Annexe 2
Analyse chimique de la poudre de déchets d’oranges Détermination des cendres
La teneur en cendres est effectuée après calcination des déchets d’oranges à 550°C pendant 5 heures (Afnor ,1986). Le taux de cendre exprimé en pourcentage en masse est donné par la formule suivante :
(m 2 –m0) x 100 Cendres (%) = (m 1-m 0)
(m o) est la masse (g) du creuset vide ; (m 1) est la masse (g) du creuset contenant l’échantillon avant incinération et (m 2) est la masse (g) du creuset après incinération.
Détermination de la matière sèche
La matière sèche est déterminée par le séchage de 2g de l’échantillon pendant 3 heures dans une étuve à 105°C (Afnor ,1986).
Poids constant en % de masse est = 100
( m2-m0) x m1-m0
m 0 est la masse du creuset vide ; m 1 est la masse (g) du creuset contenant l’échantillon avant séchage ; m 2 est la masse (g) du creuset après séchage.
Annexes
Annexe 3
Dosage de l’activité α-amylasique Principe :
L'activité de l’ -amylase est mesurée selon la méthode de Bernfeld (1955), le principe de cette méthode repose sur le dosage des sucres réducteurs libérés lors de l’hydrolyse de l’amidon par l’ -amylase produit par la moisissure. Le milieu réactionnel contient 0.5ml d’amidon soluble (Prolabo) (1% w/v), 5ml de tampon phosphate 0.1M pH5 et 0.5 ml du filtrat dilué. Ce mélange est incubé à 40°C pendant 30 min. Les sucres réducteurs libérés hors de l’hydrolyse de l’amidon par l’ -amylase. La réaction est arrêtée par l’acide 3-5 dinitrosalycilique (DNSA) Miller, (1959) .Après refroidissement dans un bain de glace, 10ml d'eau distillée sont ajoutés et l'absorbance est déterminée à 540nm par rapport à une gamme d'étalon de 0 à 2mg/ml de maltose. L’unité de l’enzyme est exprimée par la quantité de maltose libérée en µ mole par minute par ml de milieu.
Composition du réactif de dosage au DNSA
Acide 3-5 dinitrosalycilique...10 g/l Tartrate double de sodium et potassium...300 g/l NaOH ...16 g/l
Dosage de sucres réducteurs
Les sucres réducteurs sont déterminés par la méthode de Dubois (Dubois et al. 1956).La réaction des sucres avec l’acide sulfurique provoque la formation des composés furfural. Ces produits se condensent avec le phénol pour donner des composés colorés leur concentration est déterminée à 488 nm (Spectrophotomètre : Perkin Elmer –Lambda EZ150) par rapport à un témoin et une gamme étalon à 100 µg/ml de glucose.
Annexes
Dosage des protéines
Principe :
Les protéines sont quantifiées par la méthode du Folin ciocalteu (Lowry et al 1951). L'addition successive à une solution protéique diluée d'un sel de cuivre en milieu alcalin et du réactif des phénols de folin ciocalteu donne une coloration bleue foncée. Celle-ci résulte de la réaction du cuivre sur les liaisons peptidiques.
Réactifs :
Solution A : 2% de NaOH (0.1N)
Solution B : 1% du CuSO4 dans l'eau distillée
Solution C : 2% tartrate double de sodium et potassium dans de l'eau distillée Solution M : 20ml de la solution A
1ml de la solution B 1ml de la solution C
Réactif de Folin : Solution de folin ciocalteu dilué à 1/10. 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 0 100 200 300 400 500 600
Figure :Courbe étalon pour le dosage de glucose
A b so rb an ce à 488n m glucose (µg/ml) y=0,0256x R²=0,987
Annexes
Dosage des sucres totaux
Principe :
L'acide sulfurique concentré provoque à chaud la déshydratation des oses avec la formation d'hydroxy-méthyl furfural (cas d'un hexose) et d'un furfural (cas d'un pentose).Ces composés se condensent avec le phénol pour donner des composés colorés dont l'intensité de la coloration est proportionnelle à la concentration en oses.
Réactifs :
Acide sulfurique concentré d = 1.84 ; Phénol 5%
Modeopératoire :
1ml de l'extrait enzymatique dilué est ajouté à 1ml de phénol 5% et 5ml d'acide sulfurique concentré. Après agitation, laisser reposer 10mn et le mélange est incubé au bain-marie à 30°C pendant 20 à 30mn. La concentration du sucre est déterminée à 488 nm par rapport à un témoin et une gamme étalon à 100 µg/ml de glucose.
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 0 100 200 300 400 500 600
Figure :Courbe étalon pour le dosage des protéines
A b so rb ance à 750 n m BSA (µg/ml) y=0,0016x R²=0,997
Annexes
Annexe 4
Gel characteristics OF DEAE Sepharose CL-6B
Type of ion exchanger: Weak anion.
Total ionic capacity: 0.13–0.17 mmole/ml gel.
Available capacity: Thymoglobulin (MW 669 000) 2 mg/ml. HAS (MW 68 000) 170 mg/ml.
Alpha-lactalbumin (MW 14 300) 150 mg/ml. Bead structure: 6% cross-linked agarose Bead size range: 45–165 are
Mean particle size: 90 are Max. Flow rate: 150 cm/h
Pressure: 0.015 Map (0.15 bars, 2 pHi) pH working range: 3–9
Chemical stability: All commonly used aqueous buffers, 1.0 M acetic acid, 1.0 M NaOH, 8 M Urea, 8 M guanidine hydrochloride, ethanol, methanol etc.
Physical stability: Negligible volume variation due to changes in pH or ionic strength.
Autoclavable: In 0.1 M NaCl at 121 ｰC for 30 min.
The available capacity was determined in a 0.5x5 cm column at a linear flow rate of 300 cm/h. Starting buffer used was 0.05 M Tris, pH 8.3. Elution buffer contained 2 M NaCl. The ranges given are estimates based on our knowledge and experience.
pH stability, long term refers to the pH interval where the gel is stable over a long period of time without adverse effects on its subsequent chromatographic performance.
A Préparat Annexe 5
tion des bill
les d’algina
ate
Nom : NOUADRI Prénom : Tahar
Université Mentouri – Constantine / Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie
Département de Biochimie et de Microbiologie
Thèse Présentée pour l’obtention du diplôme de Doctorat d’Etat Option: Biochimie /Biotechnologies Thème :L’α-amylase de Penicillium camemberti PL21: Production, Purification, Caractérisation et Immobilisation.
Directeur de thèse Professeur MERAIHI Zahia
Résumé : La production de l'-amylase par P. camemberti PL21 dans un milieu de fermentation à base de déchets d'oranges à 2 % , nécessite selon le plan statistique de Plackett et Burman : 10.0g/l d'amidon, 5.0 g/l d'extrait de levure, 20 ml/l de « Corn steep Liquor », 5 ml/l de Glycérol et 0.125g/l de CaCl2 à pH5 (Tampon phosphate, 0.1M) et une agitation à 100 rpm. La souche de P. camemberti PL21 produit à 22°C une meilleure croissance avec un taux de biomasse de 28.6 g/L et une activité -amylasique maximale de 350.2 U après 156 heures d’incubation en fermenteur de 2 litres. L’ α-amylase partiellement purifiée se présente sous une seule bande de native et SDS PAGE avec un poids moléculaire de 60.5 KDa à un pH optimal d’activité amylasique de 5, une température de 30°C. L’α-amylase de P. camemberti PL21 garde 60% de son activité à 50°C durant 120min à une Km et une Vmax respectivement de 0.93 mg/ml et de 30.5 U. Les ions Ca2+ et Mg2+ sont des activateurs pour cette enzyme, par contre les ions Cu2+, Fe2+ et Hg2+sont des inhibiteurs. L'immobilisation de l’α-amylase partiellement purifiée de P.camemberti PL21 est effectuée par inclusion sur un support naturel, les billes d’alginate de calcium (3%) elle est caractérisée par l’amidon soluble comme substrat avec un taux de rendement de 68 %. L'effet de la concentration initiale en enzyme et amidon sur la cinétique de la réaction et sur le rendement d'hydrolyse ont été étudiés aux conditions optimales de température à 30°C et un pH de 5.0. Les caractéristiques cinétiques sont modifiées par rapport à celles de l’enzyme libre (Km reste inchangé et une diminution de Vmax de 32 %). L’α-amylase immobilisée possède un pH de 5.5 et une température optimale de 50°C avec une stabilité thermique à 90°C pour une demi-vie de 120 minutes. L’α-amylase immobilisée conserve son activité plus longtemps et peut être réutilisée jusqu'à 5 fois. La stabilité au stockage à 4°C est de 10 jours, alors qu’à 30°C elle est de 3 jours.
Mots clés: α-amylase, Penicillium camemberti PL21, Déchets d’oranges, Fermentation, Purification, SDS-PAGE, Immobilisation, Billes d’alginate de calcium.
Devant le jury :
Président : BOUSSEBOUA Hacene Pr. Université Mentouri - Constantine Rapporteur : MERAIHI Zahia Pr. Université Mentouri - Constantine Examinateurs : HARZALLAH Daoud Pr. Université Ferhat Abas- Sétif
:SAKA Saad Pr. Université Badji Mokhtar - Annaba :BOULAAKOUD M. Salah Pr. Université Badji Mokhtar – Annaba