3 Matériel et méthodes
4.6 ETUDE DES VIRUS DÉLÉTÉS
4.6.1 Obtention des virus délétés.
Les virus délétés des gènes UL49, UL48, UL47 et UL46 ont été construits à l’aide du chromosome artificiel bactérien possédant le génome du MDV-1, le BAC20 (Dorange et al., 2001).
Dans le génome du BAC20, les gènes UL46 à UL49 sont présents sur un fragment HindIII de 24 kpb (Fig. 34). L’insertion du gène de la résistance à la kanamycine (950 nt) par recombinaison homologue dans le BAC20 introduit un site HindIII supplémentaire, séparant le fragment de 24 kpb en deux fragments plus petits (Fig. 34). L’analyse en gel d’agarose des fragments HindIII du BAC20 et des virus délétés nous a permis de visualiser dans un premier temps l’absence du fragment de 24 kpb (présent dans le BAC20) et la présence de 2 fragments plus petits dans le profil génomique des virus délétés (Fig. 34) (Dorange et al., 2001). Cette étude a été complétée
par l’analyse de la présence ou de l’absence des séquences d’intérêt par hybridation de sondes spécifiques (gène de résistance à la kanamycine et gènes UL46 à UL49) (Fig. 35) (Dorange et al., 2001).
La détermination de la séquence des sites de recombinaison a été également réalisée pour chaque virus délété, confirmant l’insertion correcte du fragment portant le gène de la résistance à la kanamycine dans le site désiré (résultats non montrés).
Figure 34 : Illustration schématique de la mutagénèse du BAC20 et de l'obtention des BAC délétés. A) Organisation schématique et la carte de restriction HindIII de la souche Md-5 du MDV-1. B) Illustration de l'insertion de la séquence BAC dans le locus US2 de la souche 584A du MDV1 (BAC20). C) Illustration schématique de la mutagénèse du BAC20 et de l'obtention des BAC D2L2T2S. La digestion du BAC avec HindIII conduit à un fragment de 24 kb contenant les séquences UL46 à UL49. L'insertion du gène de la kanR par recombinaison homologue génère un nouveau site de restriction HindIII dans tous les BAC délétés, divisant le fragment de 24 kb en deux plus petit. La taille des fragments est en paires de base (pb) et a été calculée sur la base du génome de la souche Md-5 du MDV-1.
fig34
Figure 35 : Digestion par HindIII et analyse en southern blot des BAC20 délétés. A) L'ADN des BAC a été digéré par HindIII, et les fragments ont été séparés en gel d'agarose à 0,8% puis détectés en présence de BET. La flèche et les astérisques indiquent, respectivement, le doublet de bandes dans le BAC20 et les nouveaux fragments générés par l'insertion du gène de la kanR dans les BAC20 délétés. B) Les fragments d'ADN ont été transférés sur une membrane de nylon puis les hybridations ont été réalisées en utilisant des sondes spécifiques des gènes kanR, UL49, UL48, UL47, et UL46. La taille des marqueurs de poids moléculaire (M) est indiquée.
fig35
4.6.2 Les protéines VP11/12, VP13/14 et VP16 ne sont pas essentielles à la
réplication du MDV1.
Les ADN des BAC délétés 20? 46, 20? 47 et 20? 48 qui sont incapable d’exprimer, respectivement, les protéines VP11/12, VP13/14 et VP16, sont transfectés dans les CESC et les cellules QM7 pour analyser les propriétés de croissance de chaque virus. La formation des plages est observée dans les CESC quatre jours après la transfection de l’ADN des BAC délétés 20? 46,
20? 47 et 20? 48. La présence de la protéine majeure de capside VP5 dans les cellules des plages virales, est détectée en IFI en utilisant l’AcMo F19 (Fig. 36 a, c, e, g et i). Dans les cellules QM7 transfectées par ces différents BAC délétés, la détection en IFI de plages fluorescentes est également observée (Fig. 36 b, d, f, h et j). Cependant, en CESC comme en QM7, les virus délétés semblent former des plages beaucoup plus petites que le virus parental, le BAC20. De plus, la taille des plages des virus 20? 46 et 20? 47 régresse à partir du cinquième jour après transfection dans les CESC ou après passage en série sur ces cellules. Cette régression semble plus importante pour le 20? 46 dont les plages de lyse ne sont plus détectables par observation directe sans immunodétection.
Figure 36 : Analyse en IF des virus BAC20 et des virus délétés 20∆46, 20∆47, 20∆48 et 20∆ 46-48. L'ADN des différents BAC est transfecté dans les CESC et les cellules QM7. Les cellules sont fixées, respectivement, 5 et 4 jours post-transfection, puis incubées avec l'AcMo anti-VP5 marqué au vert-oregon. Les cellules sont éxaminées avec un objectif 10X (a-i) ou 20X (b-j) en utilisant un microscope à fluorescence équipé d'une caméra digitale Nikon.
fig36
Ces observations nous ont incité à évaluer de façon quantitative les éventuels défauts de croissance des virus délétés par rapport au virus parental (Fig. 37). La courbe de croissance du BAC20 atteint un maximum à 72 h. et décroit doucement jusqu’au septième jour. Tous les virus délétés présentent un défaut de multiplication par rapport au virus parental, qui se traduit pour tous par une réduction du titre maximal à 72 h. p.i. (Fig. 37) et pour les virus 20? 46, 20? 47 et 20? 46-48 une décroissance accentuée du troisième au septième jour. Le virus présentant le plus important défaut de multiplication est le 20? 46, alors que le virus 20? 46-48 délété des trois gènes semble se répliquer de façon plus efficace que le 20? 46. Ces expériences montrent que les protéines VP11/12, VP13/14 et VP16 seules ou ensemble ne sont pas essentielles pour la multiplication virale (Dorange et al., 2001).
Figure 37 : Courbe de croissance des virus délétés.
Après l'infection des CESC avec approximativement 100 p.f.u. de chaque virus délétés, les titres viraux ont été déterminés au temps indiqué p.i. en incubant des dilutions sur des CESC
fraîchement préparées. La valeur moyenne et les déviations standards de deux expériences indépendantes sont représentées.
4.6.3 La protéine VP22 est essentielle pour la réplication du MDV-1.
Les virus délétés du gène UL49, 20? 49 et 20? 48-49, ne sont plus capables de se propager dans les CESC et dans les cellules QM7. En effet, seules des cellules isolées exprimant la protéine majeure de capside VP5 sont détectées dans les CESC et QM7 transfectées par l’ADN des virus 20? 49 et 20? 48-49 (Fig. 38A et 38Ba). Un certain niveau de multiplication est restauré en cellules QM7 lorsque les ADN des BAC 20? 49 et 20? 48-49 sont cotransfectés avec le plasmide pUL49 (Fig. 38Bc et 38Bd) (Dorange et al., 2001). Ces résultats démontrent que la croissance des virus délétés 20? 49 et 20? 48-49 peut être partiellement complémentée en trans par l’expression transitoire de VP22 dans les cellules QM7, et que la protéine VP22 est essentielle pour la multiplication du MDV-1 en culture cellulaire.
Afin de déterminer la région de VP22 nécessaire à la multiplication du MDV1, des co-transfections de l’ADN du BAC 20? 49 avec les différentes constructions pcDNA3, pUL49N1, pUL49N2 et pUL49-48M2 codant respectivement pour les protéines VP22N1, VP22N2 et VP22MS ont été réalisées en cellules QM7. Toutes les protéines VP22 tronquées en N- ou C-terminale sont capables de trans-complémenter le virus 20? 49, car la formation de plages fluorescentes est observée dans chaque co-transfections, alors que la transfection du 20? 49 dans les cellules QM7 ne montre que la présence des cellules isolées fluorescentes (Fig. 38Be à 38Bj) (Dorange et al., 2001).
Figure 38 : A) analyse en IF de la réplication des virus 20∆49 et 20∆48-49 dans les CESC et B) trans-complémentation du 20∆49 dans les cellules QM7. A) Les CESC ont été transfectées avec l'ADN des BAC 20∆49 et 20∆48-49, fixées 5 j post-transfection et incubées avec l'AcMo anti-VP5 F19 marqué au vert oregon. B) Les cellules QM7 ont été transfectées avec l'ADN du 20∆49 (a-b), 20∆49 + pUL49 (c-d), 20∆49 + pUL49N1 (e-f), 20∆49 + pUL49N2 (g-h), ou 20∆49 + pUL49-48M2 (i-j) puis fixées 4 j post-transfection. Les cellules ont été incubées en présence de l'AcMo anti-VP5 F19 marqué au vert oregon et de l'AcMo anti-VP22 D18 marqué au texas red. La superposition des images est montrée dans la colonne de droite. Les cellules ont été examinées avec un objectif 40X en utilisant un microscope à fluorescence équipé d'une caméra digitale Nikon.
fig38
L’ADN de ces virus délété du gène UL49 a ensuite été transfecté dans les lignées QM7UL49, QM7UL49N1, QM7UL49N2 et QM7UL49-48M2, exprimant de façon constitutive les protéines
VP22, VP22N1, VP22N2 et VP22MS. Cependant, aucune des lignées exprimant constitutivement les protéines VP22 tronquées n’a été capable de trans-complémenter les virus 20? 49 et 20? 49-48. Dans la lignée exprimant constitutivement la protéine VP22, des plages fluorescentes sont détectées après transfection du 20? 49 ou du 20? 49-48, suggérant que la protéine VP22 est capable de trans-complémenter le défaut de croissance des virus délétés du gène UL49. Cependant cette trans-complémentation est partielle et n’a lieu que dans un nombre limité de cellules transfectées, ce qui se traduit par la formation d’une plage fluorescente pour 15 cellules transfectées (Dorange et al., 2001). Par opposition la transfection du BAC20 dans ces lignées permet la formation de plages de lyse, ce qui montre que l’inefficacité de croissance détectée pour les virus délétés du gène UL49 n’est pas due à un phénomène d’interférence, mais plus à une incapacité des protéines VP22 et VP22 tronquées constitutivement exprimées à trans-complémenter efficacement les virus 20? 49 et 20? 48-49.
Nous ne pouvions cependant pas exclure que des mutations présentes ailleurs dans le génome des virus 20? 49 et 20? 48-49 affectent leur réplication ne permettant qu’une complémentation partielle de ces virus délétés. Il convient toutefois de noter que l’ADN de ces deux BAC, délétés d’un gène commun (UL49), ont été obtenus de façon indépendante et il est peu probable que des mutations léthales n’affectent uniquement ces deux BAC alors que d’autres virus délétés viables ont été obtenus de la même manière. Nous avons cependant reconstitué, par recombinaison homologue, un virus 20? 49R en cotransfectant l’ADN du BAC 20? 49 avec le plasmide pGEM-T UL49,5-48. Ce virus 20? 49R reconstitué se réplique de façon similaire au BAC20 et exprime la protéine VP22, ce qui confirme que le défaut de croissance observé du 20? 49 est dû à l’absence d’expression de VP22 (Dorange et al., 2001).