VP22 POURRAIT ÊTRE NÉCESSAIRE À LA SORTIE DU VIRION CYTOPLASMIQUE

La protéine VP22 du virus HSV-1, qui est détectée majoritairement dans le cytoplasme des cellules infectées, est suspectée de jouer un rôle dans la sortie du virion après son déenveloppement nucléaire. Un rôle similaire de la protéine VP22 du MDV-1 a également été envisagé. En effet, la protéine majeure de capside VP5 qui est un antigène tardif (gène γ) est synthétisée dans les cellules infectées par le virus 20? 49, ce qui suggère que la protéine VP22 n’est pas nécessaire au premières étapes de la réplication virale. De plus, de manière similaire aux glycoprotéines gE et gI dont l’expression permanente en cellules QM7, facilite également la

multiplication virale, la protéine VP22 pourrait être impliquée à l’instar de ces protéines dans la diffusion du virus de cellule à cellule.

Une étude sur le rôle de VP22 dans la sortie du MDV1 a donc été initiée.

Le virus 20? 49 ne pouvant être multiplié sur une lignée complémentante, l'étude en microscopie électronique des cellules infectées par 20? 49 en CESC est difficilement réalisable. Une autre méthode d’approche, pour le moment préliminaire, basée sur la création de polycarions à l’aide de polyéthylène glycol, a donc été réalisée. L’hypothèse est la suivante : si VP22 est nécessaire à la sortie du virus au niveau cytoplasmique, les capsides cytoplasmiques présentes dans la cellule infectée et ici dans le polycarion seraient ainsi capables d’infecter les autres noyaux. Si VP22 est nécessaire à la sortie du virus au niveau nucléaire, un seul noyau au sein d’un polycarion devrait être fluorescent. Les cellules QM7 sont ainsi transfectées par le virus 20? 49 puis 24 h après sont mises en présence de polyéthylène glycol pendant 2 min. Les cellules sont ensuite incubées 72 h à 37°C puis fixées. La présence de l’antigène VP5 est détectée dans une moyenne de 4 à 5 noyaux fluorescents, suggérant ainsi que des capsides cytoplasmiques synthétisées par un des noyaux ont pu établir une autre infection dans les noyaux voisins (Fig. 40). Cependant, nous ne pouvons exclure la possibilité d’une relocalisation nucléaire de la protéine VP5 dans ces noyaux non infectés. La confirmation de cette expérience nécessite l’utilisation de sondes fluorescentes spécifiques des séquences nucléotidiques du MDV-1, afin de confirmer la présence d’ADN viral dans ses noyaux.

Figure 40 : Rôle de VP22 dans la sortie du virion. Les cellules QM7 sont transfectés par l'ADN du BAC 20∆49 puis fusionnées à l'aide de polyéthylène glycol pendant 1 mn. Quatre jours après transfection, les cellules sont fixées puis incubées en présence de l'AcMo anti-VP5 F19 marqué au vert oregon. Les cellules ont été examinées avec un objectif 20X en utilisant un microscope à fluorescence Nikon équipé d'une caméra digitale Nikon.

5 DISCUSSION

Notre travail a porté sur l’étude de l’expression et du caractère indispensable de quatre protéines du MDV-1 homologues aux protéines de tégument VP22, VP16, VP13/14 et VP11/12 du virus HSV-1. Ceci nous a permis de distinguer deux groupes de protéines : les protéines VP16, VP13/14 et VP11/12 synthétisées tardivement qui semblent peu abondantes et non essentielles à la multiplication virale et la protéine VP22 très abondamment synthétisée tout au long de l’infection et essentielle à la multiplication virale dans les CESC.

La protéine VP16 est détectée dans les CESC fortement infectées par le MDV et situées au dessus du tapis cellulaire, ce qui suggère que la protéine VP16 est exprimée tardivement au cours de l’infection virale. Cependant, comme la protéine VP16 est traduite à partir de messager codant également pour la protéine VP22, détectée dès quatre heures p.i., cette protéine peu abondante pourrait être exprimée dans les premières étapes de la réplication virale de façon non détectable. Cette protéine n’est détectée de façon reproductible que lorsque les CESC sont fixées à la paraformaldéhyde. Les solvants organiques peuvent avoir un effet plus « dissociant » que la paraformaldéhyde aboutissant au décollement de ces cellules fortement endommagées par l’infection virale. La fixation à l’alcool-acétone pourrait également provoquer la fuite de ces protéines hors des cellules infectées (Brewis et al., 2000). Une absence de détection de l’AcMo I13 vis-à-vis d’une protéine VP16 modifiée post-traductionnellement peut-être suspectée. La protéine VP16 exprimée dans les cellules d’insecte n’est pas phosphorylée dans ce système. Une phosphorylation de VP16 au cours de la réplication virale par une protéine kinase virale pourrait empêcher sa reconnaissance par l’AcMo I13 et pourrait ainsi expliquer l’absence de détection de la protéine VP16 dans les stades précoces de l’infection virale. Dans cette hypothèse, il nous faut envisager une phosphorylation plus spécifique d’une des kinases virales (US3 et UL13) sur un site spécifique de la protéine VP16. Dans les stades tardifs de l’infection virale où la protéine VP16 du MDV-1 est détectée par l’AcMo I13, l’absence de phosphorylation des protéines de tégument avant leur incorporation dans le virion pourrait expliquer cette meilleure détection (Morrison et al., 1998).

Cependant, nous avons pu montrer que le faible niveau de détection de la protéine VP16 dans les CESC était probablement dû à sa traduction à partir des messagers bi et tricistroniques ayant la capacité de coder pour la protéine VP16 mais également à une toxicité de la protéine pour les

cellules (Kopacek et al., 1997, Koptidesova et al., 1995 ). En effet, la synthèse de la protéine VP16 à partir du messager bicitronique a été confirmée (Koptidesova et al., 1995) et nous avons également démontré sa synthèse à partir du messager tricistronique dans le sytème d’expression

in vitro. L’étude de la traduction de la protéine VP16 dans les systèmes d’expression in vivo,

nous a permis de confirmer ce résultat, mais également de mettre en évidence à l’aide d’un gène marqueur un faible taux de réinitiation au sein des messagers polycistroniques. La détection de la luciférase exprimée à partir de ces messagers n’est possible qu’en mesurant son activité enzymatique mais ne peut être observée en immunofluorescence indirecte. Un défaut similaire dans l’immunodétection de VP16 au cours de l’infection virale peut-être envisagé. Ce faible taux de réinitiation ne permettrait pas une détection de VP16 dans des cellules en début d’infection, mais pourrait être augmenté aux stades tardifs de l’infection virale dans des cellules ne contrôlant plus ou ayant un contrôle modifié du fait de la régulation de la traduction des protéines virales. D’autres ARNm bicistroniques eucaryote, possédant une structure similaire au messager UL49-48, c’est-à-dire deux cadres ouverts de lecture non-chevauchants séparés par une séquence intergénique, permettent l’expression de deux protéines fonctionnelles (Bouhidel et al., 1994 , Wang et al., 1987). La présence du premier cadre ouvert de lecture régule souvent la traduction du second, ne permettant en général qu’une faible traduction de ce dernier (Kozak, 1989). Ce phénomène peut être expliqué par la traduction qui est initiée en 5’ de l’ARNm à partir du CAP et qui mène à la traduction du premier cadre ouvert de lecture. Cependant, après sa traduction, les ribosomes peuvent perdre les facteurs d’initiation de la traduction liés au ribosome 40S, et devenir incapable d’initier la traduction du second cadre ouvert de lecture. Dans le modèle de réinitiation de la traduction, la traduction du premier cadre ouvert de lecture, généralement court, permet aux ribosomes de garder des facteurs d’initiation, qui permettrait à certains ribosomes 40S de scanner la région intergénique et d’initier la traduction du second cadre ouvert de lecture (Kozak, 1989). Par exemple, l’efficacité de la réinitiation de la traduction de l’ARNm de l’HIV-1 est déterminée par la longueur du premier cadre ouvert de lecture et de la distance intergénique (Luukkonen et al., 1995).

Nous ne pouvons écarter l’hypothèse de la présence d’un messager monocistronique, en faible abondance et non détectable dans les stades tardifs de l’infection virale, qui permettrait une meilleure expression de la protéine VP16. Nous avons donc étudié la synthèse de la protéine VP16 à partir du gène UL48 dans différents systèmes d’expression.

Ces expériences d’expression transitoire nous ont permis de proposer une autre explication quant à la faible détection de la protéine VP16. En effet, nous avons également constaté que la

détection de la protéine VP16 exprimée à partir du gène UL48 était faible dans les systèmes d’expression in vivo, et ceci nous a amené à émettre l’hypothèse d’une toxicité de la protéine VP16 pour les cellules. L’analyse de la transcription du gène UL48 en transfection transitoire sera réalisée car une instabilité du transcrit monocistronique pourrait également expliquer la faible production de VP16. Une meilleure stabilité des transcrits et/ou une meilleure expression de la protéine VP16 pourrait rendre compte des résultats obtenus en utilisant le virus recombinant de la vaccine T7 (vvT7), ce qui suggère que le « contexte viral » pourrait être nécessaire à la bonne expression de VP16.

La protéine VP16 codée par le gène UL48 n’est pas essentielle pour la réplication du virus en culture cellulaire. Un virus portant une délétion du gène UL48 est capable de former des plages dans les CESC et les cellules QM7. Cependant, le virus 20? 48 présente un défaut de croissance dans les CESC par comparaison au BAC20. L’expression de VP16 et son accumulation dans les stades tardifs de l’infection dans les CESC, expliquerait de toute évidence le défaut de croissance observé pour le virus 20? 48.

Il faut également noter qu’un petit cadre ouvert de lecture (ORF91), codant pour un peptide de 91 aa et présent dans l’ORF48, pourrait jouer un rôle dans la réplication virale. Ce peptide ne possède pas d’homologie avec des peptides connus, et son caractère fonctionnel reste à démonter dans le cas d’une infection par le MDV.

Le défaut de croissance observé pourrait avoir pour origine une modification de l’organisation transcriptionnelle de la région due au remplacement du gène UL48 par le gène de résistance à la kanamycine. En effet, en aval du gène UL48, se situe le signal de polyadénylation partagé par les gènes UL49,5 et UL49 ainsi que la région promotrice du gène UL47. Cependant, ni le signal de polyadénylation ni le promoteur de la séquence UL47-46 ne sont affectés par la mutagénèse, car la protéine VP22 semble être exprimée à un niveau similaire que dans les CESC infectées par le BAC20 et la synthèse de la protéine VP13/14 est détectée lors d’une infection par le 20? 48, ce qui indique que l’organisation transcriptionnelle de la région UL49,5-46 est peu affectée par l’insertion du gène de la résistance à la kanamycine. Par ailleurs, les protéines VP13/14 et VP11/12 semblent être mieux exprimées dans les cellules infectées par le virus 20? 48. Il reste à montrer que cette élévation du niveau d’expression de ces deux protéines est significative et vient pallier l’absence de la protéine VP16 au cours de la réplication virale.

Les plages formées par le virus 20? 48 semblent possèder en leur centre un plus grand nombre de cellules infectées que les plages formées par les virus BAC20, 20? 47 et 20? 46. Il est possible que l’expression de la protéine VP16 induise le décollement des cellules du tapis cellulaire. En effet, les cellules infectées par le virus 20? 48, dans lesquelles la protéine VP16 n’est pas détectée, semblent plus adhérentes que les cellules infectées par les virus BAC20, 20? 47 et 20? 46. Cette hypothèse pourrait également expliquer (en partie) la meilleure détection des protéines VP13/14 et VP11/12 dans ces cellules dans les stades tardifs de l’infection du virus 20? 48.

La comparaison de la protéine VP16 du MDV-1 avec les autres alphaherpesvirinae montre que l’expression de VP16 est régulée différemment dans le MDV-1, et son rôle exact durant l’infection reste encore à établir. La protéine VP16 du VZV (ORF10) est abondamment exprimée dans les cellules infectées, mais n’est pas essentielle à la réplication virale. Par opposition, la protéine VP16 est absolument nécessaire à la réplication d’HSV-1. La protéine VP16 d’HSV-1 possède plusieurs rôles dans la réplication virale, transactivant l’expression des gènes α, interagissant avec la protéine VHS (virion host shut-off), et permettant la sortie du virion et la formation de particules extracellulaires.

Des expériences ultérieures sont nécessaires pour déterminer si la protéine VP16 du MDV-1 est impliquée dans la réplication à des stades précoces de l’infection virale ou dans la maturation virale et l’infection de cellule à cellule dans les stades tardifs de l’infection, mais la délétion de ce gène n’a qu’un impact mineur sur la croissance du MDV-1 en culture cellulaire. La faible expression de la protéine VP16 dans les CESC pourrait expliquer le caractère très associé aux cellules du MDV, mais une action non régulée de la protéine VHS (UL41) au cours de l’infection du MDV-1 pourrait également être à l’origine du faible taux réplication du MDV en culture cellulaire. Il reste à montrer qu’une délétion du gène UL41 MDV facilite la multiplication virale.

Les protéines VP13/14 et VP11/12 sont détectées dans les CESC infectées par le MDV et sont exprimées majoritairement dans les cellules situées au dessus du tapis cellulaire et sensibles au décollement lors de la fixation par des solvants organiques. Il convient de signaler que ces deux protéines présentent les mêmes caractéristiques que la protéine VP16 lorsqu’elles sont exprimées sous contrôle du promoteur du CMV. Une toxicité de ces protéines pour les cellules peut être également supposée, mais l’absence d’autres protéines virales pourrait également rendre compte de cette faible production. La stabilité et le niveau de traduction des transcrits γ2 sont en effet

dépendants de la présence de facteurs viraux impliqués dans le contrôle de la traduction et ceci pourrait expliquer nos résultats dans les expériences d’expression transitoire ou constitutive. La protéine VP13/14 est détectée majoritairement dans les extraits nucléaires des cellules d’insecte et sa localisation dans les CESC est également majoritairement nucléaire. Dans les noyaux, la protéine VP13/14 se présente sous deux aspects similaires à son homologue chez HSV-1 : diffuse dans certains noyaux, elle apparaît parfois dans d’autres noyaux sous forme de ponctuations. Elle semble également être liée au chromosome dans des cellules infectées en se co-localisant avec la protéine VP22. Cette localisation nucléaire pourrait être liée à un rôle de la protéine VP13/14 dans la réplication virale et/où à un rôle dans la maturation du virion. Un virus délété du gène UL47 montre d’ailleurs un défaut de croissance par rapport à son virus parental, le BAC20. Ce virus présente également une diminution importante de la taille des plages et de la production de virus infectieux entre les jours 5 et 7 post-infection. Du fait de sa localisation nucléaire, la protéine VP13/14 pourrait jouer un rôle dans le premier enveloppement du MDV au niveau nucléaire. La protéine VP13/14 du virus HSV-1 qui présente une localisation nucléaire est capable d’importation et d’exportation nucléaire et serait également incorporée dans la structure tégumentaire au niveau nucléaire (Donnelly et Elliott, 2001a, Donnelly et Elliott, 2001b). Cette protéine qui a récemment été suspectée d’être une protéine transactivante pourrait également réguler la réplication de l’ADN viral (Donnelly et Elliott, 2001c).

La protéine VP11/12 est par contre très faiblement détectée dans les CESC en immunofluorescence indirecte, ce qui suggère que cette protéine n’est pas une protéine virale majeure. La protéine VP11/12 semble être phosphorylée dans les cellules d’insecte au niveau des thréonine et tyrosine et l’utilisation d’un seul AcMo peut introduire un biais pour la détection de protéines phosphorylées. En effet, il est possible que l’AcMo J3 réagisse avec des épitopes sensibles à la phosphorylation et présente une faible fluorescence, restreinte à certaines formes de la protéine. Dans les CESC, la protéine VP11/12 peut être sous-phosphorylée par rapport au système baculovirus/cellule d’insecte ou phosphorylée sur des résidus différents par des protéines kinases virales spécifiques des herpèsvirus.

Un virus délété du gène UL46 forme des plages de lyse dans les CESC. Cependant, ce virus montre un défaut de croissance important par comparaison au BAC20. A l’instar du virus 20? 47, ce virus présente une diminution importante dans la taille des plages et dans la production de virus entre les jours 5 et 7 post-infection. Les plages formées par le virus 20? 46 disparaissent même au septième jour. Une baisse dans la taille des plages a été reportée pour un virus MDV-1 délété du gène US1 codant pour la protéine homologue à la protéine ICP22 d’HSV-1. La courbe

de croissance du virus ? US1 est très similaire à celle de son virus parental jusqu’au quatrième jour, mais ensuite la taille de ses plages et la production de virus diminuent entre les jours 5 et 7. Ces auteurs ont démontré que cette diminution corrélait avec la survie des cellules dans le tapis cellulaire (Parcells et al., 1994).

Dans le cas du virus HSV-1, les protéines VP11/12 et VP13/14 modulent l’activité de transactivation de VP16. Cependant, ces deux gènes ne sont pas nécessaires pour la croissance virale, et leur délétion soit séparément soit en combinaison a très peu d’impact sur la réplication virale. Il est important de noter cependant, que dans le cas d’HSV-1, les cellules peuvent être infectées avec les virus délétés des gènes UL46, UL47 et UL46-47 à de hautes multiplicités d’infection (5 u.f.p/ cellule), ce qui n’est pas possible dans le cas du MDV. Le virus délété des gènes UL46, UL47 et UL48, 20? 46-48, est capable de se multiplier en CESC et QM7, mais se caractérise par une multiplication virale très diminuée. Nous pouvons conclure, que ces trois gènes, délétés séparément ou en combinaison, ne sont pas essentiels à la réplication du MDV-1 dans des cultures cellulaires. Dans le cas du virus HSV-1, ces trois protéines, qui font partie de la particule virale extracellulaire, sont fortement exprimées dans les cellules infectées. Ces protéines, incorporées à différentes étapes de la morphogénèse virale (les protéines VP13/14 et VP16 sont incorporées au premier et second enveloppement respectivement), jouent un rôle dans la sortie virale (Mossman et al., 2000 ; Donnelly et Elliott, 2001a). Dans le cas du MDV où aucune particule virale extracellulaire n’est produite, la faible détection ou l’absence de ces protéines à des étapes clés de la maturation virale pourrait expliquer le caractère très associé aux cellules du MDV-1.

La protéine VP22 est détectée dans les CESC infectées par le MDV, au niveau des follicules plumeux des poulets infectés par le MDV-1, et dans les lignées lymphoblastoïdes MSB-1 en cours de réactivation. C’est une protéine fortement exprimée dans les CESC au cours de l’infection virale et qui est retrouvée majoritairement sous forme insoluble dans les extraits nucléaires. Lors de l’étude de sa localisation cellulaire, nous avons été confrontés à deux problèmes majeurs : le profil de réactivité des différents AcMo et pour un même AcMo, une détection différente en fonction du mode de fixation utilisé. D’une manière générale, la localisation de la protéine VP22 semble être uniforme (nucléaire et cytoplasmique) dans les cellules infectées et fixées en paraformaldéhyde, alors qu’après fixation à l’alcool-acétone la protéine VP22 est détectée majoritairement dans et en périphérie des noyaux. Ces observations sont en accord avec celles faites pour la protéine VP22 d’HSV-1. En effet, dans les cellules infectées par le virus HSV-1 et fixées par des solvants organiques, la protéine VP22 pourrait être

« solubilisée » et relocalisée dans le noyau où elle se lierait préférentiellement à des composants nucléaires (histones et ADN) (Elliott et O'Hare, 1999). La fixation des cellules par la paraformaldéhyde qui préserve les structures cellulaires et semble éviter cette fuite de VP22, pourrait cependant inhiber la fluorescence intranucléaire de la protéine VP22 (Brewis et al., 2000). Le pontage par la paraformaldéhyde de complexes composés de la protéine VP22 liée à