L’ α -amylase de Penicillium camemberti PL21 :

ةيبعشلا ةيطارقميدلا ةيرئازجلا ةيروھمجلا

République Algérienne Démocratique et Populaire

Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique Université Mentouri -Constantine

Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie Département de Biochimie et de Microbiologie

N° d’ordre : 62/TS/2011 N° de série : 06/SN/2011

Thèse de Doctorat

Présentée pour l’obtention du diplôme de Doctorat d’Etat Option : Biochimie /Biotechnologies

Thème

L’α-amylase de Penicillium camemberti PL21:

Production, Purification, Caractérisation et Immobilisation

Par : NOUADRI TAHAR

Soutenue le : 27 Juin 2011 Devant le jury :

Président : BOUSSEBOUA Hacene Pr. Université Mentouri - Constantine Rapporteur : MERAIHI Zahia Pr. Université Mentouri - Constantine Examinateurs : HARZALLAH Daoud Pr. Université Ferhat Abas- Setif

: SAKA Saad Pr. Université Badji Mokhtar - Annaba : BOULAAKOUD M. Salah Pr. Université Badji Mokhtar - Annaba

Année Universitaire 2010/2011

J’adresse mes sincères remerciements et ma gratitude la plus profonde à tous ceux Qui ont aidé à l’accomplissement de cette thèse. Je remercie chaleureusement mon directeur de thèse Professeur Meraihi de m’avoir reçu au sein de son équipe, de la confiance qu’elle m’a accordée, et de son soutien scientifique et moral tout au long du travail, et surtout pour la grande motivation qu’elle a su m’insuffler tout au long de cette thèse. Je tiens à le faire parce qu’elle m’a permis de découvrir ce vaste domaine charnière entre la biochimie , la microbiologie et les Biotechnologies microbiennes, merci d’avoir cru en moi.

Je remercie également tous les membres du jury d’avoir accepté de lire ce manuscrit et d’évaluer ce modeste travail : le Président de jury Pr. BOUSSEBOUA H., les examinateurs : Pr. BOULAAKOUD M.S., Pr. SAKA S. de l’Université Badji Mokhtar - Annaba et Pr. HARZALLAH Daoud de l’Université Ferhat Abas - Sétif.

Mes remerciements au Pr. Khelifi Douadi pour la réalisation de la partie SDS- PAGE .Mes remerciements vont aussi au Pr. Magdi Derrouiche au centre de recherche Dokki- Egypte Pr Abdelkader Morsi de l’Université de Caire qui m ont aidé à réaliser la partie « purification de l’enzyme ».

J’exprime également ma gratitude à l’égard de Mme Gilmann Louisa de l’IUT- ANGERS- FRANCE qui, à travers leurs activités, ont largement contribué à la partie « Immobilisation de Penicillium et l'alpha amylase ».

Mes hommages s’adressent également aux membres de ma famille pour leur soutien et leur patience dont ils m’ont preuve et leur confiance en moi, ce qui m’aidé moralement pour faire aboutir cette thèse.

Au risque de me répéter, j’exprime mes vifs remerciements à tous ceux qui m’ont aidé de près ou de loin pour la réalisation de cette thèse.

A mon défunt père, qui m'a toujours aidé et guidé vers le chemin de la réussite.

A ma mère, source de mon bonheur.

A ma tendre épouse qui m'a encouragé et à mes enfants.

A toute ma famille et mes amis, Je dédie ce mémoire.

NOUADRI Tahar

1. INTRODUCTION GENERALE………...

2. SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE ………...

1. Moisissures et Penicillium camemberti ………...

1.1. Taxonomie et classification ………...

1.2. Structure et morphologie ………...

1.3. Caractères physiologiques ………...

1.4. Exigences nutritionnelles………...

1.5. Activités biochimiques...

1.6. Toxicité de P.camemberti ………...

1.7. Applications industrielles de P.camemberti ...

2. L’α-amylase ………...

2.1. Introduction ………...

2.2. Enzymes amylolytiques ………... ...

2.3. Enzymes spécifiques des liaisons α (1→ 4) et α (1→ 6)...

2.4. Structure et mécanisme d’action...

2.5. Différentes sources de l’α-amylase………...

2.6. Caractéristiques de l’α-amylase ……...

2.7. Production de l’α-amylase ………...

2.8. Immobilisation de l’α-amylase………...

2.9. Applications industrielles et biotechnologiques de l'α- amylase……..

2.10. Substrat de fermentation ………..

3. MATERIELS ET METHODES...

3.1. Déchets d’oranges substrat de fermentation ………...

3.2. La moisissure P. camemberti PL21...

I

1

3

3 5 6 8 9 13 14 15

17 17 18 19 20 22 24 27 28 31 32

36 36 39

3.3. Production de l’α-amylase en milieu solide...

3.4. Production de l’α-amylase en milieu submergé...

3.5. Optimisation de la production de l’α-amylase ...

3.6. Cinétique de production d’α-amylase en Fermenteur de 2 L...

3.7. Production d’α-amylase en Air Lift à partir de P. camemberti PL21...

3.8. Dosage et mesure effectués après fermentation ...

3.9. Purification de l’α-amylase ...

3.10. Détermination de la masse moléculaire...

3.11. Caractérisation de l’α-amylase purifiée...

3.12. Immobilisation de l’enzyme purifiée dans les billes d’alginate...

4. RESULTATS ET DISCUSSION ...

4.1. Composition chimique des déchets d’oranges...

4.2. Production de l’α-amylase en milieu solide ...

4.3. Sélection des facteurs influençant la production de l’α-amylase...

4.4. Optimisation de la production de l’α-amylase...

4.5. Cinétique de production de l’α-amylase en Fermenteur ...

4.6. Production de l’α-amylase en Air Lift à partir de P. camemberti PL21 ……….

4.7. Purification de l’α-amylase...

4.8. Immobilisation de l’α-amylase partiellement purifiée...

5. CONCLUSION ...

6. ABSTRACT...

7. REFERENCES...

8. ANNEXES...

II

41 42 46 51 51 55 56 58 60 63

69

69 71 73 88 95 96 104 114

124

127

128

147

aw : activity water

BIE : Blocs incomplets équilibres BSA : albumine de sérum bovin CNBr : Cyanure de bromide CSL : Corn-Steep-Liquor

CYA : Czapec extrait de levure agar DEAE : Di Ethyl Amino Ethyl DNSA : acide 3,5 di-nitro salicylique EDTA : éthylène diamine tetra acétate ENAJUC : Enterprise National de jus FAO : Food Agricultural Organization G25 : Gélose G25

INA : Institut National Agronomique KDa : Kilo Dalton

KI : Iodure de potassium Km : constante de Michaelis MAR : Malt-Agar-Rose de Bengal MB : Milieu de Base

MEA : Milieu extrait de levure agar MS : Matière sèche

MM : Masse Moléculaire PDA : Potato Dextrin Agar rpm : round per minute SCP : Singal Cell Protein SDS : Sodium dodécyl sulfate SSF : Solid State fermentation

vvm : volumes d'air par volume du milieu

III

Introduction

1 1. Introduction

Les enzymes sont les outils-clés des biotechnologies car elles offrent de nombreuses possibilités d'applications dans différents domaines en: industries agroalimentaires (industries laitières, brasseries, biscuiteries, panification, charcuterie, pâtisserie, industrie des glaces...), en industries chimiques (détergents, textiles et tannerie), en clinique (enzymes réactifs, enzymes de diagnostic, enzymothérapie par des protéines recombinantes) en recherches (Protéomique et en Génomique) et autres. Le marché biopharmaceutique a atteint en 2003 un chiffre d’affaires de 38 Milliards de dollars représentant 8% du marché pharmaceutique mondial (Little, 2004). Selon le même auteur, ce marché devrait atteindre près de 100 milliards de dollars en 2010 et représenter 12% du marché pharmaceutique mondial.

La production industrielle des enzymes porte surtout sur les amylases et les protéases qui représentent 80 % du marché mondial des enzymes (Morvan ,2010). Les enzymes les plus importantes en termes de revenus sont encore les protéases qui couvraient 34,4 % du marché en 1995 et, à l’horizon 2015, elles risquent d’être détrônées par les lipases (38,5 % du marché prévu) qui sont suivies par les amylases (30,5 %) (Marché européen des enzymes dans les applications alimentaires ) (Morvan ,2010).

Dans la plupart des cas, la production industrielle d’enzymes amylolytiques se fait à partir de souches bactériennes ou de souches fongiques. Cependant, les moisissures sont considérées comme les microorganismes les plus importants en biotechnologies pour leur fort potentiel de développement (Sicard, 1982). Des travaux se sont servis d’Aspergillus pour la production de pectinase et d'α-amylase (Solis-Pereira et al., 1993), de Penicillium pour la production de pyruvate carboxylase (Liang et al., 2000) , P. camemberti dans l’affinage des fromages (Lenoir et al., 1979) et pour la production de lipase , de protéase (carboxypeptidase, aspartyl-protéase, aspartic-endopeptidase ) ( Bancerz et al., 2005). Mais très peu de travaux se sont intéressés à la production de l'α-amylase par P.

camemberti ; exception faite, pour les travaux de l’équipe japonaise de 2008 qui a réalisé la production de l'α-amylase par Penicillium brunneum 24 (Haska, 1994) , Penicillium griseoroseum (Rina, 2001) et Penicillium rugulosum (Tiwari et al., 2007).

Introduction

2

Notre étude consiste donc à produire de l'α-amylase par P. camemberti PL21 cultivé sur un substrat constitué par les déchets d'oranges. Le choix des substrats de fermentation n’est

pas fortuit ; au contraire, il est basé sur un critère écologique (recyclage des sous-produits industriels pour lutter contre la pollution de l'environnement) et sur la production d’une substance à haute valeur ajoutée avec un procès pas onéreux. Le choix du milieu approprié de fermentation est essentiel pour les microorganismes, aussi bien pour la croissance que pour la production d’enzymes. La production d’enzymes amylolytiques par les mycètes s’est considérablement améliorée par utilisation de différents milieux de base (Dubey et al., 2000 ; Morales et al., 2010).

Avant l’entame de la stratégie expérimentale plusieurs questions se sont posées à nous.

Quelle est la composition du milieu pour une production optimale de l’enzyme? Quelles sont les caractéristiques physico-chimiques et les paramètres cinétiques de cette enzyme pour une éventuelle exploitation industrielle ? Ses performances seront-elles améliorées lorsqu’elle est immobilisée ? Les réponses à ces interrogations sont formulées en objectifs qui constituent la trame de fond de notre travail de thèse.

Penicillium camemberti

3 1. Moisissures et Pénicillium camemberti

Les moisissures sont des champignons inférieurs microscopiques comportant environ 1850 genres et 15000 espèces (Botton et al., 1990), essentiellement aérobies et saprophytes mais certains parasitent des animaux et des végétaux. Elles se présentent sous forme de filaments et de cellules avec un noyau ainsi que des hyphes plus ou moins enchevêtrés (Samson et al., 1977).. Leurs propriétés de dégradation et de synthèse sont très développées. Elles ont fait l'objet d'un grand nombre d'utilisations industrielles pour la production d'antibiotiques, d'enzymes ou d'acides organiques (Sicard et al., 1982) ainsi que dans la transformation des stéroïdes (Taylor et al.,1995). Ce sont des éléments importants de dégradation qui s'attaquent dans les lieux humides à toutes les matières organiques (Vayssier et al., 1990). Le nombre et la variété des champignons rendent leur classification difficile tandis que la multiplication asexuée détermine leur classification. Les champignons ne montrent pas une forme de reproduction sexuée connue

Les spores du genre Penicillium sont dispersées dans l'atmosphère avec le moindre courant d'air. Elles ne germent pas dans l'eau pure mais le peuvent rapidement en présence des traces de nourriture ou sur les fruits comme les oranges (Fig.3). Au laboratoire, on estime qu’une seule spore germant à 25C° sur un milieu de culture gélosé peut produire 100,000 spores dés le deuxième jour et 12 millions dans les 24 h suivantes. Sur un seul grain de blé, on a pu dénombrer jusqu'à 25 millions de spores de P. verrucoum (Larroche et al., 1988).

1.1. Taxonomie et classification de P. camemberti a) Taxonomie

En 1906 Thom décrit sous le nom de Penicillium camemberti, un champignon qu'il avait isolé deux ans auparavant d'un camembert venant de France. La souche répertoriée semble stable. En culture elle forme des thalles d'une texture assez lâche, d'abord d'un blanc pur puis devenant faiblement gris-vert pâle à verdâtre-glauque après une semaine, au moment de la différenciation des spores (David et al., 2009).

La taxonomie du genre Penicillium repose sur les travaux de Rapper et Thom (1949) et sur des mises au point plus récentes qui ont cherché à normaliser les diverses dénominations sur la base de la forme des organes de fructification. En 1949 Rappert et Thom classent le genre Penicillium dont on détermine environ 150 espèces (Pitt, 1979) en quatre sections. La

Penicillium camemberti

4

section est déterminée sur la base de la structure de pénicilles et 277 espèces si l’on se réfère à Samson (1977).

Les souches de Penicillium utilisées en fromagerie appartiennent à la section des Asymetrica qui comporte cinq sous-sections. Jusqu'à ces dernières années, on distinguait deux espèces : P. caseicolum (anciennement P. candidum), dont les colonies restent blanches et P.

camemberti (anciennement P. album) qui prend une teinte blanche ou vert pâle après une dizaine de jours d’incubation. Samson et al. (1977) ont estimé qu’une telle distinction n'était pas justifiée et qu’à l’heure actuelle ces espèces sont réunies sous le nom de P.camemberti Thom (Pitt, 1979). Cependant, toutes les souches de P. camemberti ne possèdent pas exactement les mêmes caractéristiques et Moreau (1979) a proposé de les classer en quatre formes:

 La forme Neufchâtel à souches sauvages, vigoureuses, à croissance rapide, donnant un feutrage épais, blanc jaunâtre.

 La forme à «poils courts» à souches à croissance rapide, à thalles serrés, ras et élevés.

 La forme à « poils longs» à souches à croissance lente et thalles lâches.

 La forme à thalles floconneux, d'abord blancs, puis gris vert (variété Camemberti sensu stricto). P. camemberti n'est pas la seule espèce à former des thalles blancs;

d'autres Penicillium ayant cet aspect peuvent contaminer les produits laitiers. Par exemple P. thomii, P. nalgiovensis, P. verrucosum (Moreau, 1979). P.

roqueforti appartiennent au groupe des velutina. Le mycélium est en grande partie submergé; la partie aérienne est constituée de conidiophores partant directement du substrat ; les pinceaux se trouvent au même niveau et donnent un aspect velouté à la colonie caractérisé par des conidiophores à parois rugueuses et verruqueuses (Choisy et al ., 1984).

b) Classification de P. camemberti

Cette classification est fondée sur les caractères morphologiques comme la structure du mycélium et les modes de reproduction ainsi que les caractères tiques des spores, par contre la nouvelle taxonomie emploie les systèmes d'analyse informatique basés sur l’étude phénotypique et protéomique (protéines, nucléotides, acides amines) (Leveau et al.

1993, Boiron, 1996).

Penicillium camemberti

5

Tableau 1 : Structure et caractères morphologiques des Penicillium (Botton et al., 1990; Leveau et Bouix, 1993 )

Nº Colonies Condiophores Couleur Espèces

1 Blanches Lisses Blanche P.nalgiovense

2 Blanches Rugueux Blanche P.camemberti

3 Réduites Epais et lisses Vert Jaune

Vert gris P.brevicompatum

4 Veloutées lisses Vert Jaune

Vert bleu

P.chrysogenum

5 Fasciculaires phialides courtes

Lisses (souvent quadriverticillés)

- P.griseofulum

P.patulum

6 Fasciculaires Lisses

tri verticillés

- P.expansum

P.italicum

7 Envers sombres Rugueux Verte P.roquefortii

8 Sombres Rugueux Différent

couleurs

P.aurontiogrisum P.commune P.crustosum P.cyclopium P.versicosum

Penicillium camemberti

6 Fungi

 Division : Ascomycota. (Eumycetes).

 Sub-division : Deuteromycotinae.

 Classe : Euromycetae (Fungi imperfecti).

 Sous-Classe : Hyphomycetidae.

 Ordre : Eurotialae.

 Famille : Trichocomaceae.

 Genre : Penicillium.

 Espèce : Penicillium camemberti.

Classification de Penicillium camemberti (Botton et al. ,1990) 1.2. Structure et morphologie du genre Pénicillium

Les Pénicillium présentent un groupe extrêmement cosmopolite et une polyphagie (Leveau et al., 1993) de thalle vert ou plus rarement blanc (Fig.1et 2). Leurs conidiophores sont isolés, groupés en faisceau lâches ou agrégés en corémis bien définis (Cerning et al., 1987 ) ; les pénicilles sont constitués, suivant le cas, soit d'un simple verticille de phialides monoverticillées, soit d'un verticille de ramifications (métules) portant les phialides biverticillées soit de plusieurs verticilles successifs comportant des ramifications des métules et des phialides triverticillées ou quadriverticillées (Samson et al. 1977).

Le P. camemberti (Fig. 2) relève de la section asymétrique sous- section lanata (tableau 1) l’appellation de P. camemberti est synonyme de P. album (Epstein), P. candidum (link), P-caseicolum (bainter) (Cerning et al., 1987 ). Comparé à d’autres espèces, P.camemberti a une faible vitesse de croissance, il forme des colonies de 25 à 35 mm de diamètre sur l’extrait de malt- gélose en deux semaines à 25 C° et possède les caractères morphologiques suivants (Pitt. 1979) :

 Thalle floconneux blanc mais prouvant virer lentement au vert grisâtre, pâle, revers incolore à crème exsudat parfois présent, clair.

 Pénicilles grands et irréguliers : biverticillés, triverticillés ou quadriverticillés.

 Conidiophores finement granuleux ou rarement lisses portés par des hyphes aériens.

 Conidies lisses disposées en chaînes enchevêtrées sub-globuleuses ou globuleuses de taille variable.

 Paroi des stipes lisse ou rugueuse.

 Appareil sporifère triverticillé.

 Phialides ampouliformes, avec un col long et large (Cerning et al., 1987 ).

F

Figure 1 :

igure 2: La

: Penicillium

a morpholo

m camembe

ogie de Peni

7 erti phase de

icillium cam

e sporulatio

memberti (Jo

Pen

n (David e

oseph and G

nicillium cam

et al., 2009).

Gulaud, 199

memberti

.

98)

Penicillium camemberti

8

1.3. Les caractères physiologiques de P. camemberti 1.3.1. Vitesse de croissance

Le Penicillium. camemberti a une vitesse de croissance assez limitée de 25 à 35 mm sur milieu à l'extrait de malt en deux semaines à 25° C (Choisy et al., 1984). Dans l'ensemble les Penicillium, au sens strict, ont une croissance plus importante et surtout plus rapide en début de culture. Pour les variétés blanches le temps nécessaire à l'apparition d'une teinte verte pâle est très variable et est de 4 à 14 jours à 22° C ; il peut donc être beaucoup plus court comme l'indiquait Rappert et Thom en 1949 .Selon ces auteurs l'épaisseur du mycélium se situe entre 2 et 3 mm ou entre 5 et 7 mm après le quatrième jour de croissance.

1.3.2. Température et temps de germination

En milieu à l'extrait de malt à 20 g/l et 22° C et en culture agitée, le temps correspondant à 50% de spores germées varie de 15 min à 25min et 30 min suivant les souches de Penicillium (Prescott et al., 1987). Cette étape de germination doit être déterminée avec précision ; des temps trop longs entraîneraient un développement important des tubes germinatifs et donc une grande fragilité de ceux-ci.

La température joue un rôle prépondérant dans la croissance mycélienne de P.camemberti. Elle intervient également dans la sporulation et la germination des spores (Tiwari et al., 2007).. La plupart des moisissures se développent entre 15 et 30° C avec une croissance optimale aux environs de 20-25°C. Chez certaines espèces, les spores survivent à de très basses températures (jusqu'à -190° C) et resteront aptes à germer lors du retour à des conditions normales (Sun et al., 2007). Le P. camemberti a une vitesse de croissance relativement faible par rapport à celles d'autres espèces de Penicillium, il peut se développer entre 4 et 40 ° C avec une température optimum à 22° C (Choisy et al., 1984).

1.3.3. pH de croissance de P.camemberti

C’est un autre facteur intervenant dans la possibilité de développement des moisissures et aussi dans la production de métabolites. Le pH optimum de croissance de P.camemberti se situe entre 4,0 et 6,0. Les variations de 3,0 et 8,0 ont peu d’influence sur le développement des souches commerciales (Pandey et al., 2000). Il faut noter que les souches sauvages

Penicillium camemberti

9

fortement développées dans les caves sont en général plus acidophiles que les souches industrielles (Choisy

et al., 1984). La plupart des moisissures n’ont que peu d’exigence à l’égard du pH ; elles savent d’ailleurs l’ajuster rapidement à leur convenance (Nigam and Singh ,1995).

1.3.4. Humidité

Cette souche de P. camemberti affectionne particulièrement les milieux humides à activité de l’eau élevée (aw), les rares mesures réalisées montrent que toutes les espèces de Penicillium se situent dans une gamme comprise entre 0,89 et 0, 99 (Rüegg et Blanc, 1966).

1.3.5. Aération

La quantité d’oxygène mise à la disposition des moisissures est un facteur important pour le développement (Nathalie et al., 1993). Le P. camemberti est une moisissure strictement aérobie (Pitt, 1979). Comme la plupart des moisissures les souches les plus exigeantes vivent dans des régions périphériques des substrats, les moins exigeantes peuvent se développer en profondeur ; certaines peuvent même supporter une anaérobiose stricte .D’une façon générale c’est l’oxygène dissous dans le milieu qui influe sur le développement plus que l’oxygène atmosphérique d’où l’intérêt d’une agitation vigoureuse (150 à 200 rpm) pour avoir une oxygénation adéquate et par conséquent un bon développement de la moisissure (Pitt, 1979).

1.4. Les exigences nutritionnelles 1.4.1. Source de carbone et d’azote

Les moisissures se comportent, généralement, en chimio-organotrophes hétérotrophes La nature des substances carbonées conditionne le développement des spores présentes sur un substrat donné et sera à l’origine des successions des flores qui colonisent ce substrat (Lamberet et Lenoir ,1976).

La croissance la plus élevée est obtenue avec le lévulose, le maltose ; le meilleur taux de sporulation est obtenu avec des concentrations (40-60 g/L) pour le saccharose, le glucose, le lévulose, le galactose, le maltose et les polymères tels l’amidon (Botton et al.,1990). Les

Penicillium camemberti

10

substances organiques telles que les déchets issus de l’industrie agro-alimentaire comme les mêlasses (Gerhartz, 1990) des betteraves, des oranges , des abricots et des dattes et le

lactosérum provoquent à la fois une meilleure sporulation et une meilleure croissance pondérale des moisissures (Krasniewski et al., 2006).

La source d’azote n’a pas seulement un effet sur la croissance des microorganismes ;elle est ajoutée particulièrement dans les cultures productrices de métabolites et d’enzymes. On utilise des sources azotées minérales comme le sulfate d’ammonium (NH4)2SO4 qui est une bonne source d’azote pour la sporulation et la croissance (Pederson et Nielsen ,2000) ou organique comme les caséines et leur hydrolysat, le « corn-steep-liquor », la gélatine, la farine de soja ou d’autres protéines hydrolysées (Kathiresan et Manivannana ,2006).

1.4.2. Les sels minéraux

Aucune généralisation n’est possible concernant l’action du sel sur le développement des moisissures. Le genre Penicillium pourrait voir sa croissance légèrement stimulée aux faibles concentrations de 1 à 5% (Lamberet et al., 1980) mais une concentration de 20 % est nécessaire pour entraîner une inhibition totale de la croissance (Choisy et al., 1984). Pour le P. camemberti la sensibilité au sel est assez faible mais variable selon les souches. Il a été observé que la présence dans le milieu de culture d'azote peptidique, de phosphates, de magnésium et de divers oligo-éléments minéraux était favorable à la croissance de P.

camemberti (Lenoir et al. ,1979).

1.4.3. Les exigences gazeuses

Les moisissures ont un besoin absolu d’oxygène pour se développer. Elles sont sensibles aux teneurs élevées en gaz carbonique .Plusieurs souches de Penicillium sont stimulées par des teneurs en CO2 <15% dans l’air. Elles sont cependant inhibées par des teneurs supérieures (Larpent et Sauglier, 1992). Une limitation d’oxygène entraîne souvent une baisse importante de croissance et un phénomène de dimorphisme qui se traduit par un changement total d’aspect de la souche. Par ailleurs une partie du CO2 , produit au cours de la respiration aérobie, est réutilisée par certains champignons pour la production de métabolites secondaires acides. P.camemberti est une moisissure aérobie ; elle se cultive bien en présence d’un faible taux d’oxygène voisin de 5% (Lenoir et al. ,1979).

Penicillium camemberti

11

1.4.4. Facteurs de croissance et vitamines

Les facteurs de croissance sont des composés indispensables à la nutrition et à la croissance de certains micro-organismes.

Les stérols, les acides gras, les purines et les pyrimidines constituent des facteurs de croissance nécessaires en quantité relativement importante pour le développement d’un certain nombre d’espèces. Les stérols jouent un rôle majeur dans la formation de thiamine (vitamine B1) et de la biotine (vitamine B7) intervenant comme co-enzyme lors des carboxylations.

1.4.5. Caractéristiques de la moisissure utilisée pour la fermentation

Le choix de la souche utilisée selon Botton et al., (1990) doit répondre à un certain nombre de critères parmi lesquels :

 Facilité d’emploi de la souche

 Absence de pathogénicité.

 Stabilité génétique.

 Résistance à des inhibiteurs susceptibles d’être présents dans les milieux.

 Robustesse, c'est-à-dire bonne résistance aux accidents d’utilisation (évolution du milieu, des conditions de culture, contamination et stabilité des systèmes enzymatiques).

 Coût d’utilisation

 Exigences nutritives limitées.

 Utilisation possible de substrats bon marché (sous produits recyclés).

 Aptitude au développement dans des conditions simples.

 Performance de la souche

 Vitesse de production.

 Rendement de production.

 Productivité.

Penicillium camemberti

12

Tableau 2 : Enzyme α-amylase produite par le genre de Penicillium

Souche Enzyme Composition de milieu

Références.

P.simplicissium P.viridicatum RFC3 P.fellutanum P.brunneum 24 P.expansum P.chrysogenum194

P.penicillium RR99 P.griseoroseum P.funuculosum P.digitatum P.italicum

P.chrysogenum Q-176 P.nalgiovense

P.purpurogenum P.capsulatum

P. urticae

Enzymes complexe (α-amylase)

α-amylase Pectinases (α-amylase) α-amylase α-amylase α-amylase α-amylase

α-amylase +Xynalase α-amylase

α-amylase α-amylase α-amylase α-amylase α-amylase

Amidon 10% +urée +Mollasse+Cacl2

Amidon 5%

+NH2SO4+Riz

Amidon 5%

+NH2SO4+ Pulpe de betterave

(Chaplin et al., 1990 )

Afifi et al., 2008) (Haska. et Ohta, 1994) (Baldwin et al., 1986)

Penicillium camemberti

13

 Qualité du produit obtenu

Dans notre cas, nous avons choisi P. camemberti, car elle répond à l’ensemble des critères sus -cités et son utilisation importante en industrie confirme ses qualités non toxiques.

1.5. Les activités biochimiques de P. camemberti

La production d'enzymes par les souches d’Aspergillus ou de Penicillium (Bousseboua, 2002) dépend d'un certain nombre de paramètres et en premier lieu de la composition du milieu de culture (tableau 2). Le milieu de base, assez généralement utilisé pour ces études, a été celui de Czapek avec, cependant, certaines modifications concernant notamment les sources d'azote ou d'enzymes exocellulaires actives sur caséine à pH 6 sont très nettement favorisées par le remplacement de l'azote nitrique par une peptone trypsique de caséine (Lenoir et al. ,1979).

P.camemberti joue un rôle de ferment fongique primordial dans l’industrie du fromage grâce à ses enzymes (camembert, brie, carré, etc.). (Larpent and Sauglier, 1992).

P.camemberti est relativement peu protéolytique comparé à d’autres espèces du même genre ; les plus actives sont proches du type sauvage (Lamberet et al., 1980) . Parmi les enzymes protéolytiques exocellulaires produite par P.camemberti on cite :

 Deux endopeptidases , une protéase acide de pH optimum 5,0 sur la caséine et Une métalloprotéine de pH optimum 6,0 sur la caséine.

 Une carboxypeptidase de pH optimal 4,0 à 6,0.

 Une aminopeptidase de pH optimal 7,5 à 8,5.

L’activité lipolytique de P. camemberti se manifeste surtout au voisinage du mycélium.

Elle est aussi responsable de la dégradation de la méthionine et de l’arome du fromage. Une lipase exocellulaire a été mise en évidences, son pH optimum d’action est de 8,5 ; elle est active dans les conditions optimales par la dégradation de la matière grasse (Lenoir et al.

,1979).

Le P.camemberti synthétise aussi des composés aromatiques du type methycetone, aldéhydes et d’alcools secondaires par β-oxydation des acides gras. Il est avéré qu'une corrélation positive existe entre le pouvoir protéolytique et lipolytique ainsi qu’entre le pouvoir

Penicillium camemberti

14

Tableau 3 : Principales enzymes produites par P. camemberti (Auberger et al., 1985 ; Bancerz et al., 2005).

P. camemberti

Enzymes

 Lipase

 Carboxypeptidase

 Aspartyl protéase

 Aspartic endopeptidase

 Prolyl aminopeptidase

 Lipoxygenase

 Hydroxyperoxide lyase

 Endo 1-4- D-gluconase

 Cellubio hydrolase

 Cellubiase

 Cellulase complexe

 Pyruvate carboxylase

Penicillium camemberti

15

lipolytique et la production d’âromes (Lamberet et al., 1980). En effet, la moisissure P.camemberti peut sécréter une large variété d'enzymes (tableau 3).

1.6. La toxicité de P. camemberti

L’espèce P. camemberti est une moisissure non toxique mais, disposée dans certaines conditions, elle peut le devenir (Lenoir et al. ,1979). C’est essentiellement en Allemagne qu’on s’est intéressé aux éventuelles mycotoxines produites par P.camemberti.

Une publication de Gibel (1971) a donné lieu à l’hypothèse que l’espèce de P.

camemberti (P.candidum) favorise le développement de tumeurs ; ce soupçon a été examiné par French et al. en 1975 par des essais sur des truites et des rats. Cependant aucune manifestation n’a été observée (Nathalie et al., 1993). Certaines souches de P.camemberti peuvent élaborer de l’acide cyclopiazonique , une neurotoxine dont l’abus entraine des diarrhées et des convulsions ; la température optimale de formation de cette mycotoxine est de 25°C (Nathalie et al., 1993).

1.7. Les applications industrielles de P.camemberti

1.7.1. Fabrication des fromages

Le rôle du Penicillium dans les fromages a été confirmé par des études sur des laits caillés à flore contrôlée (Lenoir et al. ,1979). Les endopeptidases exocellulaires dégradent profondément les caséines α S1 et βS1 à pH acide. Sur ces dernière la protéase acide scinde particulièrement trois liaisons (lys29 – Ile30 ; lys97 – val98 ; lys–Glu100) en libérant ainsi les peptides, (Ile30 – val209, val98-val209, Glu100-val209). La métalloprotease hydrolyse également la caséine β (rupture des liaisons Lys28–Lys29, Pro90–Glu91 ; Glu100–Ala101).

P. camemberti assure la couverture blanche des fromages à pâte molle et croûte fleurie comme le brie ou le camembert (Samson et al., 1977).Ce qui lui donner une résistance contre les microorganismes pathogènes. Dans les fromages à pâte persillée, les exopeptidases excrétées par les Penicillium dégradent fortement les peptides présents et sont à l'origine des quantités élevées d'acides aminés trouvés dans ces fromages (Lenoir et al.,, 1979).

Penicillium camemberti

16 1.7.2. Fabrications pharmaceutiques

On utilise le P .notatum pour la production d’acides et de pénicilline D- Erythrobique (Uhlig, 1998). Les Pénicillium produisent aussi des métabolites comme la patuline ,un dérivé de l'acide 6-méthylsalicylique extrait de la culture de P. patulum ,P.

expansum, P. glandicola, et P .vulpinum (Ellaiah et al.,2003).

1.7.3. Le salage

Le Geotrichum candidum , doté d'enzymes protéolytiques puissantes, peut provoquer une solubilisation trop rapide de la pâte et empêcher le P. camemberti de couvrir le fromage lorsque son développement est trop important.Cela peut provoquer des incidents de fabrication (peau de crapeau). Par contre le Geotrichum candidum est recherché pour la fabrication de fromage à croûte lavée comme : le pont l'évêque, les maroilles, le munster (Mahmoud et al., 1993).

1.7.4. Lutte contre la pollution

Depuis quelques années des souches de P.camemberti sont apparues, les anti-mucor (Leveau et al., 1993), qui présentent un pouvoir antagoniste vis à vis de très nombreuses mucorales. Ces dernières produisent des myxospores ou spores humides qui sont véhiculées très facilement par l'eau (Moreau ,1979) et sont à l’origine d’un problème de pollution appelé couramment accident du "poil de chat" .Le développement de ces polluants est défavorisé en générale par un pH acide lors d’une fermentation fongique qui suffit le plus souvent à les éliminer (Samson et al., 1977).

L’α-amylase

17 2. L’α-amylase

2.1. Introduction

L’α-amylase comme toutes les enzymes est une macromolécule appartenant à la classe des protéines globulaires, de type endoglycanase de la classe des hydrolases qui agit sur les liaisons α (1→ 4) de l’amidon. Elle est largement représentée chez les animaux, les végétaux et les micro-organismes. Bien que l’α-amylase de différentes origines ait très peu de séquences d'acides aminés identiques, leur structure tridimensionnelle et l'organisation de leur site actif sont similaires (Mercier, 1985). Leur chaîne polypeptidique est organisée en trois domaines formé chacun d’un tonneau de huit segments bêta entourés par huit hélices alpha.

Leurs sites actifs sont constitués d'un ensemble de sous-sites pouvant accueillir chacun un résidu glucose dont le nombre varie selon l'origine de l'enzyme (Scriban, 1993).

2.2. Les enzymes amylolytiques

L'hydrolyse enzymatique de l'amidon s'effectue par 2 types d'enzymes amylolytiques de genre glycosyl hydrolases (Tableau 4).

2.2.1. Les enzymes spécifiques des liaisons α (1→ 4) dont :

 L’α- amylase (E.C.3.2.1.1) dont l'action est toujours de type endomoléculaire et conduit à la formation de D-glucose, D-maltose et une petite quantité de maltodextrines (Scriban, 1993) ;

 L’β-amylase (E.C.3.2.1.2) :La 1→4β-D- glucane, malto-hydrolase est une exoenzyme saccharifiante. Elle hydrolyse les chaînes d'amylose et d'amylopectine à partir de l'extrémité non réductrice en libérant du β-maltose.

L'hydrolyse de l'amylopectine est bloquée au niveau des points de branchement α (1→ 6) , ce qui conduit à la production de 50% à 60% de maltose.Le reste est formé de dextrine limite (Vallier et al., 1977).

 L’γ-amylase ( glucoamylase) ( E.C.3.2.1.3) est une enzyme α (1→4) glucane glucanohydrolase qui hydrolyse complètement l'amytopectine en D glucose et capable également d'hydrolyser les liaisons α (1-3) pour former le maltose (Scriban, 1993).

L’α-amylase

18

Tableau 4 : Enzymes amylolytiques (Wanderley et al., 2004)

Enzyme Origine Liaison rompue

Type d'action

Action sur poly holosides

Action sur oligo holosides β- amylase

α- amylase

Z- enzyme Maltase

γ- amylase, Glucamylase

Enzyme P Phosphorylase Isoamylase

Amylo-(1-6) glycosides Oligo (1-6) glucosides

Enzyme -R

Limite dextrinase Enzyme- D

Végétaux supérieurs Végétaux, Animaux, Bactéries Végétaux Végétaux, Animaux, levure Moisissures Bactéries, animaux

Végétaux Animaux Levure

Animaux

Animaux Végétaux

Végétaux Végétaux Bactéries Bactéries

α (1→ 4) α (1→ 4)

α (1→ 4) α (1→ 4)

α (1→ 4) ou α (1→ 6) α (1→ 4) α (1→ 4) α (1→ 6) α (1→ 6)

α (1→ 6) α (1→ 6) α (1→ 6) α (1→ 6)

α (1→ 6) α (1→ 4) α (1→ 4) α (1→ 4)

H, I H, I

H, I H, I

H, I

T, R T, R H, I H, I

H, I H, I H, I H, I

H, I T, R T, R T, I

+ +

+ -

+

+ + +

+

- -

- + - + + +

+ +

- +

+

+

± -

-

+ -

+ + + +

H : Hydrolyse T : Transfert I : irréversible R : Réversible

L’α-amylase

19

2.2.2. Les enzymes spécifiques des liaisons α (1→ 6)

 L’Iso amylase (E.C. 3.2.1.68) est une enzyme déramifiante ; elle hydrolyse les liaisons α (1→ 6) présentes dans les polysaccharides tels que de l’amylopectine.

 La pullulanase (E.C. 3.2.1.41) est également une enzyme déramifiante spécifique à l'hydrolyse des liaisons α (1→ 6) de pullulan. Elle est incapable d'hydrolyser totalement l'amylopectine qui est beaucoup plus ramifiée que le glycogène (Scriban, 1993).

2.2.3. Les enzymes spécifiques des liaisons α (1→ 6) et α(1→ 4)

 L'amyloglucosidase (E.C.3.2.1.31), encore appelée glucoamylase, scinde rapidement non seulement les liaisons α (1→ 4) des extrémités non réductrices mais aussi les liaisons α (1→ 6) de l'amylopectine en libérant du β- D- glucose (Mercier, 1982).

2.3. Définition et nomenclature de l’α-amylase

Son action, de type endomoléculaire, conduit à la formation du D- glucose, de maltose et d'une petite quantité de maltodextrines. L'enzyme hydrolyse les molécules d'amidon exactement au niveau de la liaison α (1-4) glucanes (Mercier, 1982).

 Non systématique : α-(1-4) D-glucane glucanohydrolase.

 Non codifié : E.C .3.2.1.1

 Non recommandé : Alpha-amylase.

 Synonymes: glycogenase, endoamylase, maxilase, taka-amylase A, takatherm, thermolase, amylotherm, clarase, amylopsin, spitase CP1, G995, kleistase L1, THC 250, maxamy, ptyalin (Graber, 1989).

L’α-amylase

20

2.4. Structure et mécanisme d’action

Les α-amylases sont des métallo-enzymes à calcium (un ion calcium par molécule d'enzyme). Ces ions sont nécessaires à l'activité enzymatique et au maintien de la stabilité de la structure en acides aminés d enzyme qui varient d'une souche à une autre (Fogarty et al., 1980). On prend comme exemple la teneur en acides aminés de l'α-amylase de B.

amyloliquefaciens et A. oryzae.

Structurellement, les α-amylases sont également considérées comme des glycoprotéines renfermant 478 acides aminés répartis en 2 domaines globulaires appelés A (1-380 résidus) et B (381-478 résidus) .Ces domaines sont associés par une chaîne polypeptidique constituée principalement de résidus hydrophobes. La partie glucidique est formée essentiellement de mannose, les résidus constituant le site de fixation du substrat ainsi que ceux constituant le site catalytique sont localisés dans le domaine A qui montre que l' α-amylase est formée de 8 feuillets β plissés et de 8 hélices α (Chiba, 1988 et Burhan, 2003).

Le mécanisme d'action de l' α-amylase nécessite la participation de 3 fonctions du site actif impliquant un attaquant nucléophile, un stabilisateur de la charge positif de l'atome attaqué et un donneur de proton au groupe déplacé ; ceci signifie que le rupture de la liaison osidique fait intervenir une série d'échanges d'électrons et de protons entre certains résidus de l'enzyme et du substrat. Les groupes impliqués dans la réaction du site actif sont deux acides carboxyliques et un noyau imidazole (Parkc et al., 1997).

Ce mécanisme est une caractéristique de l'enzyme dans les conditions expérimentales telles que la T°, pH, taille et d'action des α-amylases :

 Attaque aléatoire: l’α-amylase hydrolyse aléatoirement les liaisons glucosidiques, libérant deux fragments qui seront séparément attaqués.

 Attaque préfèrée : l' α-amylase montre une préférence pour certaines liaisons dans le substrat.

 Attaque répétitive ou multiple : elle implique le déplacement de l'enzyme tout au long de la chaine du substrat, pour hydrolyser les liaisons glucosidiques sans se dissocier du substrat (Berry et Paterson, 1990).

Figu

re 3 : Héli

21 ce d'amylos

se (Chiba,

1988)

L’α-amylase

L’α-amylase

22

Les modalités d'action des enzymes dépendent de leur origine ; elles hydrolysent les liaisons α (1→ 4) de l'amylose et l'amylopectine de l'amidon (l’amylose 25-30% et l'amylopectine 70-75%) (Fig.3), à l'exclusion des liaisons terminales de ces chaînes (Parkc et al., 1997).

L'attaque aléatoire de l' α-amylase sur l'amylose conduit à une dégradation rapide du substrat en maltose et en maltotriose, avec une absence de coloration iodique de l'amylase.

Alors que pour le cas de l'amylopectine, en plus du glucose, du maltose et du maltotriose il persiste des dextrines limites contenant des ramifications en α (1→ 6) (Parkc et al., 1997).

2.5. Les différentes sources de l’α-amylase

Les α-amylases peuvent avoir plusieurs sources : animale, végétale ou microbienne:

 L'origine animale

Les amylases d'origine animale sont généralement extraites à partir de la salive et du pancréas des mammifères (French, 1975). Les α-amylase animales sont incapables d'hydrolyser la liaison α (1→ 6) de l'amylopectine ou du glycosyl oligosaccharides, l'hydrolyse complète de l'amylose et de l'amylopectine par les α-amylases animales donne respectivement du maltose et du D-glucose pour l'amylose et du glucose, maltose et des dextrines limites pour l'amylopectine (Coolbear et al., 1992).

 L'origine végétale

Les α-amylases végétales possèdent une importance primordiale dans le métabolisme glucidique où elles participent à la conversion de l'amidon en le réduisant en sucres réducteurs qui sont la source énergétique nécessaire à la germination et elles sont généralement incapable d'hydrolyser le maltose (Octávio et al., 2000).

Ces enzymes végétales sont synthétisées par un mécanisme cellulaire compliqué (Fig.4), au cours de la germination des graines qui requiert une activité enzymatique très importante pour la mobilisation des réserves et le développement de l'embryon (Brawn et al., 1993).

F

Figure 4: B

Biosynthèse

23 de l’α-amy

ylase (Braw

wn et al., 19

L’α

993).

-amylase

L’α-amylase

24

 L'origine microbienne

 L' α-amylase fongique

La production industrielle d'enzymes à partir des microorganismes fongiques, parmi les genres Aspergillus et Penicillium, existe depuis longtemps du fait que la première production d' α-amylase a été réussie par Takamine en 1894. L'α-amylase fongique est d'une thermostabilité assez faible, son optimum d'action se situe entre 50°C et 55°C (Fogarty et al., 1994).

 L' α-amylase bactérienne

Ce type d'enzyme est obtenu principalement par fermentation de Bacillacées (Milner et al., 1997). Historiquement la première enzyme a été produite à partir de souches de Bacillus amyloliquefaciens, B. licheniformis (Bousseboua, 2002) ou B. subtilis fermentant en surface (Mctigue et al., 1995).

De nombreuses amylases aux propriétés industrielles ont été découvertes chez des bactéries acidophiles, alcalinophiles et thermophiles. Ces enzymes interviennent dans la transformation de l'amidon par fragmentation rapide en clivant les liaisons α (1→4) (Nadirman et al.2006).

2.6. Caractéristiques de l’α-amylase

Pour qu’une enzyme réponde aux exigences potentielles en vue d’une production industrielle, il est nécessaire de déterminer les propriétés de cette enzyme. Selon Sicard (1982), le poids moléculaire de la majorité des α –amylases apparaît être de l'ordre de 50.000 Dalton (Berry et Paterson, 1990). Chaque molécule contient un ion calcium , grâce au gel de filtration sephadex deux fractions peuvent être obtenues, le composant le plus rapide à un PM de 50.000 Dalton et le plus lent à un PM 100.000 Dalton (Mercier, 1982). Une autre étude, réalisée sur l' α-amylase d'origine bactérienne par la même méthode, montre que l'enzyme est un tétramère contenant du Zn⁺⁺ et possèdant une masse moléculaire d’environ 96.000 Dalton (Kim et al,1995).

Selon Bakri (2003), la température optimale des amylases fongiques varie selon leur origine et se situe entre 30 et 40°C avec une faible thermostabilité. Les amylases microbiennes, quant à elles, ont une forte thermostabilité (30°C–60°C) et leur température optimale peut être plus élevée, se situant entre 40°C et 70°C et (Park et al., 1997).

L’α-amylase

25

Tableau 5: Exemples de production de l'α-amylase par des microorganismes et leurs propriétés physico-chimiques

Microorganisme T°

OPT. OPT.^pH

P.M.

(DALTON)

PI Références

Bactéries

Bacillus sp 60 11-12 96.000 - Kim et al. ,(1995)

Bacillus Subtilis - - 59.000 - Brumm et al.,(1991)

Moisissures

Aspergillus awamori 50 4.8-5.0 54.000 4.2 Bhella et altosar (1985)

Aspergillus flavus 55 6.0 52.500 - Khoo et al., (1994)

Aspergillus fumigatus 40 5.5 65.000 - Plancho colona, (1995)

Aspergillus oryzae 50 4.5-5.0 59.000 - Kundu and Das (1970)

Penicillium expansum 60 4.5 64.000 - Doyle et al.,(1989)

Rhizopus sp 60-65 4.0-5.6 64.000 - Vayssier et al., (1990)

Levures Saccharomycopsis

cerevisiae

60 5.0 - - Olasupo et al., (1996)

L’α-amylase

26

Le pH optimal de l' α –amylase est pratiquement acide entre 4,8 – 6,5 (Larpent et al., 1992) . Cet intervalle varie selon l'origine de l’enzyme, les α –amylases fongiques ont des pH optimums faibles (4,0 – 5,0) (Tableau 5).

2.6.1. L'amidon, substrat naturel de l' α-amylase

L'amidon est une macromolécule glucidique présente chez de nombreux végétaux, notamment dans les organes de réserve comme le tubercule de pomme de terre et dans les graines (blé, maïs, riz, etc.) où il constitue une forme de stockage du glucose. Il s'agit d'un polyoside de structure moléculaire proche de celle du glycogène, forme de stockage du glucose rencontrée chez les animaux et certaines microorganismes (Nadirman et al., 2006).

Dans la molécule d'amidon comme dans celle de glycogène, des unités de glucose reliées par des liaisons osidiques alpha 1-4 formant des chaînes hélicoïdales d’amylose, sur lesquelles de courtes chaînes de même constitution se branchent par des liaisons osidiques alpha 1-6 (Mercier, 1982).

Dans l'amidon, les ramifications sont présentes environ tous les trente résidus glucose tandis que dans le glycogène, elles sont présentes environ tous les dix résidus. En présence d'iode, l'amidon se colore en bleu violet alors que le glycogène se colore en brun acajou (Berry et Paterson, 1990).

2.6.2. Effet des ions métalliques

Les amylases sont des métalloprotéines absolument dépendantes du Ca²⁺ qui est vraisemblablement un activateur allostérique (Egas et al., 1998). Le calcium ne participe pas directement à la formation de complexe enzyme-substrat mais il maintient l'enzyme dans une conformation optimale pour un maximum d'activité et de stabilité vis à vis de la dénaturation thermique (Savcheko et al., 2002 ;Peixoto-Nogueira et al., 2008) et de la dénaturation acide vis à vis de la protéolyse (Nigam et al.,1995, Mctigue et al., 1995).

L'activité enzymatique de l' α-amylase n'est pas modifiée par les ions K⁺, Na⁺, NH4⁺ mais elle est fortement inhibée par l’EDTA et les métaux lourds (Igarashi et al., 1998 ; Talamond et al., 2002 ).

L’α-amylase

27 2.7. Production de l’α-amylase

Traditionnellement, les enzymes microbiennes sont produites par culture en couche mince en surface sur un milieu liquide solide ou semi solide. Cette technique est encore utilisée pour quelques productions, en particulier celles d’enzymes d’origine fongique telles que les amylases et les protéases d’Aspergillus et de Mucor ou les pectinases de Penicillium. Mais les contrôles de température, d’aération, de pH et d’humidité présentent des difficultés (Bel´en et al., 2006).

La production d'enzymes à partir de micro-organismes se fait généralement en fermentation liquide ou submergée dans des fermenteurs agités, de tailles diverses, jusqu’à plus de 300 mètres cubes (Niehaus et al., 1999). Ce procédé de fabrication est aujourd'hui majoritairement utilisé par les principaux producteurs d'enzymes car il est particulièrement bien adapté à la fermentation des bactéries aérobies. Ces microorganismes permettent la production d'amylases, de protéases, de cellulases et d’autres enzymes bactériennes constituant une grande partie du marché des enzymes (Pascal et Thomas, 1990).

Appliquée aux micro-organismes fongiques, cette technique de fermentation liquide ou submergée présente certains inconvénients : le développement naturel sous forme mycélaire des micro-organismes fongiques provoque une augmentation de la viscosité, préjudiciable à la solubilisation de l'oxygène dans le milieu. Pour faire face à ce problème, une agitation mécanique est généralement mise en place mais à l'insu de la qualité du mycélium (Bel´en et al., 2006)

La fermentation du milieu liquide est beaucoup mieux adaptée aux microorganismes fongiques du genre Penicillium : (P. urticae, P. roseo-citreum, P. spiculosporum, P.

chlorophaeum, P. citreo-rodeum, P. purpurogenum, P. aurantio-griaeum,P. brunneo-rubrum) pour la production de l’α-amylase avec un rendement d’activité de 6 à 10 U/ml (Espine et al., 2009).

Le substrat de fermentation utilisé est principalement formé de déchets organiques comme la pulpe de betterave (Baldwin et al., 1986), de déchets d’oranges (Diomi et al., 2008, Mahmoud et al., 1998 et Hart et al.,1991) ou des produits céréaliers (Pascal et Thomas, 1990 ).

L’α-amylase

28 2.8. Immobilisation de l’α-amylase

L’une des voies importantes et prometteuses de la bio-ingénierie dans l’industrie agroalimentaire est l’emploi d’enzymes immobilisées (Shimizu et al., 1979).

L’immobilisation des enzymes est l'une des technologies la plus importante utilisée dans l'alimentation, la production pharmaceutiques et la biotechnologie. L’immobilisation d’une enzyme consiste en sa rétention dans une phase insoluble, par liaison chimique ou rétention physique (Siva et al., 2006).

Actuellement, de très nombreuses méthodes d’immobilisation intéressant plus de 100 enzymes ont été développées dans le but d'étendre le champ d’ applications industrielles de ces catalyseurs, pour leur utilisation en continu ou pour en assurant leur réutilisation et l'augmentation de leur stabilité, en facilitant le contrôle de l’action des enzymes (Tee et Kaletunç, 2009 ; Hernaiz et al., 2000).

L’intérêt d’utiliser des enzymes immobilisées dans des bioréacteurs tient essentiellement à leur récupération plus facile que celle des enzymes solubles, dans le cas d’un fonctionnement par cycles ou la possibilité de leur utilisation en continu. Toutefois, dans la plupart des procédés industriels et d’après Teotia et al., (2001) les enzymes sont mélangées dans une solution avec des substrats et ne peut être économiquement récupéré qu’après l'épuisement des substrats (Hamilton et al., 1999).

Cet usage unique est évidemment tout à fait inutile lorsque le coût des enzymes est considéré. Ainsi, il ya une incitation à utiliser des enzymes sous forme immobilisée ou insoluble, de sorte qu'’elles peuvent être conservées dans un réacteur biochimique pour catalyser d'autres flux ultérieurs. L'exploitation d'une enzyme immobilisée dans un procédé enzymatique en mode continu rend son utilisation plus favorable (Wu et al., 1998).

De nombreuses méthodes existent pour l'immobilisation des enzymes, parfois appelée insolubilisation d’enzyme (Wu et al., 1998). La majorité des méthodes peuvent être classées en quatre catégories principales: l’inclusion dans une matrice, la micro- encapsulation, l'adsorption et la liaison covalente. Parmi ces méthodes, l’inclusion dan un gel d’alginate de sodium est au cœur de cette expérience.

L’α-amylase

29

Tableau 6: Principales méthodes d’immobilisation d’enzymes (Tumturk et al., 2007)

Immobilisation par rétention

physique

Inclusion

-Dans une matrice constituée par le réseau tridimensionnel d’un gel ou d’un polymère.

Confinement

-Dans une microcapsule délimitée par une membrane semi-perméable (micro- encapsulation).

-Dans une fibre creuse.

Immobilisation par liaison

chimique

Fixation sur un support

-Par adsorption par des liaisons faibles (Inter actions ioniques)

-Par liaisons covalentes.

Réticulation

-Etablissement d’un réseau par liaisons cov intermoléculaires.

L’α-amylase

30

Outre la fuite des enzymes, l’inconvénient lié à la méthode de l'immobilisation est la résistance de transfert de masse des substrats, des produits et des inhibiteurs car le diamètre moyen d'un cordon de type de gel imprégné d’enzymes est beaucoup plus grand par rapport à la longueur de diffusion moyenne, le substrat ne peut pas diffuser en profondeur dans la matrice de gel comme dans tout autre catalyseur conventionnel non biologique immobilisé (Zaborsky et al., 1973). En même temps, la résistance diffusionnelle rencontrée par les molécules de produits peut parfois pousser le produit à s'accumuler près du centre du gel à un niveau élevé et indésirable, conduisant à une inhibition de certaines enzymes.

Ainsi, idéalement le réseau de réticulation doit être assez gros pour que le passage du substrat et des molécules de produits et la sortie du faisceau de gel soient aussi libres que possible (Raviyan et al., 2003). Pour cette raison, la rétention n'est pas appropriée pour les cas particuliers où le substrat a un poids moléculaire élevé, tel qu'il ne peut facilement se déplacer librement dans la matrice de gel (Yagar et al., 2008).

Contrairement aux méthodes d'adsorption et de liaison covalente, la plupart des réactions de polymérisation à l'origine de réticulation et de formation de gel dans les méthodes de rétention ne concerne pas directement la formation de liaisons entre les supports d'appui et les molécules d'enzymes (Yakup et al., 2006).Ces obligations changent la conformation de la protéine enzymatique et modifient les propriétés des enzymes (Martino et al., 1999) étant donné que les molécules d'enzymes ne participent pas à la réaction de polymérisation dans les méthodes de piégeage. Les techniques d’immobilisation peuvent être appliquées avec succès à un large éventail d'enzymes avec seulement des modifications mineures entre les différentes enzymes (Zaborsky et al., 1973 ; Ramkrisshna et al., 1993).

 Méthodes d’immobilisation

Les méthodes d’immobilisation sont nombreuses. Les principales sont résumées dans le (Tableau 6).

 Inclusion dans une matrice

L’enzyme est emprisonnée dans le réseau tridimensionnel d’un polymère insoluble, très souvent le polyacrylamide ou l’alginate.

 Inclusion dans l’alginate.

L’alginate est un polyoside formant une solution visqueuse en présence de cations

monovalents comme le sodium .En présence de cations divalents comme le calcium, il forme un gel.

L’α-amylase

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Ainsi l’immobilisation de l’ α-amylase a été aussi l’objet de recherche de plusieurs auteurs soit : Immobilisation par technique de réticulation ou « Cross linked polyacrylamide gel », « Covalent binding to the surface of sepharose gel », « beads activated by cyanogen bromide (CNBr) » et « Entrapment within calcium alginate beads ». (Sadhukhan et al.,1993);

(Bickerstaff, 1997) ;(Gargi ,2002); (Siva et al.,2006).

La préparation des billes d'alginate comporte le mélange des solutions d'alginate de sodium et l’α-amylase dans la suspension, suivie de l'égoutté dans la solution de chlorure de calcium pour former un gel (Sadhukhan et al., 1993). L’inclusion physique d'alginate de calcium à pH 5-6 et à une température de 20 à 60 °C a permis les conditions optimales d’α- amylase immobilisée (Dey et al., 2000 ; Saiyavit et al., 2002).

Les billes d’un diamètre de 2 mm ont produit la vitesse de réaction la plus rapide comparée à celles de 3, 4, et 5 mm (Dey et al., 2000).

Le processus physique d'inclusion exige que l'enzyme immobilisée doit être une molécule assez grande et maintenue à l'intérieur de la matrice de gel mais le substrat et le produit doivent être assez petits pour passer par les pores du gel (Galazzo et Bailey, 1990).

2.9. Les applications industrielles et biotechnologiques de l'α- amylase

Les α- amylases microbiennes sont parmi les enzymes les plus utilisées dans les procédés industriels:

 Utilisation des α- amylases dans les industries Agro-alimentaires

 Glucoserie

La principale industrie utilisatrice de l'α- amylase est la glucoserie qui, à partir d'un substrat complexe, l'amidon, développe un nombre important de transformations faisant appel aux enzymes, parmi lesquelles les α- amylases bactériennes ou fongiques qui sont utilisées pour la dégradation de l’amidon (Martin et al., 2003).