DÉTECTION ET CARACTÉRISATION DES PROTÉINES VIRALES

L’obtention des AcMo nous a permis de suivre la synthèse de ces quatre protéines lors d’une infection virale. Dans les cellules embryonnaires de peau de poulet (CESC) où la réplication du MDV est semi-permissive (pas de virus extracellulaires formés), la souche RB-1B du virus MDV1 induit un effet cytopathogène qui se traduit par la formation de plages de cellules infectées arrondies caractéristiques du virus MDV. L’expression de ces protéines sera également étudiée dans les cellules épithéliales des follicules plumeux où la réplication virale est complète et lors de la réactivation du virus dans les lignées lymphoblastoïdes MSB-1.

Nous nous sommes plus particulièrement attaché à décrire les propriétés de la protéine VP22, en raison de sa forte expression dans les cellules infectées par le virus MDV. Par ailleurs, la faible expression de la protéine VP16 dans ces cellules, nous a incitée à étudier sa traduction à partir des messagers bi- et tri-cistroniques reportés coder pour la protéine VP16 dans les cellules infectées.

4.5.1 Protéine VP22

4.5.1.1 Détection de la protéine VP22 4.5.1.1.1 CESC infectées par MDV1

La protéine VP22, détectée en IFI par les sept AcMo, est très fortement exprimée dans les CESC infectées par le MDV (Dorange et al., 2000). La protéine VP22, présente dès 4 h après l’infection, semble augmenter en quantité pendant toute la durée de l’infection. Ce résultat reste cependant à nuancer car les cellules ne peuvent pas être infectées de façon synchronisée et les cellules infectées issues de l’inoculum et fixées sur le tapis expriment la protéine VP22. Cependant, ces cellules présentent des aspects différents qui permettent de les distinguer. En effet, les cellules de l’inoculum, souvent endommagées, présentent une forte fluorescence et sont situées au dessus du tapis cellulaire, alors que les cellules nouvellement infectées, peu endommagées et situées dans le tapis cellulaire, présentent une fluorescence moins intense dans les premiers stades de l’infection virale.

En immunoempreinte, la protéine VP22 est détectée par l’AcMo L13a dans les extraits totaux et dans les extraits nucléaires des CESC infectées par MDV. Sa masse moléculaire est estimée à 30 kDa, et est similaire à celle observée pour la protéine VP22 recombinante (Fig. 23). La protéine VP22 est également détectée par coloration au bleu de coomassie dans cet extrait nucléaire, ce qui suggère que cette protéine est une protéine virale majeure (Fig. 23).

Figure 23 : Analyse de l'expression de la protéine VP22 dans les CESC en immunoempreinte. (A) Profils protéiques des extraits cellulaires et nucléaires colorés au bleu de Coomassie et (B) analyse par immunoempreinte de l’expression de VP22 en utilisant l’AcMo L13a. Lignes 1 et 2 : extraits totals de CESC infectées (1) et non infectées (2) ; ligne 3 et 4 : extraits cytoplasmique (3) et nucléaire (4) des CESC infectées.

fig23

Dans ces conditions d’extraction, VP22 semble être une protéine majoritairement associée à ce que nous définissons comme un compartiment nucléaire.

Nous avons également étudié la localisation de la protéine VP22 en immunofluorescence indirecte qui nous semblait être la méthode la plus adaptée pour cette étude. Cette étude a été initiée en fixant les cellules à l’alcool-acétone qui était le mode de fixation couramment utilisé au laboratoire (Dorange et al., 2000). Cependant, certains auteurs notaient des artéfacts de détection

lors de la fixation de la protéine VP22 d’HSV-1 par des solvants organiques, et nous avons voulu également étudier la localisation de VP22 après fixation par la paraformaldéhyde. Nous avons ainsi pu montrer que la détection de VP22 différait à la fois en fonction de l’AcMo et des procédés de fixation utilisés.

Pour faire face à ces difficultés d’interprétation du signal de fluorescence, l’étude de la localisation de la protéine VP22 a été étudiée en double marquage en utilisant soit des AcMo dirigés contre la protéine majeure de capside VP5 (F19 et H18), protéine majoritairement nucléaire, soit un anticorps dirigé contre la glycoprotéine gB, protéine majoritairement cytoplasmique. La détection de ces deux protéines (VP5 et gB) par leur AcMo respectif s’est avérée identique quelque soit le mode de fixation.

Les AcMo L13a, D18, D1 et G4 détectent la protéine VP22 majoritairement dans le noyau des cellules infectées fixées à l’alcool-acétone (Fig. 24A). En co-localisation, les protéines VP22 et VP5 sont détectées dans le compartiment nucléaire des cellules infectées (Fig. 24A). Cette co-localisation n’est cependant pas parfaite, VP22 apparaît plutôt diffuse dans le noyau avec une localisation préférentielle au niveau de la membrane nucléaire ; VP5 détectée en fluorescence, apparaît moins diffuse que VP22, se présentant majoritairement sous forme de granules intranucléaires et très brillants. Ces différentes localisations au sein de la cellule pourraient déterminer les sites de réplication ou d’assemblage de la capside (VP5) et les sites du premier enveloppement (pourtour nucléaire VP22). Ces mêmes AcMo (D18, L13a et D1) détectent la protéine VP22 dans la totalité (noyau et cytoplasme) des cellules infectées et fixées en paraformaldéhyde (Fig. 24Ba et 24Bb), excepté l’AcMo G4 qui détecte la protéine VP22 majoritairement dans le cytoplasme de ces cellules.

L’AcMo B17 détecte la protéine VP22 majoritairement soit dans le noyau soit dans le cytoplasme des cellules infectées fixées à l’alcool-acétone. Ces différences dans la détection de VP22 pourraient être dues à différents stades de réplication virale. Cependant, lorsque les cellules sont fixées en paraformaldéhyde, la protéine VP22 reconnue par l’AcMo B17 est détectée majoritairement dans le cytoplasme des cellules infectées (Fig. 24Bc).

Figure 24 : Etude de la localisation de la protéine VP22 dans les CESC infectées par le MDV-1. Les CESC sont fixées soit à l’alcool-acétone (A) soit à la paraformaldéhyde (B) puis incubées avec les AcMo indiqués marqués soit au vert Oregon (OG) soit au rouge Texas (TR). Les

cellules ont été examinées en microscopie confocale (A) où avec un objectif 40X en utilisant un microscope à fluorescence équipé d’une caméra digitale TV Lens Nikon (B).

fig24

L’AcMo B12 détecte la protéine VP22 dans le cytoplasme des cellules infectées fixées par les deux procédés.

La fluorescence visualisée en utilisant l’AcMo G22 est encore différente des autres, en localisant la protéine VP22 sous forme de points plus ou moins gros dans la totalité des cellules infectées fixées en alcool-acétone (Dorange et al., 2000). Lorsque les CESC sont fixées en paraformaldéhyde l’AcMo G22 détecte principalement la protéine dans le cytoplasme des cellules infectées. Ces résultats sont résumés dans le Tableau 10.

Conscient du fait que la localisation de la protéine puisse être aussi affectée par son interaction avec d’autres protéines virales, nous avons étudié sa localisation dans des cellules exprimant de façon permanente la protéine.

4.5.1.1.2 Etude des lignées QM7 exprimant les protéines VP22 et VP22 tronquées.

Nous avons été amenés à sélectionner au cours de ce travail des lignées QM7 exprimant de façon permanente les protéines VP22 et VP22 tronquées, et pour des raisons d’organisation de nos résultats, nous avons choisi d’étudier dans cette partie l’expression et la localisation de ces protéines dans leurs lignées respectives. Il est important de noter les protéines VP22 sont exprimées dans ces cellules de façon identique et synchrone au cycle cellulaire et que leur localisation est indépendante de l’expression de protéines virales.

L’étude de la localisation de la protéine VP22 au cours de l’infection virale avait permis de distinguer des différences entre AcMo quant à leur réactivité vis-à-vis des formes de VP22. Cette étude confirme ces différences et permet de distinguer 2 catégories d’AcMo (Tableau 10) (Fig. 25). Premièrement, les AcMo qui présentent une image homogène pour tous les procédés de fixation, et qui peuvent être également divisé en 2 sous-catégories : ceux qui détectent la protéine VP22 majoritairement dans le noyau des cellules (L13a, D1 et D18) et ceux qui la détectent majoritairement dans le cytoplasme de ces mêmes cellules (B12). La seconde catégorie comprend les AcMo qui montrent une image variable en fonction du mode de fixation. Ainsi, les AcMo G4 et B17 qui détectent majoritairement la protéine VP22 dans le noyau des cellules QM7UL49 fixées à l’alcool-acétone, montrent une fluorescence majoritairement cytoplasmique

lorsque ces cellules sont fixées par la paraformaldéhyde. De même, l’AcMo G22 détecte la protéine VP22 dans le cytoplasme des cellules QM7UL49 fixées à l’alcool-acétone, alors que la

fixation de ces cellules par la paraformaldéhyde semble inhiber la détection de VP22.

Figure 25 : Etude en immunofluorescence indirecte de l'expression et de la localisation des protéines VP22 et VP22 tronquées dans leur lignée respective. A) La lignée QM7UL49 est fixée, 1 jour après division, à l’AA ou à la PAF puis est incubée en présence des 7 AcMo anti-VP22. B) Les lignées QM7UL49N1, QM7UL49N2 et QM7UL49-48M2 sont fixées à l’AA puis incubées avec les AcMo D1 ou D18. Les cellules sont examinées avec un objectif 20X en utilisant un microscope à fluorescence équipé d’une caméra digitale Nikon.

fig25

Tableau 10 : Réactivité des AcMo en fonction des procédés de fixation. Chaque AcMo montre une image plutôt cohérente dans la localisation de VP22 dans les CESC infectées et dans la lignée QM7UL49, sauf pour les AcMo B17 et G22.

Anticorps Monoclonaux

Cellules Fixation localisation

L13a, D1, D18 B12 G4 B17 G22 N Alcool-acétone C + - - + + - + + Ponctuation intracellulaire N CESC Paraformaldéhyde C + + - + - + - + - + N Alcool-acétone C + - - + + - + - + - N QM7 Paraformaldéhyde C + + - + - + - + - -

Abréviations : N: nucléaire ; C: cytoplasmique. Les signes + et – signifient une forte et faible détection.

Les protéines VP22 tronquées VP22N1, VP22N2 et VP22MS sont exprimées de façon permanente respectivement dans les lignées QM7UL49N1, QM7UL49N2 et QM7UL49-48M2 (Fig. 25 o, p et q). Ces protéines sont détectées par les différents AcMo dans les mêmes compartiments que la protéine VP22, sauf exception précisée ci-dessous.

Les AcMo G22 et B12 ne détectent pas ou très peu, respectivement, les protéines VP22N1, VP22N2 et les protéines VP22N1, VP22N2 et VP22MS dans leurs lignées respectives.

Ces études nous ont également permis de mettre en évidence que les protéines VP22, VP22N1, VP22N2 et VP22MS se lient aux chromosomes en phase mitotique dans les cellules en division (Fig. 25 d, f, i, o, p et q). Cette liaison à l’ADN est visualisée lorsque les deux types de fixation sont utilisés et ces résultats diffèrent de ceux de Elliott et O’Hare (2000) qui suggéraient que les techniques de fixation des cellules utilisées pour l’IF induisaient une forte perte de cellules en phase mitotique peu attachées au support.

4.5.1.1.3 Follicules plumeux des poulets infectés.

La protéine VP22 est détectée dans des sections de plumes de poulets infectés et semble se localiser dans l’épithelium du follicule plumeux à côté de la couche cornée (Fig. 26).

Figure 26 : Immunofluorescence indirecte sur des sections de plumes de poulet infecté (RB1-B) ou non-infecté en utilisant les AcMo D18 ou L13b. Les cellules ont été examinées avec un objectif 20X en utilisant un microscope à fluorescence Olympus BH2.

fig26

4.5.1.1.4 MSB1

La protéine VP22 est détectée dans les lignées lymphoblastoïdes MSB1 en cours de réactivation. La localisation de la protéine VP22 détectée par l’AcMo D18 est cytoplasmique et nucléaire en fixation paraformaldéhyde (Fig. 27b), alors qu’elle apparaît majoritairement nucléaire en fixation alcool-acétone (Fig. 27c).

Figure 27 : Analyse de l’expression de VP22 dans la lignée lymphoblastoïde MSB-1 en cours de réactivation. Les cellules MSB-1 sont fixées soit en paraformaldéhyde (a, b et ab) soit en alcool-acétone (c, d et cd) puis incubées avec les AcMo indiqués marqués soit au vert Oregon (OG) soit

au rouge Texas (TR). La superposition des images est montrée dans la colonne de droite. Les cellules ont été en microscopie confocale.

fig27

4.5.1.2 Etude des propriétés de VP22 4.5.1.2.1 Transport intercellulaire

La protéine VP22 possède des propriétés de diffusion dans les myotubes présents dans les tapis de CESC infectées par le MDV (dorange et al, 2000). Une des remarquables propriétés de la protéine VP22 du virus HSV-1 étant de diffuser de cellule à cellule, c’est-à-dire d’entrer dans la cellule et de se relocaliser au noyau, les propriétés potentielles d’importation de la protéine VP22 du MDV-1 ont été étudiées. Plusieurs lignées cellulaires ont été testées pour leur capacité à importer les protéines recombinantes VP22 et VP22 tronquées exprimées dans le système baculovirus/cellules d’insecte. L’importation de la protéine VP22 recombinante dans les cellules RK13 a été étudiée en fonction du temps. Les cellules sont fixées à l’alcool-acétone et la protéine VP22 est détectée par l’AcMo D18. Après 5 min. d’incubation, la protéine VP22 est localisée majoritairement dans le cytoplasme des cellules, à 10 min., VP22 se localise à la fois dans le cytoplasme et le noyau et après 30 min. d’incubation, VP22 se localise majoritairement dans le noyau des cellules, en formant un anneau périnucléaire (Fig. 28B). Par opposition, l’AcMo G22 détecte la protéine VP22 majoritairement dans le cytoplasme des cellules importatrices (Fig. 28C).

La protéine VP22 est capable de pénétrer dans des cellules de différentes lignées d’origine aviaire ou mammalienne, LMH, COS-7, Sp2/O et MSB-1.

Les protéines VP22N1, VP22N2 et VP22MS peuvent être importées dans les cellules LMH, ce qui suggère que la partie centrale de VP22 qui comprend les aa 38 à 188 est impliquée dans le transport intercellulaire de VP22 (Fig. 28B).

Figure 28 : Importation de VP22. A) Profils protéiques (coloration au bleu de Coomassie) et immunoempreinte des extraits hypertoniques de cellules d’insecte infectées par le bac UL49 (1) et le bac UL48 (2). L’AcMo L13a a été utilisé en immunoemprreinte. B) Importation de VP22 en fonction du temps. Les cellules RK13 sont fixées après 5, 10 ou 30 min. d’incubation. De même, les cellules LMH sont incubées avec les protéines VP22, VP22N1 et VP22N2 pendant 45 min. puis fixées à l’alcool-acétone. Les protéines recombinantes sont détectées en IFI avec l’AcMo

D18. C) La détection par l’AcMo G22 de la protéine VP22 importée dans les RK13 est également représentée. Les cellules ont été examinées avec un objectif 40X en utilisant un microscope Olympus BH2, excepté pour les cellules de l’image C) observées en microscopie confocale.

fig28

La protéine VP22 d’HSV-1 étant associée aux microtubules au cours de l’infection virale, un rôle éventuel des microtubules dans le trafic intracellulaire et dans la localisation nucléaire de la protéine VP22 recombinante a été étudié dans des cellules importatrices. L’utilisation du nocodazole, désorganisateur du réseau des microtubules n’empêche cependant pas l’importation de la VP22 dans ces cellules (Fig. 29).

Figure 29 : Etude de l'importation de VP22 en présence d'un réseau de microtubules désorganisé. Les cellules COS-7 ont été incubées en présence de nocodazole (a et c) ou n’ont pas été traitées (b et d) puis les cellules sont incubées en présence de VP22 (c et d). Les cellules sont fixées puis incubées avec AcMo anti-alphatubuline (a et b) ou anti-VP22 D18 (c et d). Les cellules ont été examinées avec un objectif 40X en utilisant un microscope à fluorescence Olympus BH2.

fig29

4.5.1.2.2 Liaison à l’ADN

Nous avons étudié une interaction éventuelle entre la protéine VP22 et l’ADN, en raison du caractère basique de la protéine (pHi = 10,8) et d’études démontrant que la protéine VP22 d’HSV-1, qui est une protéine fortement basique, est liée à la chromatine cellulaire au cours de l’infection virale. Nous avons également précédemment observé que la protéine VP22 exprimée de façon constitutive dans les cellules QM7UL49 se localise avec les chromosomes en phase mitotique.

Ces expériences sont basées sur la capacité des protéines recombinantes, séparées en gel de polyacrylamide puis transférées sur membrane de nitrocellulose et renaturée, à fixer des fragments d’ADN marqués à la digoxigénine. Deux bandes majeures sont détectées dans les extraits nucléaires, possédant des masses moléculaires de 33 et 30 kDa (Fig. 30), et correspondant aux deux formes électrophorétiques de VP22 visualisées par coloration au bleu de Coomassie.

Les protéines tronquées VP22N1, VP22MS et VP22S fixent également l’ADN, contrairement à la protéine VP22N2 (Fig. 30). Ceci nous a conduit à estimer que les aa 16 à 37 jouent un rôle majeur dans la liaison à l’ADN de la protéine VP22 (Dorange et al., 2000).

Figure 30 : Activité de liaison à l'ADN de VP22 et des protéines VP22 tronquées. Les mêmes quantités d’extraits nucléaires de cellules High Five utilisés à la figure 1 ont été transférés des gels de polyacrylamide sur les membranes de nitrocellulose. Ces membranes sont ensuite mise en présence d’ADN marqué à la digoxigénine qui est détecté en utilisant un Ac anti-digoxigénine conjugué à la phosphatase alkaline. Les protéines recombinantes présentes dans les extraits nucléaires sont indiquées. La protéine majeure de capside L1 du papillomavirus-16 est une protéine qui lie l’ADN.

fig30

4.5.2 La protéine VP16

4.5.2.1 Détection de la protéine VP16

La protéine VP16 est difficilement détectable dans les CESC infectées par le MDV et fixées à alcool-acétone (Fig. 31a). Les photos présentant la détection en IFI des protéines VP16 dans les CESC fixées à l’alcool-acétone sont très rares. La protéine VP16 est par contre détectée de façon reproductible lorsque les CESC sont fixées à la paraformaldéhyde (Fig. 31b). Elle est détectée majoritairement dans les cellules arrondies situées au centre des plages virales et au dessus du tapis cellulaire (Fig. 31c). La protéine VP16 semble être majoritairement détectée dans la partie cytoplasmique de ces cellules infectées. VP16 ne co-localise ni avec la protéine VP22, détectée par l’AcMo D18, nucléaire en fixation alcool-acétone, ni avec la protéine VP5 lorsque les cellules sont fixées à la paraformaldéhyde (Fig. 31a et 31c).

Figure 31 : Analyse en immunofluorescence de l'expression de la protéine VP16 dans les CESC infectées par le MDV. Les CESC sont fixées soit à l’alcool-acétone soit à la paraformaldéhyde puis incubées avec l’AcMo I13 qui est détecté en IFI et un autre AcMo marqués au rouge Texas (TR). Les images présentées sont le résultat de la superposition des deux couleurs. Les cellules ont été examinées avec un objectif 40X en utilisant un microscope à fluorescence équipé d’une caméra digitale TV Lens Nikon.

La protéine VP16 n’a pas été détectée dans plusieurs coupes de plume, ni dans les lignées MSB-1 en cours de réactivation.

4.5.2.2 Etude de la traduction de VP16.

La protéine VP16 d’HSV-1 étant une protéine essentielle à la réplication virale, présente en quantité importante dans les cellules infectées, la faible détection de son homologue chez MDV était surprenante. Une des explications entre ces différences d’expression, pourrait résider dans les mécanismes de transcription de ces 2 gènes homologues. En effet, la protéine VP16 du MDV est traduite à partir d’un messager bi et/ou tricistronique, alors que son homologue chez HSV-1 possède un transcrit qui lui est propre. Nous avons donc étudié la traduction de la protéine VP16 à partir du messager bicistronique UL49-48 et tricistronique UL49,5-48 dans différents systèmes d’expression afin de comprendre si sa faible détection dans les cellules infectées pouvait être liée à l’absence d’ARN messagers monocistronique correspondant à UL48.

Des expériences préliminaires effectuées dans le système baculovirus/cellule d’insecte, système très efficace en terme de traduction de protéines, semblaient mettre en évidence un défaut de traduction de VP16 à partir de la séquence UL49-48 par analyse des protéines en gel de polyacrylamide. L’IFI confirme l’absence de la protéine VP16 dans ces cellules d’insecte infectées par les Bac UL49-48 et Bac UL49,5-48, alors que la protéine VP22 est détectée lors de ces deux infections.

Il est possible, cependant, que les mécanismes de traduction des cellules d’insecte diffèrent de ceux des cellules aviaires ou mammaliennes, et que ces cellules soient incapables de traduire efficacement des messagers polycistroniques. Nous avons donc voulu étudier la synthèse de VP16 dans des systèmes d’expression in vitro (TNT7-lysat de réticulocytes de lapin) et dans des systèmes d’expression in vivo aviaire et mammalien.

4.5.2.2.1 In vitro

L’étude de la transcription/traduction des séquences UL49-48 (1) à (3) a permis de mettre en évidence la synthèse des deux protéines VP22 et VP16 présentant des masses moléculaires de 33 et 49 kDa, respectivement (Fig. 32A). L’immunoprécipitation des protéines de 33 et 49 kDa par les AcMo D18 et I13 respectivement, (Fig. 32 A1-A2), confirme leur correspondance avec les protéines VP22 et VP16. Les protéines VP16 et VP22MS sont également synthétisées à partir de la séquence UL49-48M2 (Fig. 32 A1-A2).

Figure 32 : Etude de la traduction de VP16 à partir des messagers bi- et tri-cistroniques. A) Transcription/traduction de la séquence UL49-48. Les protéines sont radiomarquées à la méthionine S³⁵ et séparées en gel de polyacrylamide. Les produits obtenus sont

immunoprécipités avec l'AcMo D18 (A1) ou I13 (A2).

Transcription/traduction des gènes UL48 (ligne 1), UL49 (ligne 2), UL49 plus UL48 (ligne 3) UL49-48M2 (ligne 4), UL49-48 (1) (ligne 5), UL49-48 (3) (ligne 6) et UL49-48 (2) (ligne 7). M : marqueur de poids moléculaire.

B) Transcription/traduction de la séquence UL49, 5-48.

Transcription/traduction des séquences UL49, 5-48 (ligne 1), UL49-48 (2) (ligne 2), UL49 (ligne 3) et IL48 (ligne 4)

fig32

La traduction de VP16 à partir du messager UL49,5-48, messager tricistronique détecté dans les cellules infectées par le MDV, a également été étudiée.

La transcription/traduction de la séquence UL49,5-48 permet la synthèse des protéines VP16 et