est observée dans les virions issus de cellules infectées par un virus délété du gène UL46 (VP11/12) (Zhang et McKnight, 1993). De même, la quantité de protéines VP16 est augmentée dans les virions issus de cellules infectées par un virus délété des gènes UL46 et UL47 (Zhang et McKnight, 1993). Par opposition, l’incorporation de la protéine de tégument UL37 dans le virion est strictement contrôlée (McLauchlan, 1997).
Les protéines de tégument jouent donc un rôle important dans la sortie du virion à différentes étapes de la morphogénèse virale. Cette structure qui est présente avant le premier enveloppement, devient plus dense au cours du second enveloppement, ce qui suggère que
l’édification du tégument pourrait se réaliser en deux étapes : une étape nucléaire où les protéines de tégument à localisation nucléaire sont incorporées au cours du premier enveloppement en interagissant principalement avec les capsides de type C, et une seconde étape cytoplasmique où les protéines de tégument cytoplasmiques seraient incorporées en assurant l’interaction entre cet édifice capside « semi-tégumentée » et les glycoprotéines virales. D’autres protéines de tégument localisées dans les deux compartiments au cours du cycle viral, peuvent également jouer un rôle à ces deux niveaux.
1.2.6.2 Rôle des glycoprotéines
De même que les glycoprotéines gB, gD, gH et gL jouent un rôle dans l’entrée des virus extracellulaires, ces glycoprotéines sont impliquées dans la diffusion du virus de cellule à cellule (Cai et al., 1988 , Forrester et al., 1992 , Huang et Campadelli-Fiume, 1996 , Navarro et al., 1992 , Roop et al., 1993). Ainsi, la formation des plages de lyse est inhibée en présence d’AcMo dirigés contre les glycoprotéines gB, gD et gH (Minson et al., 1986, Navarro et al., 1992 ).
Les glycoprotéines gE et gI permettent également une diffusion efficace du virus de cellule à cellule (Fig. 6). En effet, les virus gE- et gI- forment des plages de petites tailles comparées à leur virus parental (Balan et al., 1994). Ces deux glycoprotéines ne sont pas impliquées par contre dans l’entrée du virus extracellulaire (Dingwell et al., 1994, Dingwell et Johnson, 1998), ce qui suggère que l’entrée du virus et la diffusion du virus de cellule à cellule qui possèdent des mécanismes (fusion) et des protéines (gB, gD, gH et gL) similaires, diffèrent dans certains aspects moléculaires.
En ce qui concerne la sortie des virions par exocytose, les virus gB-, gH-, gL-, gD-, gE- ou gI- forment des virus extracellulaires, indiquant que la voie de sortie des virus extracellulaires n’est pas affectée par la délétion de ces 6 gènes (Balan et al., 1994, Cai et al., 1988 , Forrester et al., 1992 , Ligas et Johnson, 1988 , Roop et al., 1993 ).
La glycoprotéine gK (UL53) qui n’est pas présente dans l’enveloppe virale est impliquée dans la sortie du virion au niveau du premier et du second enveloppement. La formation de particules extracellulaires est limitée dans les cellules infectées par un virus gK- (Foster et Kousoulas, 1999, Hutchinson et al., 1992b, Hutchinson et Johnson, 1995 ).
1.3 LE VIRUS DE LA MALADIE DE MAREK (MDV)
La Maladie de Marek est une affection lymphoproliférative du poulet dont l’agent causal est un virus de la famille des herpesviridae (Churchill et Biggs, 1967). Cette affection reste à l’origine de véritable perte économique dans l’aviculture. Le virus a été isolé dans des cultures cellulaires co-cultivées en présence de cellules tumorales (Churchill et Biggs, 1967) ou de lymphocytes purifiés à partir de sang d’animaux malades (Nazerian, 1979).
Le MDV, qui appartient au genre Gallidherpesviridae, est classé dans les alphaherpesvirinae en raison de sa structure génomique et des homologies de séquences avec les autres
alphaherpesvinae (Buckmaster et al., 1988). Après une courte présentation de la maladie
(pathogénie et transmission), du virus (souches, cycle viral et structure) et de la vaccination, nous décrirons plus en détail l’analyse génomique du MDV.
1.3.1 Pathogénie virale et transmission du virus.
La maladie se caractérise par une infiltration de cellules lymphocytaires T transformées au niveau des nerfs périphériques et/ou de différents organes ou tissus (gonades, foie, rate, poumon, coeur, rein, muscle). La présence d’infiltrations diffuses au niveau des nerfs périphériques entraîne la paralysie de l’animal: c’est la forme clinique classique. L’apparition de tumeurs viscérales constitue également une forme clinique fréquemment observée. Les virus hypervirulents, d’émergence récente, peuvent manifester leur pouvoir pathogène sur des animaux vaccinés entrainant une mortalité importante chez des animaux nouveaux-nés. Cette mortalité est liée à l’induction d’une immunodépression profonde résultant de la destruction des lymphocytes B et T infectés par les virus. Le virus peut également causer une athérosclérose chez des poulets normocholestérolémiques (Fabricant et al., 1978).
Trois types de réplication virale peuvent être identifiés in vivo: la multiplication productive, l’infection latente, et la transformation.
Les poumons sembleraient être le site de l’infection primaire dans laquelle les cellules phagocytaires (macrophages ou cellules dendritiques ?) sont présumées phagocyter le virus et l’emmener dans les organes lymphoïdes (bourse de Fabricius, thymus, rate) (Schat et Xing, 2000).
La primo-infection affecte d’abord les lymphocytes B et se caractérise par une forte multiplication virale. La destruction des lymphocytes B conduit à un début d’atrophie de la
bourse de Fabricius et de la rate. Les lymphocytes T sont ensuite infectés ce qui entraîne une immunodépression profonde. L’activation des lymphocytes T paraît nécessaire à leur infection par le MDV. L’infection latente a lieu dans les lymphocytes T dans lesquels aucun antigène n’est détecté. Ces lymphocytes peuvent subir une transformation néoplasique aboutissant à l’apparition de lymphomes T.
La transmission du virus est horizontale et le virus infectieux est libéré à partir des cellules épithéliales des follicules plumeux où la réplication virale est complète (production de virus extracellulaire) (Calnek et al., 1970). Les débris de phanères ou les poussières présents continuellement dans les élevages servent de support au virus et constituent les sources principales de contamination. La résistance ou l’infectiosité du virus est estimée à plusieurs mois à 20-25 °C (Carrozza et al., 1973).
1.3.2 Cycle lytique, réplication semi-productive, latence et réactivation.
Dans le cas du MDV, trois types de réplication peuvent être distinguées : un cycle lytique complet au niveau des follicules plumeux où la production de particules virales extracellulaires est observée (cf supra), une réplication semi-permissive en culture primaire où le virus reste très associé aux cellules (pas de production de particule extracellulaire), et un état de latence dans des fibroblastes déjà transformés et dans les lymphomes T issus de poulet infectés.
Au niveau des follicules plumeux, la réplication du MDV semble complète et aboutit à la formation de particules virales extracellulaires infectieuses.
In vitro, le virus peut se répliquer dans un nombre limité de cellules qui sont essentiellement des
cultures primaires (cellules de rein de poulet (CKC), fibroblastes embryonnaires de poulets (CEF) et de canard (DEF) et des cellules embryonnaires de peau de poulets (CESC) (Jaikumar et al., 2001), et moins efficacement dans certaines lignées cellulaires (CHCCOU2, QM7, Vero) (Abujoub et Coussens, 1995 , Jaikumar et al., 2001, Schumacher et al., 2000 ). Le virus se multiplie en formant des plages de lyse, mais reste très associé aux cellules et ne forme pas de particules extracellulaires. Les souches du sérotype 1 perdent leur pouvoir oncogène après passage en culture (Churchill et al., 1969) et les virus atténués résultants se répliquent en général à des titres plus élevés et forment des plus grandes plages que les virus parentaux.
Le MDV qui infecte de façon chronique la lignée CHCCOU2 (fibroblastes transformés chimiquement), est en état de latence lorsque ces cellules sont sous-confluentes, mais induit une
infection lytique lorsque ces cellules sont confluentes (Abujoub et Coussens, 1995, Abujoub et Coussens, 1997). Les cellules QT35, lignée cellulaire de fibroblastes de caille, obtenues par cancérogénèse chimique (Moscovici et al., 1977) possèdent à l’état latent des séquences spécifiques du MDV1. Le virus peut être réactivé soit in vivo soit dans ces cellules par la surinfection avec HVT ou un autre MDV (Yamaguchi et al., 2000).
Des lignées lymphoblastoïdes provenant de cellules tumorales d’animaux infectés ont été également obtenues (Powell et al., 1974). Le MDV qui est à l’état de latence dans ces cellules peut également entrer en réactivation.
1.3.3 Structure du MDV.
En microscopie électronique, le MDV se présente avec une capside typique des herpèsvirus de 100 nm de diamètre. Des virus enveloppés de 150 à 160 nm de diamètre sont détectés dans les cellules en culture, alors qu’au niveau des follicules plumeux, la taille des particules détectées est de 273 à 400 nm (Fig. 9) (Calnek et al., 1970).
fig9a
Figure 9 : Etude microscopique de particules virales produites au niveau des follicules plumeux (a) ou en culture cellulaire (b). [Payne, 1985 #284]
fig9b
1.3.4 Souches virales.
Les souches du MDV sont réparties en trois sérotypes différents (tableau 1):
Le sérotype 1 comprend les souches virulentes classiques et les souches hypervirulentes, très oncogènes et très pathogènes contre lesquelles la vaccination est peu efficace.
Le sérotype 2 comporte les virus qui sont naturellement apathogènes et qui peuvent être utilisés comme souches vaccinales (SB-1 strain) (Schat et Calnek, 1978).
Le sérotype 3 (Kawamura et al., 1969) comprend le virus herpès du dindon (HVT: herpesvirus of turkeys) qui n’est ni pathogène ni oncogène et qui est la souche vaccinale la plus utilisée.
Ces trois sérotypes différent par le profil de leur ADN après digestion par des enzymes de restriction (Hirai et al., 1979, Silva et Barnett, 1991) ainsi que par des tests immunologiques
Figure 9 : Etude microscopique de particules virales produites au niveau des follicules plumeux (a) ou en culture cellulaire (b). [Payne, 1985 #284].
a
utilisant des AcMo (Ikuta et al., 1982, Lee et al., 1983). La séquence de chaque sérotype a mis en évidence des différences nucléotidiques entre gènes et la présence de gènes uniques dans certains sérotypes (cf infra).
Tableau 1: classification par oncogénicité des différents herpèsvirus du poulet et de la dinde (Payne,1985).
Type de virus sérotype oncogénicité* souches virales représentatives MDV HVT 1 2 3 +++ ++ + +/- - - Md/5,Ala-8,RB1B,Md/11 GA,HPRS-16,JM HPRS-17,Conn-A Cu-2,CVI988 HPRS-24,SB-1,HN-1 FC 126, WTHV-1, HPRS-26
*+++ : très forte ; ++ : forte ; + : modérée ; +/ : faible ; : nononcogène.
1.3.5 La vaccination.
Le virus HVT qui est apathogène pour le poulet a été le vaccin le plus utilisé (von Bulow et al., 1975). Des souches virales MDV1 atténuées, dont la souche vaccinale Rispens (Rispens et al., 1972a, Rispens et al., 1972b) ont également induit une bonne résistance à l’infection et sont utilisées depuis 1990 aux USA. Ces vaccins induisent une réponse immune efficace contre l’apparition de tumeurs induites par le MDV-1, mais ne font que diminuer la multiplication virale des souches sauvages chez les poulets vaccinés, ce qui entraîne une persistance de virus virulents dans les élevages. Depuis quelques années, des virus de plus en plus virulents émergent et sont capables d’induire des tumeurs ou des syndromes d’immunodépression suraiguë chez les poulets vaccinés.
Des vaccins polyvalents, comprenant plusieurs sérotypes, sont de plus en plus répandus car les résultats obtenus notamment avec les sérotypes 2 et 3 sont supérieurs à ceux obtenus avec les vaccins monovalents (Witter et al., 1984). Cette vaccination à l’aide de 2 souches virales, permettrait d’augmenter le spectre de la réponse immune.
L’utilisation des virus de la variole aviaire recombinants exprimant des protéines virales (gB, gC, gD, VP16, VP13/14) a également été testé à des fins vaccinales (Nazerian et al., 1992, Nazerian
