CLONAGE DES GÈNES D’INTÉRÊT

3.2.1 Obtention des inserts

∗Les séquences codant pour les différents gènes (UL49, UL48, UL47, UL46, UL49-48, UL49,5, UL49,5-UL48) sont amplifiées par PCR. La matrice correspond à l’ADN viral extrait de lymphocytes périphériques et de cellules de tumeurs lymphoïdes spléniques prélevés sur des poulets infectés par la souche MDV1 RB1B puis purifié sur résine (nucleobond application (Macherey-Nagel)). Le choix des oligonucléotides a été effectué à partir des séquences publiées de la souche MDV GA (Yanagida et al., 1993) (Tableau 4).

Tableau 4 : Séquence des oligonucléotides utilisés pour le clonage des gènes d’intérêt. tabl4

La PCR est réalisée avec soit la Taq polymérase (Promega) soit la RTth (Invitrogen) selon les indications du fournisseur et la température de fusion des oligonucléotides.

∗Mutagénèse dirigée en vue de l’obtention des séquences UL49N1, UL49N2, 49,5-luc, 49-luc et UL48GAr.

Les séquences UL49N1, UL49N2 codant pour les protéines VP22 tronquée (VP22N1, VP22N2) ont été obtenues par PCR à partir du pGEMTUL49 en utilisant les amorces 49N1, 49N2 et 49R (Tableau 4).

Le remplacement du gène UL48 par le gène de la luciférase, dans les séquences 49-48 et 49,5-48, a été réalisé en 2 étapes (Fig. 14).

Figure 14 : Protocole d'obtention de la séquence UL49,5-Luc. La même méthode a été utilisée pour l'obtention de la séquence UL49-Luc.

fig14

Les séquences UL49,5-49IR (comprenant les gènes UL49,5, UL49 et la région intergénique située entre les gènes UL49 et UL48 (49-48)) et UL49IR (comprenant le gène UL49 et la région intergénique 49-48) sont obtenues par PCR à partir des pGEM-T UL49,5-48 et pGEM-T UL49-48 et en utilisant respectivement le couple d’amorces UL49,5F-IRR et UL49F-IRR.

Ces séquences sont ensuite clonées dans le pGEM-T. La linéarisation de ces deux vecteurs par l’enzyme EcoRI permet de cloner la luciférase portant de chaque côté le site EcoRI pour donner les plasmides pGEM-T UL49,5-luc et pGEM-T UL49-luc.

L’ajout de la séquence répétée GAr à la protéine VP16 a été réalisé en deux étapes.

La séquence UL48 dépourvue de codon stop a été obtenue par PCR en utilisant comme matrice le pGEM-T UL48 et les amorces UL48F et UL48R2, puis a été clonée dans le pGEM-T (pGEM-TUL48R2).

La séquence GAr (Glycine-Alanine repeat) qui comprend les nucléotides 232 à 1140 du gène EBNA1, a été amplifiée à partir d’ADN extrait des cellules B95/8 chroniquement infectées par le virus EBV, puis a été clonée dans le pGEM-T (pGEM-TGAr) (Tableau 4).

La séquence GAr, extraite du pGEM-TGAr par PstI, est clonée en phase avec le gène UL48 dans le pGEM-T UL48R2 digéré également par PstI.

La séquence de chaque insert présent dans le pGEM-T a été vérifiée par séquençage en utilisant les amorces universelles -21M13 et RevM13 s’hybridant de part et d’autre de l’insert sur le gène de la β galactosidase.

3.2.2 Clonage des gènes d’intérêt dans les plasmides d’expression.

Les gènes d’intérêt ont été excisés des vecteurs pGEM-T décrits précedemment (Tableau 5). Tableau 5 : Le clonage des différents gènes d’intérêt dans les 3 vecteurs d’expression a été réalisé selon les digestions enzymatiques indiquées.

tabl5

3.2.3 Préparation des inserts, des vecteurs et ligation.

3.2.3.1 Préparation des inserts.

Les inserts (fragments PCR ou fragments issus de digestion) sont purifiés sur gel d’agarose 1% en tampon TAE (Tris-acide acétique-EDTA) puis extraits de l’agarose et purifiés par adsorption sur résine, en utilisant soit le kit nucleospin extract 2 in 1 (Macherey Nagel) soit la colonne ULTRAFREE DA puis le kit Microcon 30 (Millipore).

3.2.3.2 Préparation des vecteurs. 3.2.3.2.1 Clonage pGEM-T.

Les clonages des produits d’amplification dans le vecteur pGEM-T sont effectués selon les conditions préconisées par le fournisseur (Promega).

3.2.3.2.2 Clonage pFastBac, pET22B+ et pcDNA3.

Les vecteurs (10 µg) pFastBac, pET22B+ et pcDNA3 sont tout d’abord digérés par les enzymes de restriction appropriées (Tableau 5) pendant 2 heures à 37°C, puis purifiés soit sur résine [nucleospin Extract 2 in 1 de Macherey-Nagel, soit en utilisant le kit Microcon 30-micropure (Millipore). L’ADN est repris dans 50 µl de Tris-HCl 5 mM, pH 8,5. La déphosphorylation est réalisée dans un volume final de 100 µl contenant l’ADN purifié, 10 µl de tampon de déphosphorylation 10X (500 mM Tris-HCl, pH 9.3, 10 mM MgCl2, 1 mM ZnCl2, 10 mM spermidine) et 5 µl de phosphatase alcaline (1 U/µl). Le mélange est incubé à 37°C pendant 20 min puis 20 min à 56°C (température d’inactivation de l’enzyme) et enfin 5 min à 4°C. Ces étapes sont répétées une nouvelle fois en ajoutant une même quantité de phosphatase alcaline. Le vecteur est alors purifié soit sur résine [Wizard DNA clean up system (Promega)] soit en utilisant le kit Microcon 30-Micropure (Millipore), puis repris dans l’eau à une concentration d’environ 200 ng/µl.

3.2.3.2.3 Ligation.

La ligation est faite dans un volume de 10 µl contenant insert et vecteur dans un rapport molaire d’au moins 1:1 (200 ng de vecteur par ligation), 1 µl d’ADN ligase T4 (3 U/µl) et 1 µl de tampon de ligation 10X (300 mM Tris-HCl, pH 7.8, 100 mM MgCl2, 100 mM DTT, 10 mM ATP). Le mélange réactionnel est incubé une nuit à 12°C, transféré à 56°C pendant 5 min (inactivation de l’enzyme) puis transfecté par électroporation dans les cellules E.coli TG1 ou TOP10. Un microlitre du mélange de ligation est ajouté à 50 µl de cellules compétentes puis électroporé selon les conditions décrites par Dower et al., (1988) (Dower et al., 1988) (appareil Easyject (Eurogentec) V=2500 V, 156 Ω, 25 µF). Les cellules TG1 sont reprises dans 150 µl de milieu LB et étalées sur des boîtes LB-agar en milieu de sélection adéquat. Les cellules TOP10 sont reprises dans 1 ml de milieu S.O.C (Gibco), agitées pendant 1 h. à 37°C puis étalées à raison de 1, 10 et 100 µl par boîtes.

3.2.3.3 Minipréparation d’ADN plasmidique.

Les clones bactériens sont d’une part repiqués sur boîte de Pétri contenant du milieu LB-agar et de l’ampicilline (banque de conservation), et d’autre part, ensemencés dans 1,5 ml de milieu LB liquide contenant 200 µg/ml d’ampicilline. Cette culture en milieu liquide est incubée à 37°C sous agitation forte pendant 5 heures. Les suspensions bactériennes sont ensuite centrifugées 5 min à 15000 g. Une partie du surnageant est retirée et le reste (environ 50 µl) est utilisé pour remettre en suspension le culot bactérien. La paroi bactérienne est lysée par l’ajout de 300 µl de TNS (Tris-HCl 20 mM, pH 7,4, EDTA 1 mM, NaOH 0,1 N, SDS 0,5%). Le mélange est agité par retournement et laissé à température ambiante pendant 5 min. Les protéines et l’ADN chromosomique bactérien sont ensuite précipités en ajoutant 150 µl d’acétate de sodium 3M sous agitation douce. Après une incubation de 5 min dans la glace, le tube est centrifugé 5 min à 15000 g. L’ADN plasmidique dans le surnageant est précipité par addition de 1 ml d’éthanol. Le mélange est centrifugé 5 min à 15000 g. Le culot obtenu est lavé avec 1 ml d’éthanol 80%, séché et repris dans 50 µl de tampon (tampon de digestion et 10 ng/ml de Rnase A) permettant les digestions enzymatiques ultérieures.

3.2.3.4 Maxipréparation d’ADN plasmidique.

Le clone bactérien sélectionné est amplifié par culture dans 250 ml de milieu L-ampicilline sous forte agitation pendant 1 nuit à 37°C. L’ADN plasmidique est purifié sur résine selon le même principe de lyse alcaline que les minipréparations d’ADN plasmidique [nucleobond PC 500 (Macherey Nagel)]. La concentration en ADN est ajustée à 500 ng/µl.